专利名称：分离肠胆固醇结合蛋白的方法
技术领域：
本发明涉及分离肠蛋白的方法，所述蛋白与肠胆固醇吸收有关并且可以与胆固醇吸收抑制剂结合。
在人体内，平均约50％的胆固醇存在于肠腔内。肠腔内的胆固醇主要来源于饮食和胆汁。每天从胆汁分泌出约2g胆固醇。肠胆固醇的吸收主要依赖于胆汁盐的存在。因此，给予胆汁盐重吸收抑制剂或者胆汁盐多价螯合剂能够抑制肠胆固醇的吸收。
抑制肠胆固醇吸收的主要目的是治疗脂质紊乱、动脉硬化和心血管疾病。大部分专家认为肠胆固醇吸收是通过物理化学扩散进行的。
许多关于胆固醇运输的研究报告表明胆固醇的运输与蛋白有关。肠胆固醇的吸收有很大的个体差异性。体外实验的生化数据显示小肠单层小泡和刷状缘小泡之间的胆固醇交换与蛋白有关。如仅是甲基基团(β-谷甾醇)和乙基基团(菜油甾醇)不同的植物固醇(β-谷甾醇和菜油甾醇)在肠吸收上也许表现很大的不同。在人体内，β-谷甾醇还表现胆固醇吸收抑制。在肠腔内给药抑制肠胆固醇吸收的化合物中有两类最具活性的化合物。这些化合物中一些是源自皂角苷的如替奎安和帕马苷的化合物，另一些是2-氮杂环丁烷酮衍生物。Clader等在J.Med.Chem.39，3684-3693，1996中将2-氮杂环丁烷酮衍生物描述为胆固醇吸收抑制剂。在本发明中，吸收是指物质附着蛋白并通过蛋白的帮助运输该物质。
肠吸收胆固醇主要是有助于血浆胆固醇的动态平衡。在临床试验中已经证明了肠胆固醇吸收抑制剂(如依折麦布(Ezetimlbe)或帕马苷)作为新颖的降低胆固醇药物的疗效。尽管经过大量的科学研究，但是人们仍不清楚它们作用的分子模式和肠胆固醇吸收的机制且这方面具有很大的争议性。通常来讲，人们认为肠胆固醇吸收是通过跨越血浆膜和肠刷状缘细胞膜的被动扩散，但是越来越多的证据表明蛋白介导肠胆固醇吸收过程胆固醇的吸收具有极大的种属差异，具有相似物理化学性质的结构密切相关的植物固醇(β-谷甾醇和菜油甾醇)与吸收差的胆固醇很不相同，这使得简单扩散不大可能。具有显著的构效关系的特异性胆固醇转运抑制剂(2-氮杂环丁烷酮和甾类糖苷)的存在强烈表明肠胆固醇吸收过程是蛋白介导的过程。
微量的胆固醇是维持人体功能必不可少的多功能化合物。只有动物能够产生胆固醇，植物体内不含有胆固醇，除非将动物基的产物(如猪油)在处理过程中加入。在人体内，胆固醇具有三种主要功能。它被某些腺体用于生产类固醇或可的松类激素(包括性激素)。它有助于肝脏产生胆汁酸(为脂肪消化所必需)。最后但并非不重要的功能是作为细胞膜和结构(是一种机体组织的组成材料)的主要成分。
当机体有太多的胆固醇或者胆固醇沉积在不适当的位置就引起了胆固醇的问题。当胆固醇沉积在心脏的冠状动脉壁(为心脏本身心肌组织的主要供氧血管)内就引起了冠心病。它有助于脂肪形成，成为斑的韧性栓塞。这种斑的堆积具有各种不同的名称动脉硬化、动脉变硬和动脉粥样硬化。胆固醇也能沉积在身体其它地方的动脉内而引起中风(在脑部阻塞动脉)和外周血管病(在腿部阻塞动脉)的发生。
为了流经全身，胆固醇必须由特定的分子(脂蛋白)包裹。脂质或脂胆固醇成分包裹在水溶性的蛋白包衣内。各种不同类型的脂蛋白包括来自体内循环系统的各种脂蛋白、运输胆固醇至组织以及从其他组织去除胆固醇。在体内主要的运载胆固醇的化合物是低密度脂蛋白或LDL-胆固醇。通常称LDL为“不好胆固醇”，因为它在胆固醇在动脉内的沉积中具有重要作用。因为它仅有少许蛋白(分子中最重的部分)，大部分是脂肪，所以称为低密度。LDL的水平高则患有冠心病的风险增加。通常称高密度脂蛋白或HDL为“好胆固醇”，因为它有助于将胆固醇从动脉壁内去除并且将它转运到肝脏排泄。与LDL胆固醇相反，HDL水平低则患有冠心病的风险增加，而HDL的水平高则能免于患有这种疾病。
其它亚型的胆固醇颗粒包括脂肪消化时由肠细胞产生的乳糜颗粒，以及由肝脏产生的作为LDL胆固醇的重要前体的极低密度脂蛋白(VLDL)。VLDL是运输肝脏产生的甘油三脂的重要脂蛋白。
引起心脏疾病的风险因素，关键是LDL和HDL。
