治疗与氧化应激有关的病症的试剂和方法

专利名称：治疗与氧化应激有关的病症的试剂和方法
技术领域：
本发明涉及与氧化应激有关的病症例如神经退行性病变(neurodegenerative disorders)的治疗方法。本发明还涉及在与氧化应激有关的病症的治疗中使用的新型化学个体，更具体地，涉及二(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)类似物和它们在神经退行性病变治疗中的应用。
背景技术：
自由基是相当活泼的会对生物系统造成明显破坏的化学物类。自由基与生物分子不加选择的反应会造成细胞和细胞组分(例如线粒体)的损坏，由此使细胞丧失其结构和/或功能以致影响生理过程。
在生物系统中，自由基通常被称作“活性氧类”(ROS)。ROS是由内源通过含氧物类的代谢生成的，或由毒素和大气污染物之类的外源生成的。
ROS对生物分子的侵袭被称作“氧化应激”。氧化应激已经被认为是许多与衰老有关的退化性疾病，例如帕金森氏症、阿尔茨海默氏症、运动神经元疾病(Motor Neuron Disease)的致病因素，也被认为是亨廷顿氏舞蹈病(Huntinton’s Chorea)、糖尿病和弗里德莱西氏共济失调症(Friedreich’s Ataxia)以及不特定的随年龄增长累积的损伤的致病因素。它还与中风和心脏病发作时以及在器官移植和手术过程中的发炎和缺血再灌注组织损伤(ischemic-reperfusion tissue injury)有关。
在ROS过量和/或抗氧化水平降低时产生氧化应激。因此，可以使用干扰ROS生成或清除ROS的试剂来治疗许多与神经退化有关的病症(神经退行性病变)，例如阿尔茨海默氏症和帕金森氏症。例如，维生素E之类的自由基清除剂(FRS)已经表现出可以减少神经退化并延长患有运动神经元疾病的转基因鼠的寿命。
在整篇说明书中，可以引用文献以描述本发明各个方面。然而，我们并没有承认本说明书引用的任何参考文献构成现有技术。具体而言，应该理解的是，本文对任何文献的引用并不是承认这些文献中的任何一篇在澳大利亚或任何其它国家构成该领域常识的一部分。对这些参考文献的论述指出了其作者主张的内容，本申请人保留对本文引用的任何文献的正确性和相关性提出质询的权利。
发明概述本发明源于发明人对一类新型抗氧化化合物的发现。这些化合物可用于需要预防或降低ROS的生成的应用领域。这些应用领域包括对动物或植物进行治疗以预防或治疗由氧化应激引起的病症。对人类和其他动物的神经退行性病变的治疗是这些化合物一种此类应用的示例。此外，ROS介导的细胞损坏与衰老有关，因此，本发明的化合物的抗氧化性可以用作化妆品中的抗老化剂。另外，还存在其它需要防止底物氧化的工业领域(例如化学工业)，因此本发明的抗氧化剂可用于与这些工业相关的应用。
因此，本发明提供了一种防止或降低氧化应激对底物的影响的方法，该方法包括用化学式为(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理该底物的步骤 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基(单-、双-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一个或多个选自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖类部分(sugarmoiety)的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5选自-H、-烷基、-芳基；和
R4和R6独立地选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
优选地，R5的化学式如下 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；和R4选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
本发明还提供了一种预防或降低氧化应激对生物系统的影响的方法，该方法包括用化学式为(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理该生物系统的步骤 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基(单-、双-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一个或多个选自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖类部分的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5选自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6独立地选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
优选地，R5的化学式如下 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；和R4选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
本发明的方法可用于治疗人类或动物与氧化应激有关的病症或病况。对于特定的形式，该方法可用于预防或治疗神经退行性病变。任选地，神经退行性病变的治疗可以包括与另一种治疗神经退行性病变用的试剂(例如，利鲁唑(Riluzole)、反义DNA(antisense DNA)或其类似物(例如肽核酸)、神经营养因子(例如白血病抑制因子)、神经营养素(NGF、BDNF、NT-3、NT4/5)、神经胶质源性神经营养因子(GDNF)、硫辛酸或烟碱衍生物)协同施用本发明的抗氧化化合物。
化学式为(I)的抗氧化化合物也可以用于制备治疗与氧化应激有关的病状用的药剂。
对驱动与缺血、损伤和神经退行性病变有关的神经退化过程的确切触发物和一连串分子变化(molecular cascades)的了解极少。然而，本发明提出，许多神经系统失调是由Ca2+体内平衡的调节障碍和氧化应激途径引发的。因此，本发明还提供了与钙毒性和氧化应激有关的病状的治疗方法，该方法包括施用治疗有效量的自由基清除剂和钙缓冲剂的步骤。
优选地，与钙毒性和氧化应激有关的病状是一种神经退行性病变，例如中风、癫痫、帕金森氏症、亨廷顿氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化、衰老、缺血和阿尔茨海默氏症。
该方法可以包括施用作为自由基清除剂的第一试剂和作为钙缓冲剂的第二试剂。合适的自由基清除剂包括硫辛酸、2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-酚、苯并二氢吡喃-4-酮、trolox(维生素E类似物)、丁基羟甲苯(BHT)和维生素E。合适的钙缓冲剂包括15-冠-5、18-冠-6、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二醇四乙酸(EGTA)、环己烷-1，2-二胺四乙酸(CDTA)和二(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)的衍生物。然而，该方法优选包括施用一种既是自由基清除剂又是钙缓冲剂的单种试剂。最优选地，该单种试剂是化学式为(I)的化合物。
本发明的发明人已经制备出化学式为(I)的二(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)的衍生物，这些衍生物已经显示出可以作为自由基清除剂和钙缓冲剂。因此，本发明还提供了化学式为(II)的化合物或其药学上可接受的盐 其中R1和R2都独立地选自一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R1和R2独立地是每个芳环上的四、三、二或单取代基。