所有的证据表明高脂肪、高胆固醇饮食可增加血内胆固醇的水平，血胆固醇水平的增加是心脏疾病风险的确切因素，人们自然会想到通过饮食或其他方法降低血的胆固醇就可减少患病的风险。
本发明的目的是提供一种分离蛋白的方法，这种蛋白与肠胆固醇吸收有关且为胆固醇吸收抑制剂的蛋白靶分子。这种方法被认为大大有助于控制胆固醇水平增加的治疗。
本发明涉及分离蛋白的方法，该方法包括a]提供生物材料，b]将来自a]的生物材料与光敏的化合物2-氮杂环丁烷酮共同孵育，所述2-氮杂环丁烷酮被放射标记并且能够与所述蛋白特异性结合，c]将生物材料溶解并去除细胞碎片，d]将上清液加至含有小麦胚芽凝集素琼脂糖的装置上，e]将来自d]的小麦胚芽凝集素琼脂糖的洗脱液上样于羟基磷灰石柱上，f]将来自e]的放射标记部分上样于制备性SDS-PAGE上，g]收集放射标记部分且可能沉淀。
优选的生物材料取自肠组织或肠细胞培养液中的细胞或者取自人、大鼠、小鼠或兔的回肠的刷状缘细胞。
所述光敏的2-氮杂环丁烷酮光反应化合物优选具有如下式I的结构(Kramer，W.等，(2000)FEBS Letters 487，293-297)式I 其中R选自如下a)-e)基团中任一个
a)-CH2NH-CO-CH3 式I中a、b和c的化合物的合成已经公开在2002年3月28公开的DE 10042447 A1中。式I中d和e的化合物的合成在下文的实施例中公开。
分子内的对光不稳定的基团可以用于产生与直接相邻的分子(优选蛋白)之间的共价键。为此，首先将光不稳定的基团的化合物与待产生共价键连接的分子直接接触。例如，这可以通过所述化合物(为蛋白特异性抑制剂，优选胆固醇吸收抑制剂)的另一部分产生。使所述化合物与所述分子接触，然后用紫外线照射。用紫外线照射可以使对光不稳定的基团活化并产生分子(尤其蛋白)间的共价键。适当的对光不稳定的基团为如二氮杂环丙烯、叠氮基或羰基官能团。
可用普通的紫外线灯照射，例如内置溴化乙锭的用于肉眼观察多聚核苷酸的UV灯，或者用于消毒实验室的UV灯或者从“The SouthernUltraviolet Company，Hamden，CT”得到的其它光化学反应器。紫外光照射后，采用常用的方法使细胞破裂。其示例包括重复冷冻和融解、用超声处理细胞、采用French压挤或者加入洗涤剂和酶。通过例如硫酸铵沉淀、差速离心或柱层析技术进行细胞溶解产物中蛋白的分级。为此，适用的柱层析包括变性或未变性的聚丙烯酰胺一维或二维凝胶电泳、高液压柱层析、离子交换柱层析或者亲和柱层析。本领域技术人员对这些技术是非常熟悉的，详见例如“Current Protocols in Protein Science”；John E.Caligan；Ben M.Dunn；Hidde L.Ploegh；David W.Speicher；Paul T.Wingfield；Wiley和Sons；ISBNO-471-11184-8。
分级后优选通过放射标记化合物(含有肠胆固醇吸收抑制剂和对光不稳定的基团)来检测蛋白。为此，可使用放射性同位素，如3H或14C。适当的测定方法为例如通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白导入聚丙烯酰胺上后再通过X线摄影底片测定含有共价键化合物的蛋白。其它适当的测定方法为液体快速计数或平板扫描。
生物材料优选由肠细胞组成。例如，可将动物的肠解剖随后经纯化、酶解结缔组织并且在等张缓冲液中将单个细胞悬浮而取得肠细胞。适合制备肠细胞的肠组织为宰杀后动物尸骸的相应部位。在手术中得到的部分人肠组织也可制备成肠细胞。肠细胞也可由肠细胞培养物(对于本发明，采用细胞培养技术制备)组成。肠细胞碎片可为肠细胞的细胞器。优选的细胞器为肠细胞膜。可将肠细胞破坏后通过差速离心得到肠细胞膜。优选的肠细胞碎片也可为蛋白片段。制备肠细胞或肠细胞碎片的细胞优选来自哺乳动物肠组织刷状缘的肠细胞。