R3和R4都独立地选自-H、-烷基、-CH2OH、-芳基、糖类部分、-聚烯氧基、水增溶基团、抗氧化剂；R5和R6独立地选自-O-烷基、-O-芳基、-S-烷基和-氨基；R7是-H(在每个N原子上)、-烷基、芳基、-(CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-(n＝1-5)；R8和R9都独立地选自-H、-烷基、-COOH、-COO烷基。
化学式为(II)的化合物也可以是金属盐的形式，例如碱金属(Na+)和碱土金属(Ca2+)配合物。
本发明的发明人发现化学式为(II)的化合物也具有抗氧化性。因此，本发明还提供了一种预防或降低氧化应激对底物的影响的方法，该方法包括用化学式为(II)的化合物或其药学上可接受的盐处理底物步骤。
化学式为(I)或(II)的化合物可以通过清除自由基来预防或降低氧化应激对底物的影响。因此，本发明还提供了一种清除自由基用的配方物，该配方物含有有效量的化学式为(I)或(II)的化合物。
本发明还提供了含有化学式为(II)的化合物和一种药学上可接受的赋形剂的药物组合物。该药物组合物可用于治疗神经退行性病变。
本发明还提供了制备化学式为(II)的化合物的方法和/或制备含有化学式为(II)的化合物的组合物的方法。
发明综述整篇说明书中使用的各种术语的涵义是本领域普通技术人员公知的。然而，为了便于查阅，现在对其中一些术语进行定义。
整篇说明书中使用的术语“底物”是指生物系统(例如细胞、皮肤)或化学底物(例如易氧化的化学物质)。
整篇说明书中使用的术语“生物系统”是指任何细胞或多细胞系统，并包括单独的细胞至整个生物体。例如，生物系统可以是受氧化应激影响的动物或人类对象的组织、或受氧化应激影响的整个动物或人类对象。
整篇说明书中使用的术语“神经退行性病变”是指以神经元细胞的过早死亡或功能丧失为特征的病变。退化过程引起的神经元细胞死亡或功能丧失是人类许多神经系统失调的主要病理特征。神经元细胞死亡的产生可以是包括外伤、缺血、癫痫、神经退行性病变(例如，帕金森氏症、亨廷顿氏症、阿尔茨海默氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症(ALS)、多发性硬化、中风、或外伤)在内的各种病况引发的后果，也可以是组织生长和维持的正常组成部分。一些遗传病症产生后期发作的神经元缺失，其中每种对于具体的神经元细胞类型都具有高度特异性。
整篇说明书中使用的术语“烷基”是指优选含有一至二十个碳原子，更优选含有一至是个碳原子的支链或直链无环单价饱和烃基。
整篇说明书中使用的术语“烷氧基”是指基团“烷基-O-”。优选的烷氧基包括，例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基、正丁氧基、叔丁氧基、仲丁氧基、正戊氧基、正己氧基、1，2-二甲基丁氧基，及类似物。
整篇说明书中使用的术语“烯基”是指含有至少一个碳-碳双键的不饱和烃基，并包括直链、直链和环状基团。
整篇说明书中使用的术语“氨基”是指任选被一个、两个或三个取代基取代的氮。
整篇说明书中使用的术语“芳基”是指含有一个单环(例如苯基)或两个稠环(例如萘基)的芳族单价碳环基团，其任选在芳环上的一个或多个位置被取代。
整篇说明书中使用的术语“杂芳基”是指在环中含有至少一个杂原子(例如氮、氧或硫)的芳族单价单环或多环基团，其中该芳环任选在芳环上的一个或多个位置被取代。
整篇说明书中使用的术语“酰基”是指基团烷基-C(O)-、取代烷基-C(O)-、环烷基-C(O)-、取代环烷基-C(O)-、芳基-C(O)-、杂芳基-C(O)-和杂环-C(O)-。
整篇说明书中使用的术语“卤”或“卤素”是指氟基、氯基、溴基或碘基。
整篇说明书中使用的术语“聚烯氧基”是指含有一个或多个重复-(烷基-O)-基团的聚烷基醚基团，其中烷基优选含有2或3个碳原子。
整篇说明书中使用的术语“糖类部分”是指直链或环状糖类，尤其是戊糖或己糖，例如葡萄糖、果糖、甘露糖和半乳糖或它们的衍生物。
整篇说明书中使用的术语“药学上可接受的盐”是指化学式为(I)和(II)的化合物的药学上可接受的盐，这些盐衍生自本领域中公知的各种有机和无机抗衡离子，并包括，仅仅作为例子，钠、钾、钙、镁、铵、四烷基铵及类似物；而且当该分子含有碱性官能时，有机或无机酸的盐例如盐酸盐、氢溴酸盐、酒石酸盐、甲磺酸盐、乙酸盐、马来酸盐、草酸盐及类似物可用作药学上可接受的盐。
如果需要，可以通过任何合适的分离或提纯方法例如过滤、萃取、结晶、柱色谱法、薄层色谱法、厚层(制备)色谱法、蒸馏或结合使用这些方法来实现本文所述的化合物和中间体的离析和提纯。参考下文的实施例可以得到对合适的分离和离析方法的具体阐释。另外，也可以使用其它效果相当的分离或离析方法。
合成符合化学式(I)或(II)的1，2-二(2-氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)的衍生物，并发现其具有自由基清除性能。这些衍生物可以用作BAPTA生理活性酸或盐的前体药物。不受关于化学式为(I)或(II)的化合物作用模式的具体理论的束缚，本发明的发明人假设这些化合物用作BAPTA可渗透细胞膜的共价共轭物。当受到细胞内酶的作用时，共轭物中的一个或多个的共价键断裂，从而释放出活性物类，其被认为是BAPTA或其盐。
尽发明人所知，先前还没有研究或确认化学式为(I)或(II)的化合物的自由基清除性能。因此，这些化合物是一种可用于治疗与氧化应激有关的神经和其它病症的新型的自由基清除或抗氧化化合物。
已经发现大量医学病况与氧化应激有关。氧化应激很可能在与衰老过程伴生的慢性、退化性病症或病况中起着尤为重要的作用。这些病症包括神经退行性病变(例如阿尔茨海默氏、帕金森氏、亨廷顿氏等等)、肿瘤性疾病、中枢神经系统失调、血管病、糖尿病并发症、衰老和缺血组织损伤之类的病况。
运动神经元中自由基清除酶Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD)的遗传或翻译后变异干扰其功能并导致运动神经元易于受到自由基的侵袭。自由基清除剂例如维生素E的此前已经表现出能够降低神经退化并延长患有神经元疾病的转基因鼠的寿命。因此，化学式为(I)或(II)的自由基清除化合物可用于治疗神经系统失调和神经系统外伤。
如前所述，本发明提供了一种预防或降低氧化应激对底物的影响的方法，该方法包括用化学式为(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理底物的步骤
其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基(单-、双-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一个或多个选自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖类部分的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5选自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6独立地选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
本发明还提供了一种预防或降低氧化应激对生物系统的影响的方法，该方法包括用化学式为(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理生物系统的步骤 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基(单-、双-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一个或多个选自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖类部分的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5选自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6独立地选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