取得肠细胞的哺乳动物优选包括但不限于人、猴子、牛、猪、大鼠、小鼠、兔、仓鼠或其他脊椎动物。可通过制备这些生物体肠刷状缘组织细胞悬浮液而得到这些细胞。例如可通过外科手术获得适当的肠组织。另一些可从宰杀后的动物尸骸处取材。源自一个肠细胞系的细胞同样是适用的。为了制备适当的细胞制备物，用酶处理肠组织从而得到单个细胞，然后经差速离心。然后将得到的细胞或细胞器置于适当的液体介质中。这些液体介质可包括缓冲物质、盐、蛋白以及另外的赋形剂。
本发明也涉及分离肠吸收抑制剂结合蛋白(与肠胆固醇吸收有关)的方法，该方法包括a]制备生物材料，b]将来自a]的生物材料与光敏的胆固醇吸收抑制剂共同孵育，所述胆固醇吸收抑制剂被放射标记或生物素标记，c]将来自b]的生物材料溶解并去除细胞碎片，d]将上清液进行柱层析或者置于链霉抗生物素-琼脂糖上，e]将洗脱液置于SDS-PAGE上，f]分离、洗脱并且可能再折叠的大小为140-150kDa的蛋白。
生物材料优选取自肠组织或肠细胞培养液中的细胞或者取自人、大鼠、小鼠或兔的回肠的刷状缘细胞。
优选生物素标记的胆固醇吸收抑制剂具有如下结构 本发明还涉及能够与胆固醇吸收抑制剂特异性结合的蛋白，如上所述，该蛋白可通过本发明的方法分离。优选的蛋白大小为140-150kDa，更优选大小为145kDa的蛋白。蛋白可为糖基化的蛋白。
根据所用的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法以及已知的其他相关方法的不同，所述的蛋白的分子量的范围不确定。分子量的变化范围为+/-10％区间。所述的分子量表示多次实验的平均值。当称蛋白的分子量为145kDa时，那么由SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分别进行10次实验来测定分子量，10次的平均值为145.3kDa，其标准误差为+/-7.55kDa本领域技术人员可在“Carbohydrate Biotechnology Protocols，Methods in Biotechnology，10(1999)Humana Press，ISBN 0-89603-563-8，Editor C.Bucke”中有关于糖基化的适当方法的详细资料。
本发明还涉及由本发明蛋白和如下结构的化合物组成的复合物 本发明还涉及含有本发明蛋白和配制药物的药学上可接受的化合物和/或赋形剂的药物组合物。这些物质通常已知且在由Mack PublishingCompany出版的第15版Remingtons Pharmaceutical Sciences中有描述。
本发明还涉及含有本发明蛋白和上述化合物的复合物以及配制药物的药学上可接受的化合物的药物组合物。
本发明也包括本发明蛋白在生产治疗高胆固醇相关疾病的药物组合物中的用途。这些疾病为如肥胖、动脉硬化、高血压、心力衰竭等。胆固醇水平为199mg/dL则认为是胆固醇升高。
本发明也包括本发明蛋白和上述化合物的复合物在生产治疗高胆固醇相关疾病的药物组合物中的用途。
本发明也涉及本发明蛋白在鉴定抑制胆固醇吸收的化合物中的用途，其中a]提供含有本发明的蛋白的生物材料，b]提供化合物，c]使来自a]的生物材料与来自b]的化合物接触，d]测定由来自c]的生物材料所吸收的胆固醇的量，e]将d]的结果与对照实验组结果进行比较，其中对照实验组的胆固醇吸收量通过使与来自a]的生物材料具有相同种类和/或组织特异性、但是不与b)的化合物接触的生物材料进行测定，f]当细胞与b]的化合物接触后测定的胆固醇吸收量减少时，e]的结果表明化合物抑制胆固醇重吸收。
本发明也涉及含有上述方法可鉴定的化合物和药学上可接受的赋形剂的药物，该药物用于治疗高胆固醇相关性疾病。
这种化合物的分子量优选100-50000Da且更优选100-5000Da。这种化合物可以为胆固醇类似物、含有蛋白、肽或者脂肪酸的化合物。
例如，可通过化学合成方法制备所述化合物。所述化合物可为合成化合物中的一部分，如那些来自完全合成程序(“化合物库”)中存储和分类的化合物。化合物也可由微生物(尤其指细菌、真菌或者动物或植物种类(天然物质))产生。若取自天然物质，也可通过分离适当的有机体制备。在大部分情况下，蛋白与化合物的接触是在含有一定比例的溶剂(如二甲亚砜或乙醇)的水溶液中进行的。水溶液内也可含有缓冲物质、离子或稳定剂(如蛋白、甘油等)。具体恒定的条件(如温度、pH值、离子条件、蛋白或化合物浓度、容积)可能有利于接触。因此，在接触期间优选温度恒定为37℃。接触后测定化合物与蛋白的结合，例如根据它与胆固醇或放射标记的胆固醇吸收抑制剂的相互作用，采用胆固醇或胆固醇吸收抑制剂置换的方法测定化合物对蛋白的亲和力。
实施例5-(2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸[2-(4-叠氮基-苯基)-1-(4-{4-[3-(3-羟基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮杂环丁烷-1-基]-苯基氨基甲酰基}-丁基氨基甲酰基)-乙基]酰胺的合成下述段落中的数字1-14指附
图1的整个反应流程。
生物素标记的光敏的胆固醇抑制剂5-(2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸[2-(4-叠氮基-苯基)-1-(4-{4-[3-(3-羟基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮杂环丁烷-1-基]-苯基氨基甲酰基}-丁基氨基甲酰基)-乙基]酰胺的合成下述段落中的数字1-14指合成上述生物素标记光反应胆固醇抑制剂的附图1和图2的反应流程。
3-[5-(叔丁基-二甲基-硅烷氧基)-5-苯基-戊酰基]-4-苯基-噁唑烷-2-酮(1) 将30g 3-(5-羟基-5-苯基-戊酰基)-4-苯基-噁唑烷-2-酮溶解于50mlDMF中。25ml DMF中加入14.3g咪唑和19g叔丁基-二甲基甲硅烷基氯后，在室温下搅拌反应直到所有成分溶解(2-4h)。蒸发反应溶液，加入水后用乙酸乙酯萃取。经硫酸镁干燥有机相并蒸发后得到化合物1C26H35NO4Si(453.6)MS(ESI+)476(M+Na+)。
(4-甲氧基-亚苄基)-(4-硝基-苯基)-胺(2)向溶解于160ml异丙醇的50g(370mmol)茴香醛中加入51g(370mmol)对硝基苯胺。在80℃下2小时后，产物沉淀。将反应混合物冷却到室温并过滤。用异丙醇洗涤残余物。干燥后得到62.9g黄色晶体的产物2(收率66％)C14H13N2O3(257.27)。
3-{5-(叔丁基-二甲基-甲硅烷氧基)-2-[(4-甲氧基-苯基)-(4-硝基-苯基氨基)-甲基]-5-苯基-戊酰基}-4-苯基-噁唑烷-2-酮(3) 在10℃下将溶有5.4g(12.0mmol)产物1和6.2g(24mmol)产物2的135ml二氯甲烷中加入8ml二异丙基乙基胺且逐滴加入4.8ml的三甲基甲硅烷基氯。1小时后在-10℃下逐滴加入二氯甲烷中的14ml 1M的四氯化钛。在-10℃下搅拌3小时并且在-30℃下再存放12小时(未搅拌)。然后加入8ml乙酸和140ml 7％的酒石酸水溶液，再在室温下搅拌2小时。加入50ml 20％亚硫酸氢钠水溶液后，再搅拌1小时并用二氯甲烷萃取。有机相经硫酸镁干燥、蒸发以及硅胶(乙酸乙酯/庚烷(＝1/3->1/1))柱层析纯化。得到6.3g(74％)淡黄色固体产物3C40H47N3O7Si(709.92)MS(ESI+)710(M+H+)。
3-[3-(叔丁基-二甲基-甲硅烷氧基)-3-苯基-丙基]-4-(3-甲氧基-苯基)-1-(4-硝基-苯基)-氮杂环丁烷-2-酮(4) 在室温、氩气下将含有6.1g(8.6mmol)的产物3、7.3ml双三甲基甲硅烷基乙酰胺、0.5g四丁基氟化铵和100ml叔丁基甲基醚的混合物搅拌10小时。反应完成后由冰冷却缓慢加入5ml的乙酸并蒸发。经硅胶柱层析(乙酸乙酯/庚烷＝1/2)分离残余物。得到3.3g(70％)淡黄色固体的产物4C31H38N2O5Si(546.74)MS(ESI+)547.3(M+H+)。