对这两种方法而言，在化学式为(I)的化合物中，R2优选为-CH2CH2O-R5，R3优选为-CH2C(O)R6，R4和R6优选为-O-甲基、-O-乙基、-O-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3或-OC(O)CH3中的一个或多个。
或者或此外，对这两种方法而言，R5优选具有如下化学式 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；和R4选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
已经合成出表1所示的化学式为(I)和(II)的化合物，而且它们都表现出具有使用本文所述方法评估的抗氧化性能。
表1
在本发明的另一具体实施方案中，化学式为(I)的化合物具有如下化学式 其中R1和R2独立地选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN；和R3选自-OH、-O烷基、-O芳基、-S烷基、氨基、糖类部分、-聚烯氧基、和水增溶基团。
此外，在本发明的方法中也可以使用化学式为(II)的化合物或其药学上可接受的盐。
其中R1和R2都独立地选自一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R1和R2独立地是每个芳环上的四、三、二或单取代基。
R3和R4都独立地选自-H、-烷基、-CH2OH、-芳基、糖类部分、-聚烯氧基、水增溶基团、抗氧化剂；R5和R6独立地选自-O-烷基、-O-芳基、-S-烷基和-氨基；R7是-H(在每个N原子上)、-烷基、芳基、-(CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-(n＝1-5)；R8和R9都独立地选自-H、-烷基、-COOH、-COO烷基。
在某些情况下，优选增加本发明的化合物的水溶性。对于水溶应用，优选至少一个R基团(例如化学式为(I)的化合物中的R4或化学式为(II)的化合物中的R3/R4)包括水增溶基团，例如磺酸根、硫酸根、羧酸根、羟基、氨基、铵、糖、直链或环状糖类、抗坏血酸根、被-OH在任何位置取代的烷基链、乙二醇(包括聚乙二醇)、聚醚、硼化物及类似物，以提高控制剂的溶解性或迁移性。
测量试验化合物对溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯基四唑鎓(MTT)的还原，使用该方法测定该特定化合物清除自由基的能力。
或者，或此外，在存在测试化合物的情况下用过氧化氢氧化亚油酸，在此过程中测量测试化合物的效力，以此测定该特定化合物清除自由基的能力。结果表明化学式为(I)和(II)的化合物作为有效的抗氧化剂具有与维生素E(已知的抗氧化剂)相同的效力。在该测定中加入各种浓度的钙离子时，获得相似的结果。
除了所述的BAPTA类似物的自由基清除活性外，这些化合物还可以充当钙缓冲剂。因此，这些类似物具有双重作用它们既可以清除自由基，也可以缓冲钙。
除氧化应激途径外，还有大量证据表明兴奋毒性(excitotoxic)途径也会导致神经退化。神经元和突触活性的功能很强地依赖于钙离子。过度刺激离子移变受体的过量谷氨酸触发兴奋毒性，生成过量Ca2+。超载的钙激活了导致神经元死亡的蛋白酶和核酸酶。内源的Ca2+缓冲蛋白质无法应对病理性的细胞内Ca2+负载，由此导致神经元特别容易受到钙毒性侵袭。多种病症，例如与缺血有关的病症、损伤和神经退行性病变，都是由Ca2+体内平衡的调节障碍引发的。
此外，来自啮齿类动物的证据表明，神经元钙体内平衡的改变一般与大脑的老化同时产生，而且可能与认知功能随年龄的衰退有关。实验证据表明，在老化的神经元中，改变了的钙体内平衡可能是某些由老化引起的记忆缺陷的影响因素。按照本发明，可以对动物或人类施用治疗有效量的自由基清除剂和钙缓冲剂以治疗与钙毒性和氧化应激有关的病状。为此，可以使用任何合适的给药规程，施用化学式为(I)或(II)的化合物。
化学式为(I)或(II)的化合物(或其药学上可接受的盐)可以与药学上可接受的赋形剂、载体、稀释剂、渗透增强剂、增溶剂和佐剂一起制成药物组合物。合适的药学上可接受的赋形剂包括能够与化学式为(I)或(II)的化合物共同施用以利于发挥其预期功能的溶媒或载体。这种介质在药学上活性物质中的应用是本领域已知的。
合适的赋形剂的部分例子包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯树胶、磷酸钙、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、PEG、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、无菌盐水、糖浆和甲基纤维素。配方物还可以含有润滑剂例如滑石、硬脂酸镁和矿物油；润湿剂；乳化和悬浮剂；防腐剂例如苯甲酸甲酯和苯甲酸丙基羟酯；甜味剂；和调味剂。这些组合物可以配制成在病人服药后提供活性成份的快速、持续或延迟释放。
一种或一种以上化学式为(I)或(II)的化合物可以单独施用或者与其它治疗剂(例如，治疗神经退行性病变用的其它试剂)、载体、佐剂、渗透增强剂及类似物一起施用。可以使用如‘Remington’sPharmaceutical Sciences’，Mace Publishing Co.，Philadelphia，Pa.第17版(1985)和‘Modern Pharmaceutics’，Marcel Dekker，Inc.第3版(G.S.Banker & C.T.Rhodes，Eds.)中描述的那些传统技术配制这些组合物。可以使用配制化学领域的技术人员已知的标准程序制备化学式为(I)的化合物的药学上可接受的盐。
化学式为(I)或(II)的化合物可以通过治疗剂的任何公认的给药形式进行给药，例如通过口服、肠胃外给药、通过吸入喷雾、吸附、吸收、局部给药、直肠给药、经鼻子给药、颊内给药、阴道给药、心室内给药、通过含传统无毒药学上可接受的载体的药剂的植入储药，或通过任何其它方便的剂型进行给药。最合适的途径取决于被治疗病况的性质和严重程度。本文所用的术语肠胃外包括皮下、静脉内、肌肉内、腹膜内、鞘内、心室内、膜内和颅内注射或输液方法。对于肠胃外给药，该组合物可以是无菌注射溶液和无菌套装粉剂的形式。
口服给药时，该组合物通常使用本领域已知的传统设备和技术配制成单位剂型如药片、扁胶剂、粉剂、粒剂、珠状、咀嚼锭剂、胶囊、液体、水悬浮液或溶液，或类似的剂型。这些配方物中典型地包括固体、半固体或液体载体。示例性载体包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、阿拉伯树胶、磷酸钙、矿物油、可可脂、可可油、藻酸盐、黄蓍胶、明胶、糖浆、甲基纤维素、聚氧乙烯失水山梨糖醇单月桂酸酯、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁及类似物。
这些组合物优选以物理上分离的单位配制成单位剂型，该单位剂型是适合作为人类对象和其它哺乳动物使用的单位剂量，每个单位含有预定量的活性物质以产生所需的治疗效果，还含有合适的药学上可接受的赋形剂。
以治疗有效量施用化学式为(I)或(II)的化合物或它们的药学上可接受的盐。医师根据相关情况，包括被治疗的病况、所选给药途径、实际施用的化合物及其相应的活性、每个患者的年龄、体重和反应、患者症状的严重程度以及类似情况，确定实际施用的化合物量。
化学式为(I)或(II)的化合物可以以1至50毫克/千克的剂量进行施用。每星期通过腹腔施用1、10、100和1000毫克/千克的剂量。还设想可以口服含化学式为(I)或(II)的化合物的配方物。
化学式为(I)或(II)的抗氧化化合物可以用作抗老化剂，因此含有一种或一种以上这些化合物的组合物可用于化妆或局部涂敷。在局部施用时，这些组合物可以是含例如多达5wt％活性化合物的乳状液、霜、胶、溶液、软膏的形式。