1-(4-氨基-苯基)-3-[3-(叔丁基-二甲基-甲硅烷氧基)-3-苯基-丙基]-4-(3-甲氧基-苯基)-氮杂环丁烷-2-酮(5) 在5巴的氢气压下，在高压釜内将50ml乙酸乙酯中的3.0g(5.5mmol)产物4与1.0g 10％披钯炭反应2小时。将反应溶液过滤、蒸发并用硅胶柱层析(二氯甲烷/甲醇＝10/1)分离。得到2.4g(86％)无色固体的产物5C31H40N2O3Si(516.76)MS(ESI+)517.4(M+H+)。
1-(4-氨基-苯基)-3-(3-羟基-3-苯基-丙基)-4-(3-甲氧基-苯基)-氮杂环丁烷-2-酮(6)
将15ml 2N盐酸水溶液加入到溶有2.3g产物5的20ml四氢呋喃中并搅拌2小时。向反应物内加入碳酸氢钠水溶液并用乙酸乙酯萃取。有机相经硫酸镁干燥、蒸发并经硅胶(乙酸乙酯/庚烷＝1/1->1/0)柱层析纯化。得到1.1g无色固体的产物6C25H26N2O3(402.50)MS(ESI+)403.2(M+H+)。
(4-{4-[3-(3-羟基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮杂环丁烷-1-基]-苯基氨基甲酰基}-丁基)-氨基甲酸-9H-芴-9-基甲基乙酯(8) 将0.8g(2.0mmol)产物6和1.35g(4.0mmol)的5-(Fmoc-氨基)-戊酸7(Fluka)溶解于15ml DMF(二甲基甲酰胺)中。逐步加入如下成分4.8g TOTU(Fluka)、1.6g的肟(羟亚氨基-cyanouceti acid-乙酸乙酯；Fluka)和5.5ml的NEM(4-乙基-吗啉)。置于室温下1小时后加入100ml乙酸乙酯稀释反应物并用水洗涤3次。有机相经硫酸镁干燥、过滤和蒸发。残余物经快速柱层析(乙酸乙酯/正庚烷2∶1)纯化。得到0.58g(41％)非晶体固体的产物8C45H45N3O6(723.8)MS(ESI+)724.4(M+H+)。
5-氨基-戊酸-{4-[3-(3-羟基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮杂环丁烷-1-基]-苯基}-酰胺(9)
将570mg(0.78mmol)产物8和0.8ml二乙胺溶解于5ml DMF(二甲基甲酰胺)中。置于室温下1小时后蒸发。残余物经快速柱层析(二氯甲烷/甲醇/浓氨水30∶10∶3)纯化。得到220mg(56％)非晶体固体的产物9C30H35N3O4(501.63)MS(ESI+)502.3(M+H+)。-苯基氨基甲酰基}-丁基氨基甲酰基]-乙基]-氨基甲酸-9H-芴-9-基甲基酯(11) 将200mg(0.40mmol)产物9和340mg(0.79mmol)的Fmoc-对叠氮基-Phe-OH 10(Bachem)溶解于4ml DMF(二甲基甲酰胺)并根据生成产物8的流程反应。得到300mg(82％)非晶体固体的产物11C54H53N7O7(912.07)MS(ESI+)912.5(M+H+)。
5-[2-氨基-3-(4-叠氮基-苯基)-丙酰氨基]-戊酸{4-[3-(3-羟基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮杂环丁烷-1-基]-苯基}-酰胺(12)
将300mg(0.33mmol)产物11和0.8ml二乙胺溶解于4ml DMF(二甲基甲酰胺)中并根据生成化合物9的流程反应。得到42mg(19％)非晶体固体的化合物12C39H43N7O5(689.82)MS(ESI+)690.3(M+H+)5-(2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸-[2-(4-叠氮基-苯基)-1-(4-{4-[3-(3-羟基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮杂环丁烷-1-基]-苯基氨基甲酰基}-丁基氨基甲酰基)-乙基]-酰胺(14) 将40mg(0.058mmol)的化合物12和60mg的D-生物素基-N-羟基琥珀酰亚胺13(Bachem)溶解于0.5ml DMF(二甲基甲酰胺)中。置于室温下1小时后蒸发。残余物经快速柱层析(二氯甲烷/甲醇/浓氨水30∶5∶1)纯化。得到29mg(55％)非晶体固体的化合物14C49H57N9O7S(912.12)MS(ESI+)916.6(M+H+)。