除了用化学式为(I)或(II)的化合物进行治疗，本发明的方法还包括施用作为自由基清除剂的第一试剂和作为钙缓冲剂的第二试剂。合适的自由基清除剂包括类胡萝卜素、类柠檬素(limonoids)、植物甾醇类、类黄酮、花色素、儿茶素、异黄酮、寡聚原花色素(oligomericproanthocyanidin)、异硫氰酸盐、双硫醇硫酮(dithiolthione)、萝卜硫素(sulforaphane)、类异戊二烯、生育三烯酚、生育酚(例如维生素E)、硫辛酸、辅酶Q、抗坏血酸盐(例如维生素C)、2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-酚、苯并二氢吡喃-4-酮、C60和trolox。合适的钙缓冲剂包括15-冠-5、18-冠-6、EDTA和BAPTA的衍生物。
附图简要说明

图1是在存在本发明的抗氧化剂的条件下进行的亚油酸氧化在234nm处的时间和吸收率关系图。图中所用的“MJM羧酸”是指化合物(4)，而“MJM酯”是指化合物(3)。
图2是暴露在百草枯(paraquat)中由氧化应激引起的新生鼠成纤维细胞的细胞死亡图。用刚制备的百草枯或过亚硝酸盐处理细胞(5×103/孔)过夜。检定孔中培养基的乳酸脱氢酶(LDH)的释放，并作为细胞毒性的标记。高剂量的百草枯而非过亚硝酸盐引起明显的细胞死亡。数值表示三个相同孔的平均值±SEMs，与未处理的细胞差异*P＜0.05。X轴代表百草枯和过亚硝酸盐的浓度，单位为μM。
图3表示(S)-5-fluorowillardiine(“(S)-5-FW”)对NSC-34D运动神经元细胞系的存活(MTT还原)产生的影响。这些细胞以1×104细胞/孔在含有1％(v/v)FCS的DMEM/F-12中培养48小时，然后用各种浓度的(S)-5-FW处理72小时。在培养基中加入MTT溶液(0.5毫克/毫升)2小时，将细胞增溶，确定MTT还原量，表示为处理后细胞的百分比。使用单向ANOVA(*P＜0.05，***P＜0.001)确定与对照物(不含(S)-5-FW)在统计学上的明显差别。可以看出，(S)-5-FW以受浓度控制的方式引起明显的细胞死亡，其在1000μM[(S)-5-FW]浓度时作用最大。
图4表示用化合物(3)共处理的SODI693A转基因鼠的体重。在溶媒(vehicle)(A)组中，出生后116天时观察到与肌肉萎缩有关的统计学上明显的体重降低(星号)。在其余组别，即LIF+(3)(B)、PNAG3+(3)(C)和LIF+PNAG3+(3)(D)中，这一现象延迟到出生后130天。每组有10只老鼠(5只雄鼠，5只雌鼠)，平均值+SEM*P＜0.05。
图5是在溶媒(VEH)、LIF+化合物(3)、PNAG3+化合物(3)和LIF+PNAG3+化合物(3)组中(n＝10个/组)的SODI693A转基因鼠的运动表现和存活情况图。直方图‘A表明LIF+化合物(3)、PNAG3+化合物(3)和LIF+PNAG3+化合物(3)组与溶媒组的明显差别。在这三组之间没有明显差别。在bar grab测试(B)中，也观察到这三个处理过的组有相似的明显改进。处理过的老鼠的Kaplan-Meier存活曲线也表明，与溶媒组(C)相比，LIF+化合物(3)、PNAG3+化合物(3)和LIF+PNAG3+化合物(3)组中寿命有明显提高。
本发明优选实施方案的描述现在提供具体实施本发明的上述一般原理的实施例。但是，需要理解的是，下列描述并不限制上述说明的普遍性。
化学式为(I)或(II)的化合物的合成实施例1二[2-(二-乙氧基羰基甲基)氨基苯氧基]乙烷(“化合物(3)”)和二(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(BAPTA)(“化合物(4)”)使用文献方法(参看Tsien，R.Y.，J.Am.Chem.Soc.，1980，19，2396-2404和Grynkiewicz，G.；Poenie，M.和Tsien，R.Y.，J.Biol.Chem.，1985，260(6)，3440-3460)制备二[2-(二-乙氧基羰基甲基)氨基苯氧基]乙烷(3)和二(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸(4)。
实施例2N，N-二(乙酸)邻甲氧基苯胺(6) N，N-二(乙氧基羰基甲基)邻甲氧基苯胺(5)的合成将0.92毫升(8.12毫摩尔)的邻甲氧基苯胺与1.2当量的Proton Sponge(2.09克)、0.14当量的碘化钾(189毫克)和2.4当量的溴化乙酸乙酯(2.16毫升)在无水乙腈中混合，并回流过夜。将反应混合物用甲苯稀释并过滤，并将滤出物用2M HCl(×2)和H2O洗涤，经硫酸钠干燥，过滤并减压去除溶剂。通过柱色谱法(30％EtOAc/己烷)将粗制品提纯，得到1.10克(3.69毫摩尔)黄色油(5)(45％产率)。1H NMRδ(300MHz，CDCl3)6.88，m，4H，Ar-H；4.18，q，4H，J7.17Hz，-O-CH2-CH3；4.13，s，4H，N-CH2-；3.80，s，3H，-O-CH3；1.25，t，6H，J7.17Hz，-O-CH2-CH3。13C NMRδ(75MHz，CDCl3)171.2，C＝O；151.2，C1；138.6，C2；122.2/120.8/119.0/111.9，C3/C4/C5/C6；60.6，-O-CH2-CH3；55.5，-O-CH3；54.0，N-CH2-；14.3，-O-CH2-CH3。MS(ESI，+ve)m/z 296.1[M+H]+，318.1[M+Na]+，613.3[2M+Na]+。
N，N-二(乙酸)邻甲氧基苯胺(6)在空气中，将200毫克(0.677毫摩尔)(5)溶于最少量的温乙醇(7毫升)中，并用2.1当量的浓氢氧化钾(80毫克)水溶液进行处理。温和地加热15分钟，减压去除乙醇并将残余物再溶于H2O(20毫升)并在冰浴中冷却。缓慢加入浓HCl至pH2。加入HCl时没有形成沉淀，因此将产物萃取到EtOAc中，并减压去除溶剂。粗制品从EtOAc/己烷(×2)中重结晶，得到40毫克(0.207毫摩尔)浅褐色固体(6)(31％产率)。1H NMRδ(300MHz，CDCl3/DMSO)6.77，m，4H，Ar-H；3.90，s，4H，N-CH2-；3.68，s，3H，-O-CH3。13C NMRδ(75MHz，CDCl3/DMSO)173.5，C＝O；151.5，C1；138.0，C2；122.9/120.7/119.7/111.7，C3/C4/C5/C6；55.5，-N-CH2-；55.3，-O-CH3。MS(ESI，+ve)m/z 240.1[M+H]+，262.1[M+Na]+。
实施例34-氨基-1，2-二甲氧苯-N，N-二乙酰乙酯(10)和4-氨基-1，2-二甲氧苯-N，N-二乙酸(11)的合成4-硝基-1，2-二甲氧苯(8)的合成 在邻二甲氧基苯(7)(2.5毫升，19.6毫摩尔)和二氯甲烷(50毫升)的溶液中加入浓硝酸(2毫升)，并将其在室温下搅拌24小时。然后用水(3×50毫升)清洗有机层，经硫酸钠干燥，过滤并减压去除溶剂。将离析出的产物放置固化，得到3.5克黄色固体(8)(0.02摩尔，98％产率)。
熔点90-94℃(文献熔点97-98℃)29。
1H n.m.r(300MHz，CDCl3)δ7.92(dd，1H，J8.9Hz，J2.6Hz，Ar-H)；7.75(d，1H，J2.6Hz，Ar-H)；6.91(d，1H，J8.9Hz，Ar-H)；3.98(s，3H，[C2]-OCH3)；3.97(s，3H，[C1]-OCH3)。13C n.m.r(75MHz，CDCl3)δ153.6，(C4)；147.9，(C2)；140.6，(C1)；116.8，(C5)；108.9，(C6)；105.5，(C3)；55.5，([C2]-OCH3)；55.3，([C1]-OCH3)。IR(Nujol)1568，m；1500，m；1500，s；1345，s；1280，s；804，m。质谱(ESI，+ve)m/z 183.8[M]+。