光亲和标记和结合研究通过技术人员已知的方法分离兔小肠刷状缘组织的小泡(vesicle)(Kramer等J.Biol.Chem.268，18035-18046(1993))。在Rayonet RPR-100型光化学反应器(购自″The Southern Ultraviolet Company，Hamden，CT″)上，用放射标记的本发明的式Ia)、式Ib)、式Ic)、式Id)或式Ie)化合物进行光亲和性标记实验。在20℃下，在200μl容积的10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)、100mM NaCl、100mM甘露醇中避光孵育刷状缘膜小泡(含有100-200μg蛋白)和化合物之一5分钟。也可用细胞器(尤其细胞膜)代替刷状缘小泡。在下文的说明中同样如此。避光孵育后用254nm紫外光照射20或60秒。然后用上述缓冲液将刷状缘小泡洗涤两次。可通过常用技术(如加入乙醇、盐或洗涤剂、加热、重复冷冻和融化或其他技术人员已知的适当方法)使蛋白沉淀并通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白分级。通过LSC或荧光X线照像术测定放射标记蛋白。刷状缘组织的标记蛋白对化合物的亲和力为1-100nM之间。
动物和细胞膜的制备任意给予体重4-5kg(Harlem Winkelmann，Borchem，Germany)的雄性新西兰白兔Altronin标准饲料C 2023(Altronin，Lage，Germany)。经Mg2+沉淀法制备胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠和肾的刷状缘膜小泡。根据标准技术制备大鼠肝脏微粒体和脂肪细胞膜。
胆固醇吸收抑制作用通过改良的Zilversmit/Hughes方法测定肠胆固醇的吸收。将规律喂养食物(Altronin，Lage，Germany)的雄性NMRI小鼠(Charles RiverDeutschland GmbH，Salzfeld，Germany)禁食12小时。通过管饲法每种动物给予0.5ml 0.5％甲基纤维素或5％Solutol(BASF，Ludwigshafen，Germany)作为载体的分别有或无3mg胆固醇吸收抑制剂的溶液，再给予0.25ml含有0.24μCi[14C]胆固醇和0.25μCi[3H]谷甾醇的Intralipid溶液(Pharmacia & Upjohn，Erlangen，Germany)。收集这些依旧新陈代谢的动物(每组5只小鼠)的排泄物。24小时后宰杀这些动物并通过燃烧分析来测定排泄物和肝脏的放射活性。
溶解145kDa的结合蛋白作为胆固醇吸收抑制剂光亲和标记后，将兔小肠刷状缘膜小泡用10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)或300mM甘露醇洗涤几次。在4℃下将所得的沉淀物在60分钟内溶解于10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)/75mM KCl/5mM MgCl2/1mMEGTA/1mM DTT/1％(w/v)正辛基葡萄糖苷/1％TritonX-100/1％(w/v)(“增溶缓冲液”)中，所得的蛋白浓度为1mg/ml。或者，在4℃下将膜蛋白在10分钟内溶解于10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)中，所得的蛋白浓度为10mg/ml，含有1％SDS，然后用10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)/1％正辛基葡萄糖苷1∶10稀释。离心后含有溶解膜蛋白的上清液与适当的含有1％正辛基葡萄糖苷作为洗涤剂的缓冲液混合、稀释用于柱层析。