4-氨基-1，2-二甲氧苯(9)的合成 将4-硝基-1，2-二甲氧苯(8)(1.03克，5.62毫摩尔)溶于95％(v/v)乙醇(60毫升)并在炭载钯(0.11克)上用水合肼(30毫升)氢化。将该反应回流24小时。将热溶液滤过C盐，并减压去除溶剂。加入水，并将产物萃取到二氯甲烷中，经硫酸钠干燥，过滤并减压去除溶剂，得到粘性液体，然后将其置于冰上，得到0.80克白色粉末(9)(5.22毫摩尔，93％产率)。
熔点82-85℃(文献熔点83-87℃)30。分解温度205℃。1H n.m.r(300MHz，CDCl3)δ6.66(d，1H，J8.4Hz，Ar-H)；6.26(d，1H，J2.6Hz，Ar-H)；6.18(dd，1H，J8.4Hz，2.6Hz，Ar-H)；3.77(s，3H，[C1]-OCH3)，3.76(s，3H，[C2]-OCH3)，3.38(br s，2H，NH2)。13C n.m.r(75MHz，CDCl3)δ148.9，(C1)；141.1，(C2)；139.8(C4)；112.3(C6)；105.5(C5)；99.8，(C3)；55.7([C1]-OCH3)；54.7([C2]-OCH3)。IR(Nujol)3380，br s；1596，m；1514，s；11463，s；1236，s；849，m。质谱(ESI，+ve)m/z 153.8[M]+。
4-氨基-1，2-二甲氧苯-N，N-二乙酰乙酯(10)的合成
在氮气氛下，将4-氨基-1，2-二甲氧苯(9)(0.15克，0.95毫摩尔)、碘化钾(0.32克)和溴化乙酸乙酯(0.5毫升)的混合物在无水乙腈(5毫升)中回流48小时。然后将溶液冷却，用甲苯(5毫升)稀释并过滤。用2M盐酸(2×20毫升)和水(2×20毫升)清洗收集到的滤液，经硫酸钠干燥，过滤并减压去除溶剂，得到0.14克棕色油(10)(0.43毫摩尔，45％产率)。
1H n.m.r(300MHz，CDCl3)δ6.74(d，1H，J8.7Hz，Ar-H)；6.34(d，1H，J2.8Hz，Ar-H)；6.20(dd，1H，J8.7Hz，2.8Hz，Ar-H)；4.21(q，4H，J7.1Hz，-O-CH2-CH3)；4.12(s，4H，-N-CH2-)；3.81(s，3H，[C1]-O-CH3)，3.77(s，3H，[C2]-O-CH3)，1.25(t，6H，J 7.1Hz，-O-CH2-CH3)。13C n.m.r(75MHz，CDCl3)δ169.9，(C＝O)；148.8，(C1)；141.7，(C2)；141.6，(C4)；112.0，(C6)；104.4，(C5)；98.7，(C3)；60.2，(-O-CH2-CH3)；55.6，([C1]-OCH3)；54.9，([C2]-OCH3)；53.5，(-N-CH2-)；13.3，(-O-CH2-CH3)。IR(Nujol)2978，m；2853，w；1744，s；1520，s；1189，s。质谱(ESI，+ve)m/z 326.3[M]+；348.3[M+Na]+。
4-氨基-1，2-二甲氧苯-N，N-二乙酸(11)的合成 通过溶于温乙醇(10毫升)并加入氢氧化钾的稀释水溶液(0.2克/20毫升)(5毫升)，由此将酯化合物(10)皂化成其各自的钾盐。将该溶液温热5分钟并减压去除乙醇。搅拌同时逐滴加入6M盐酸，由此获得羧酸。将该产物萃取到乙酸乙酯(20毫升)中，并减压去除溶剂，得到30.2毫克暗红/棕色固体(11)(0.11毫摩尔，24％)。
1H n.m.r(300MHz，d6-DMSO)δ6.79(d，1H，J8.8Hz，Ar-H)；6.21(d，1H，J2.9Hz，Ar-H)；6.01(dd，1H，J8.8Hz，3.0Hz，Ar-H)；4.07(s，4H，-N-CH2-)；3.70(s，3H，[C1]-OCH3)，3.62(s，3H，[C2]-OCH3)。13C n.m.r(75MHz，d6-DMSO)δ172.1，(C＝O)；149.1，(C2)；142.5，(C1)；140.5，(C4)；113.8，(C6)；102.8，(C5)；97.9，(C3)；56.0，([C1]-OCH3)；54.9，([C2]-OCH3)；52.9，(-N-CH2-)。
4-氨基[N，N-二乙酰乙酯]苯并-18-冠-6(15)和4-氨基[N，N-二乙酸]苯并-18-冠-6(16)的合成4-硝基苯并-18-冠-6(13)的合成 在搅拌中的苯并-18-冠-6(12)(0.25克，0.81毫摩尔)的二氯甲烷(15毫升)溶液中，加入浓硝酸(0.25毫升)。将该溶液在室温下搅拌24小时。用水(3×30毫升)清洗有机层，经硫酸钠干燥，过滤并减压去除溶剂。将离析出的油状产物放置固化，得到0.28克黄色结晶固体(13)(0.78毫摩尔，96％产率)。粗制品的1H n.m.r表明产物和二氯甲烷的存在情况。再将该产物干燥24小时，然后用于随后的反应。
熔点82-83℃(文献熔点80-81℃)31。分解温度312℃。
1H n.m.r(300MHz，CDCl3)δ7.88(dd，1H，J8.9Hz，2.6Hz，Ar-H)；7.74(d，1H，J2.6Hz，Ar-H)；6.89(d，1H，J8.9Hz，Ar-H)；4.24(m，4H，OCH2)；3.95(m，4H，OCH2)；3.77(m，4H，OCH2)；3.72(m，4H，OCH2)；3.68(s，4H，OCH2)。13C n.m.r(75MHz，CDCl3)δ154.3，(C4)；148.4，(C2)；141.3，(C1)；117.9，(C5)；111.2，(C6)；108.1，(C3)；70.99，(OCH2)；70.98，(OCH2)；70.8，(OCH2)；70.7，(OCH2)；70.60，(OCH2)；70.57，(OCH2)；69.23，(OCH2)；69.17，(OCH2)；69.1，(OCH2)。IR(Nujol)1587，m；1520，s；1464，s；1338，s；1276，s；1128，s，864，w。质谱(ESI，+ve)m/z 358.1[M]+；381.1[M+Na]+。
4-氨基苯并-18-冠-6(14)的合成 将4-硝基苯并-18-冠-6(13)(0.40克，1.11毫摩尔)溶于95％(v/v)乙醇(25毫升)，并在炭载钯(40毫克)上用水合肼(12毫升)氢化。将反应回流24小时。将热溶液经C盐过滤，并减压去除溶剂。加入水，并将产物萃取到二氯甲烷中，经硫酸钠干燥，过滤并减压去除溶剂，得到粘性液体，然后将其置于冰上，得到0.28克白色粉末(14)(0.86毫摩尔，84％产率)。
1H n.m.r(300MHz，CDCl3)δ6.74(d，1H，J8.4Hz，Ar-H)；6.29(d，1H，J2.6Hz，Ar-H)；6.21(dd，1H，J8.4Hz，2.6Hz，Ar-H)；4.09(m，4H，OCH2)；3.89(m，4H，OCH2)；3.73(m，8H，OCH2)；3.68(s，4H，OCH2)，3.46(br s，2H，NH2)。13C n.m.r(75MHz，CDCl3)δ149.0，(C1)；140.7，(C2)；140.4，(C4)；115.5，(C6)；106.1，(C5)；101.5，(C3)；69.7，(OCH2)；69.6，(OCH2)；69.6，(OCH2)；69.5，(OCH2)；69.0，(OCH2)；68.8，(OCH2)；68.6，(OCH2)；67.5，(OCH2)。IR(Nujol)3585，m；3362，m；1622，m；1594，m；1100，s。质谱(ESI，+ve)m/z 328.1[M]+；351.1[M+Na]+。
4-氨基[N，N-二乙酰乙酯]苯并-18-冠-6(15)的合成 在氮气氛下，将4-氨基苯并-18-冠-6(14)(0.28克，0.84毫摩尔)、碘化钾(0.28克)和溴化乙酸乙酯(0.2毫升)的混合物在无水乙腈(6毫升)中回流48小时。将溶液冷却，用甲苯(10毫升)稀释，并过滤。用2M盐酸(3×20毫升)和水(2×20毫升)清洗收集到的滤液，经硫酸钠干燥，过滤并减压去除溶剂，得到84毫克棕色油(15)(0.17毫摩尔，20％产率)。
1H n.m.r(300MHz，CDCl3)δ6.79(d，1H，J8.7Hz，Ar-H)；6.29(d，1H，J2.9Hz，Ar-H)；6.16(dd，1H，J8.7Hz，2.7Hz，Ar-H)；4.20(q，4H，J7.1Hz，-OCH2-CH3)；4.10(m，4H，OCH2)；4.08(s，4H，N-CH2-)；3.89(m，4H，OCH2)；3.72(m，8H，OCH2)；3.67(s，4H，OCH2)，1.26(t，6H，J7.1Hz，-OCH2-CH3)。13C n.m.r(75MHz，CDCl3)δ170.0，(C＝O)；148.7，(C1)；142.7，(C2)；140.7，(C4)；115.3(C6)；104.7，(C5)；100.5，(C3)；69.7，(OCH2)；69.6，(OCH2)；69.6，(OCH2)；69.5，(OCH2)；69.5，(OCH2)；68.7，(OCH2)；68.6，(OCH2)；67.8，(OCH2)；60.1，(-O-CH2-CH3)；53.1，(N-CH2-)；13.3，(-O-CH2-CH3)。IR(Nujol)2876，m；2362，w；1744，s；1615，m；1520，s；1452，m；1183，m。质谱(ESI，+ve)m/z 500.4[M]+；522.5[M+Na]+。
4-氨基[N，N-二乙酸]苯并-18-冠-6(16)的合成 通过溶于温乙醇(10毫升)并加入氢氧化钾的稀释水溶液(0.2克/20毫升)(5毫升)，由此将酯化合物(15)皂化成其各自的钾盐。将该溶液温热5分钟并减压去除乙醇。搅拌同时逐滴加入6M盐酸，由此获得羧酸。然后将该产物萃取到乙酸乙酯(20毫升)中，经硫酸钠干燥，过滤，并减压去除溶剂，得到12.5毫克黄色固体(16)(0.03毫摩尔，21％产率)。
1H n.m.r(300MHz，d6-DMSO)δ6.83(d，1H，J8.7Hz，Ar-H)；6.25(d，1H，J2.4Hz，Ar-H)；6.03(dd，1H，J8.7Hz，2.8Hz，Ar-H)；4.07(s，4H，N-CH2-)；4.01(m，4H，OCH2)；3.77(m，4H，OCH2)；3.58，(m，8H，OCH2)；3.55(s，4H，OCH2)。
化学式为(I)或(II)的化合物的应用实施例5化学式为(I)或(II)的化合物在活体外的抗氧化性测定加入自由基清除剂(FRS)，更常称作抗氧化剂，通常可以预防类脂氧化。它们的作用是将活泼而且有害的分子例如羟基、硝酰基、超氧化物自由基转变成可以被生物过程忽略或改造的无害分子。造成细胞死亡的主要途径之一是氧化应激。氧化应激是由这些有害自由基对细胞壁和膜的作用产生的，这种作用引起细胞壁和膜的破损。在氧化评测(反应方案1)中，使用AAPH作为生成自由基引发剂的超氧化物，并根据存在和不存在自由基清除剂时，亚油酸的氧化产生的氢过氧化共轭二烯的生成来计算其效力。氢过氧化共轭二烯酷似对细胞壁施加的细胞氧化应激的产物。抗氧化剂可以在反应的任何阶段通过与适当的自由基反应(反应方案1)来产生作用以停止或减缓共轭二烯的生成。
一种方便的测定水溶液系统中抗氧化剂效力的试验是使用2，2-偶氮二(2-脒丙烷).2HCl(AAPH)作自由基引发剂(反应方案1)的设计。使用Cary 100 UV-Vis分光光度计在234nm处监测亚油酸于37℃在水溶液系统中的氧化产生的氢过氧化共轭二烯(LOOH)的生成情况，监测持续15分钟。由抗氧化剂抑制自由基并由此使亚油酸的氧化减缓或停止的能力测定其效力。
反应方案1
测定标准情况(即不存在抗氧化剂时自由基的生成情况)下的效果。然后使用下述方程式计算效力效力(％)＝1-[K2/K1]×100其中K1＝标准情况(无氧化剂)下的氧化速率＝[吸收率之差]/[时间(秒)]K2＝氧化剂的氧化速率＝[吸收率之差]/[时间(秒)]所述方法是一种仿生方法，其被设计成产生一些与活体产生的自由基相同的自由基。氧化并不是通过加入过氧化氢产生的。
在测试本发明的化合物的效力之前，对许多公知的抗氧化剂，包括维生素E和抗坏血酸进行测试。对维生素E和抗坏血酸进行的每个测试都得出与现有文献中相似的结果。测试了许多其它变量，包括抗氧化剂、底物(亚油酸)和引发剂(AAPH)的量。最理想的量如下所示2.78毫升0.05M磷酸盐缓冲剂pH7.430微升亚油酸分散原料10微升0.01M抗氧化剂原料150微升40mM AAPH原料抗氧化剂 浓度 最终浓度 效力维生素E 0.01M 33.3μM 93％抗坏血酸 0.01M 33.3μM 74％(3)*0.01M 33.3μM 20％(4)*0.01M 33.3μM 83％(5)*0.01M 33.3μM 47％(6)*0.01M 33.3μM 43％*编号对应于本文提供的合成反应方案中使用的编号结构在存在和不存在Ca2+时测试本发明的化合物的效力时，使用经HEPES缓冲过的盐水取代标准的磷酸盐缓冲剂并使用CaCl2作钙离子源。
溶剂(％) 不含钙的HBS(％)含钙的HBS(％)效力维生素E甲醇(33％) 67％ -90％(4)*DMSO(33％) 67％ -93％(6)*DMSO(33％) 67％ -46％维生素E甲醇(33％) - 67％ 94％(4)*DMSO(33％) - 67％ 93％(6)*DMSO(33％) - 67％ 35％*编号对应于本文提供的合成反应方案中使用的编号结构实施例5在活体外对神经元存活情况的研究在被溴化3-(4，5-二甲基噻唑-2-基)-2，5-二苯四唑(MTT)还原反应损伤的24小时后，测定NSC34细胞(成神经细胞瘤×脊髓细胞系)的细胞存活能力(参看Cheung NS等人(1998)Neuropharmacology 37，1419-1429)，一种对线粒体功能的测定，线粒体功能在受损细胞中受到损害(参看Kroemer等人，(1998)Ann Rev Physiol 60，619-642)。MTT用神经细胞在37℃培养30分钟，并从置于20％十二烷基硫酸钠和40％二甲基甲酰胺中的细胞中溶解出还原的甲臢(formazan)产物，并在590nm处读取吸收率(Ceres UV900C；微孔板读数仪(microplate reader)；Biotek Instruments，USA)。用过量过氧化氢或Triton X-100处理的培养基被认定为100％细胞死亡，并将其结果表示为溶媒对照物百分比。
实施例6在活体外对神经元存活情况的研究我们研发了两种可用于保护(screen)具有下述功能的药物的细胞培养系统所述药物预防由氧化应激(图3，模型A)和兴奋毒性(图4，模型B)引起的细胞死亡。在模型A中，我们采用培养过的成纤维细胞，其用在10μM时引起明显死亡的百草枯进行处理(参看图3)。在模型B中，我们采用NSC-34运动神经元细胞系，使用特定的激动剂fluorowillardine即FW经由谷氨酸兴奋毒性途径可使其退化(图4)。
实施例7在活体内对神经元存活情况的研究测定化合物与肽核酸(本文称作PNAG3并具有结构N-TCC GTGAGA ATG-C或N-GTG AGA ATG-C)和白血病抑制因子(LIF)共同治疗时这些化合物的容许剂量和疗效。进行这些实验测定与化合物(3)共同治疗是否通过化合物(3)的抗氧化和钙缓冲作用产生增效作用。SOD1G93A鼠经受VEH、PNAG3+化合物(3)、LIF+化合物(3)和PNAG3+LIF+化合物(3)治疗而没有对行为和体重减轻产生明显的负作用(图5)。在所有组别中，观察到预期的由与疾病有关的肌肉萎缩引起的体重下降。使用Rotarod装置(图6A)和bar grab task(图6B)进行的运动行为分析表明，与VEH组相比，PNAG3+化合物(3)、LIF+化合物(3)和PNAG3+LIF+化合物(3)组表现出明显的改进。这些老鼠的存活情况表示在图6C和表1中。这些数据表明在存活方面有所改进。
表1在Rotarod试验中运动缺陷的发作和使用MND的老鼠的平均存活情况的表格式表示。在Rotarod试验(A)和平均存活天数(B)方面，所有三组接受治疗的组与溶媒组相比，都有统计学上的差异。在表格中，VEH＝溶媒，(3)是本文列出的合成反应方案中的化合物(3)，LIF＝白血病抑制因子，PNAG3是N-TCC GTG AGA ATG-C或N-GTGAGA ATG-C。
(A)在Rotarod试验中的运动缺陷发作
(B)平均存活天数