将放射标记的145kDa结合蛋白用光敏2-氮杂环丁烷酮C-1光亲和标记后纯化作为胆固醇吸收抑制剂光亲和标记在20℃下，将取自兔回肠刷状缘膜小泡(250μg蛋白)的8份样品与66nM(0.3μCi)[3H]C-1的10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)/100mMNaCl/100mM甘露醇溶液避光孵育30分钟。在配有4RPR 2537灯的Rayonet RPR 100光化学反应器(The Southern Ultraviolet Company，Hamden，CT，USA)上于254nm波长处照射30秒，此后收集样品并在离心后将膜小泡再悬浮于2ml 10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)/300mM甘露醇中，在20℃下，在20分钟后离心。重复该步骤3次。用2ml“增溶缓冲液”溶解所得的沉淀物。离心后，取出40μl的上清液并用SDS PAGE分析，然后凝胶切片用于测定结合到膜蛋白中的放射性。
小麦胚芽凝集素亲和柱层析向含有溶解膜蛋白的上清液中加入0.5ml小麦胚芽凝集素琼脂糖凝胶。在20℃下30分钟后，通过离心收集珠状物并用2ml 10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)/100mM NaCl/100mM甘露醇/1％(w/v)正辛基葡萄糖苷洗涤3次。用4份2ml 10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)/100mM NaCl/100mM甘露醇/300mM N-乙酰基-D-葡萄糖胺洗脱吸收的蛋白；测定所有洗脱液中氨基肽酶N和蔗糖酶的活性，沉淀100μl等份中的蛋白并用SDS-PAGE分析。
羟基磷灰石柱层析用10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)/1％(w/v)正辛基葡萄糖苷将小麦胚芽凝集素柱层析的N-乙酰基葡萄糖胺洗脱液稀释10倍，并将它上样于羟基磷灰石柱层析(高10cm，直径1cm)，以0.25ml/min的恒定速度经10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)/1％(w/v)正辛基葡萄糖苷平衡该柱，以每份1ml收集。然后按如下方式洗脱蛋白10ml 10mM磷酸钠缓冲液(pH7.4)/1％(w/v)正辛基葡萄糖苷，随后进行如下梯度磷酸盐洗脱10-250mM的磷酸盐15ml、250-700mM的磷酸盐15ml以及700-1000mM的磷酸盐10ml。测定每一部分中的氨基肽酶N和蔗糖酶的活性以及放射性。每份取出100μl，沉淀蛋白并用SDS-PAGE分析，随后通过将凝胶切成2mm的切片测定放射标记的蛋白的分布。
制备性SDS凝胶电泳收集含有放射标记的145kDa蛋白的级分并用氯仿/甲醇沉淀蛋白。在SDS样品缓冲液(62.5mM Tris/HCI(pH6.8)2％SDS/5％/2-巯基乙醇/10％甘油/0.001％溴酚蓝)中溶解后，离心样品并将上清液置于制备性的7.5％SDS凝胶(直径28mm；分离凝胶的长度5cm)的分离凝胶上。在500V(40mM，6W)下进行电泳，将其分离为1.5ml级分。用SDS-PAGE分析每级分150μl的等份样品中的蛋白组成。