最后，应该意识到，对于本领域技术人员而言，在不背离本发明的范围和精神的前提下，本发明的所述方法和组合物的各种修改和变体是显而易见的。尽管已经根据具体的优选实施方案对本发明进行描述，应该理解的是，要求保护的本发明不应该不适当地限于这些具体实施方案。实际上，本发明的所述实施方式的各种改动对本领域技术人员而言是显而易见的，且应当认为其在本发明的范围之内。
权利要求
1.一种预防或降低氧化应激对底物的影响的方法，该方法包括用化学式为(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理所述底物从而的步骤 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基(单-、双-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一个或多个选自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖类部分的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5选自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6独立地选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
2.如权利要求1所述的方法，其中R5具有下列分子式 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；和R4选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
3.如权利要求2所述的方法，其中在化学式为(I)的化合物中，R2是-(CH2CH2O)n-R5，R3是-CH2C(O)R6，R4和R6是-O-甲基、-O-乙基、-O-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3或-OC(O)CH3中的一个或多个。
4.如权利要求1所述的方法，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式
5.如权利要求1所述的方法，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式
6.如权利要求1所述的方法，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式 R＝CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3
7.如权利要求2所述的方法，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式 R＝CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3
8.如权利要求1所述的方法，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式 其中R1和R2独立地选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN；且R3选自-OH、-O烷基、-O芳基、-S烷基、氨基、糖类部分、-聚烯氧基、和水增溶基团。
9.如上述权利要求中任何一项所述的方法，其中底物是生物系统。
10.如权利要求9所述的方法，其中该方法用于预防或治疗神经退行性病变。
11.如权利要求10所述的方法，其中神经退行性病变是中风、癫痫、帕金森氏症、亨廷顿氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化或阿尔茨海默氏症。
12.如权利要求11所述的方法，其中神经退行性病变的治疗还包括施用治疗神经退行性病变用的第二试剂。
13.如权利要求12所述的方法，其中第二试剂是肽核酸。如权利要求13所述的方法，其中肽核酸是N-TCC GTG AGAATG-C或N-GTG AGA ATG-C。
14.如权利要求12所述的方法，其中第二试剂是神经营养因子。
15.如权利要求15所述的方法，其中神经营养因子是白血病抑制因子。
16.化学式为(I)的化合物在与氧化应激有关的病状的治疗药剂的制备中的应用 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基(单-、双-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一个或多个选自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖类部分的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5选自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6独立地选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
17.如权利要求17所述的化合物的应用，其中R5具有下列分子式 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；和R4选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
18.如权利要求18所述的化合物的应用，其中在化学式为(I)的化合物中，R2是-(CH2CH2O)n-R5，R3是-CH2C(O)R6，R4和R6是-O-甲基、-O-乙基、-O-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3或-OC(O)CH3中的一个或多个。
19.如权利要求17所述的化合物的应用，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式
20.如权利要求17所述的化合物的应用，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式
21.如权利要求17所述的化合物的应用，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式 R＝CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3
22.如权利要求18所述的化合物的应用，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式 R＝CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3
23.如权利要求17所述的化合物的应用，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式 其中R1和R2独立地选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN；且R3选自-OH、-O烷基、-O芳基、-S烷基、氨基、糖类部分、-聚烯氧基、和水增溶基团。
24.如权利要求17至24中任何一项所述的化合物的应用，其中与氧化应激有关的病状是神经退行性病变。
25.如权利要求25所述的化合物的应用，其中神经退行性病变是中风、癫痫、帕金森氏症、亨廷顿氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化或阿尔茨海默氏症。
26.一种治疗与钙毒性和氧化应激有关的病状的方法，该方法包括施用治疗有效量的自由基清除剂和钙缓冲剂的步骤。
27.如权利要求27所述的方法，其中与钙毒性和氧化应激有关的病状是神经退行性病变。
28.如权利要求28所述的方法，其中神经退行性病变是中风、癫痫、帕金森氏症、亨廷顿氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化或阿尔茨海默氏症。
29.如权利要求29所述的方法，其中该方法包括施用作为自由基清除剂的第一试剂和作为钙缓冲剂的第二试剂的步骤。
30.如权利要求30所述的方法，其中自由基清除剂是硫辛酸、2，3-二氢-1-苯并呋喃-5-酚、苯并二氢吡喃-4-酮、维生素E类似物或维生素E。
31.如权利要求31所述的方法，其中钙缓冲剂是15-冠-5、18-冠-6或二(邻氨基苯氧基)乙烷-N，N，N’，N’-四乙酸。
32.如权利要求30所述的方法，其中第一和第二试剂是既是自由基清除剂又是钙缓冲剂的相同的化合物。
33.如权利要求33所述的方法，其中单种试剂是化学式为(I)的化合物 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基(单-、双-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一个或多个选自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖类部分(sugarmoiety)的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5选自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6独立地选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
34.如权利要求34所述的方法，其中R5具有下列分子式 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；和R4选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基。
35.如权利要求35所述的方法，其中在化学式为(I)的化合物中，R2是-(CH2CH2O)n-R5，R3是-CH2C(O)R6，R4和R6是-O-甲基、-O-乙基、-O-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3或-OC(O)CH3中的一个或多个。
36.如权利要求34所述的方法，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式
37.如权利要求34所述的方法，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式
38.如权利要求34所述的方法，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式 R＝CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3
39.如权利要求35所述的方法，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式 R＝CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH3
40.如权利要求34所述的方法，其中化学式为(I)的化合物具有下列分子式 其中R1和R2独立地选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN；且R3选自-OH、-O烷基、-O芳基、-S烷基、氨基、糖类部分、-聚烯氧基、和水增溶基团。
41.一种化学式为(II)的化合物，或其药学上可接受的盐 其中R1和R2都独立地选自一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R1和R2独立地是每个芳环上的四、三、二或单取代基。R3和R4都独立地选自-H、-烷基、-CH2OH、-芳基、糖类部分、-聚烯氧基、水增溶基团、抗氧化剂；R5和R6独立地选自-O-烷基、-O-芳基、-S-烷基和-氨基；R7是-H(在每个N原子上)、-烷基、芳基、-(CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-(n＝1-5)；R8和R9都独立地选自-H、-烷基、-COOH、-COO烷基。
42.如权利要求42所述的化合物，其中化学式为(II)的化合物是金属盐或碱土金属配合物的形式。
43.一种预防或降低氧化应激对底物的影响的方法，该方法包括用化学式为(II)的化合物或其药学上可接受的盐处理所述底物的步骤 其中R1和R2都独立地选自一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R1和R2独立地是每个芳环上的四、三、二或单取代基。R3和R4都独立地选自-H、-烷基、-CH2OH、-芳基、糖类部分、-聚烯氧基、水增溶基团、抗氧化剂；R5和R6独立地选自-O-烷基、-O-芳基、-S-烷基和-氨基；R7是-H(在每个N原子上)、-烷基、芳基、-(CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-(n＝1-5)；R8和R9都独立地选自-H、-烷基、-COOH、-COO烷基。
44.如权利要求44所述的方法，其中底物是生物系统。
45.如权利要求45所述的方法，其中该方法用于预防或治疗神经退行性病变。
46.如权利要求46所述的方法，其中神经退行性病变是中风、癫痫、帕金森氏症、亨廷顿氏症、肌萎缩性脊髓侧索硬化症、多发性硬化或阿尔茨海默氏症。
47.一种用于清除自由基的配方物，该配方物含有有效量的化学式为(I)或(II)的化合物 其中R1是一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基(单-、双-或三-取代的)、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R2是一个或多个选自-H、-烷基、-(CH2CH2O)n-R5、糖类部分的取代基；R3是-H、-烷基、-芳基、-烷基OR6、-烷基C(O)R6；R5选自-H、-烷基、-芳基；和R4和R6独立地选自-OH、-O-烷基、-O-聚烯氧基、-O-芳基、-OC(O)O-烷基、-S-烷基和-氨基，和 其中R1和R2都独立地选自一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R1和R2独立地是每个芳环上的四、三、二或单取代基。R3和R4都独立地选自-H、-烷基、-CH2OH、-芳基、糖类部分、-聚烯氧基、水增溶基团、抗氧化剂；R5和R6独立地选自-O-烷基、-O-芳基、-S-烷基和-氨基；R7是-H(在每个N原子上)、-烷基、芳基、-(CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-(n＝1-5)；R8和R9都独立地选自-H、-烷基、-COOH、-COO烷基。
48.含有化学式为(II)的化合物和药学上可接受的赋形剂的药物组合物 其中R1和R2都独立地选自一个或多个选自-H、-烷基、-烷氧基、-芳基、-芳氧基、-卤素、-氨基、-烷硫基、-NO2、-COOH、-COO烷基、-CO-烷基、-CN的取代基；R1和R2独立地是每个芳环上的四、三、二或单取代基。R3和R4都独立地选自-H、-烷基、-CH2OH、-芳基、糖类部分、-聚烯氧基、水增溶基团、抗氧化剂；R5和R6独立地选自-O-烷基、-O-芳基、-S-烷基和-氨基；R7是-H(在每个N原子上)、-烷基、芳基、-(CH2O)n-、-(CH2CH2O)n-(n＝1-5)；R8和R9都独立地选自-H、-烷基、-COOH、-COO烷基。
全文摘要
本发明提供了一种预防或降低氧化应激对底物的影响的方法。该方法包括用化学式为(I)的化合物或其药学上可接受的盐处理该底物的步骤，其中R
文档编号A61K38/00GK1668575SQ03817337
公开日2005年9月14日 申请日期2003年5月27日 优先权日2002年5月27日
发明者S·S·切玛, S·兰福德, N·S·张, P·M·贝尔特, K·J·麦克法兰, M·马尔凯尔 申请人:莫纳什大学