通过链霉抗生物素-生物素亲和柱层析纯化作为胆固醇吸收抑制剂的145kDa结合蛋白在20℃下，将取自兔回肠刷状缘膜小泡(200μg蛋白)的10份样品与200nM生物素标记的胆固醇抑制剂C-4的10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)/100mM NaCl/100mM甘露醇一起避光孵育30分钟，然后用配有4RPR 2537灯的Rayonet RPR 100光化学反应器于254nm波长处光照射30秒。收集小泡后，用2ml Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)/300mM甘露醇洗涤3次。在4℃下，将所得的沉淀物悬浮于2ml“增溶缓冲液”中1小时。离心后，将上清液与0.5ml链霉抗生物素琼脂糖珠混合并在4℃下持续搅拌2小时。离心后，在4℃下将珠与2ml 10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)/300mM甘露醇/1％正辛基葡萄糖苷/4mM PMSF/4mM碘代乙酰胺/4mM EDTA孵育10分钟，然后离心。重复该步骤2次后，用3份各2ml含有5mM生物素的上述缓冲液洗脱链霉抗生物素琼脂糖珠上的蛋白。取出各等份洗脱液，测定氨基肽酶N和蔗糖酶的活性并用SDS PAGE分析。如上所述，经制备性SDS凝胶电泳纯化得到含有145kDa共价键结合的结合蛋白(胆固醇吸收抑制剂)的生物素洗脱液。
酶裂解用氯仿/甲醇沉淀通过两种方法分离的145kDa蛋白并再溶解于3μlTris/HCl缓冲液(pH6.8)/6.2％SDS/0.5％2-巯基乙醇/0.0005％溴酚蓝中。在上述缓冲液中加入5μl刚刚制备的糜蛋白酶(35ng/ml)溶液并在30℃下孵育1小时进行酶裂解。通过加入含有4mM EDTA/4mM PMSF/4mM碘代乙酰胺的SDS样品缓冲液并在95℃下加热5分钟来终止反应，然后在Tris/Tricine凝胶上进行SDS-PAGE。
SDS凝胶电泳在垂直穿刺凝胶(vertical stab gel)(20×17×0.15cm)中进行SDS-PAGE，采用LE 2/4凝胶电泳装置(Amersham Pharmacia Biotech，Freiburg，Germany)，含有97.2％丙烯酰胺和2.8％N，N-亚甲基双丙烯酰胺，凝胶的浓度为7-10.5％，或者为了用于分析时，采用获自Novex的电泳装置Xcell II在pre-casted的NOVEX凝胶上进行(4-12％、12％或15％，Invitrogen(Groningen，The Netherlands))。根据Schggre & Jagow在Tris/Tricine凝胶(16.5％)中进行肽片段的电泳分离。电泳后，将凝胶用12.5％三氯乙酸固定，然后用Serva Blue R 250染色。为了便于测定放射性分布，将每个凝胶条切成2mm大小，用250μl的组织加溶剂Biolute S水解蛋白并用4ml Quickszint 501闪烁物进行液体闪烁计数。
用作胆固醇吸收抑制剂的145kDa结合蛋白的溶解作为胆固醇吸收抑制剂的145kDa结合蛋白纯化的先决条件是在非变性状态下使完整的膜蛋白充分溶解。采用各种洗涤剂进行的溶解试验表明约80-90％的光标记蛋白用SDS和约60％的光标记蛋白用Zwittergent 9-13可以溶解，用CHAPS、NP-40、毛地黄皂甙和Triton-X-114，无显著的溶解迹象。在10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)/300mM甘露醇中，1％的如Triton-X-100、正辛基葡萄糖苷、癸基麦芽糖苷、十二烷基麦芽糖苷或者胆固醇半琥珀酸酯/十二烷基麦芽糖苷的非离子洗涤剂仅可以使145kDa蛋白部分溶解，因此这些物质妨碍它的纯化。申请人发现了两种使145kDa蛋白溶解60-80％的方法，该种方法使得可以进行纯化步骤a)用1％的SDS增溶，随后用1％正辛基葡萄糖苷稀释到初始浓度为0.1％SDS/1％正辛基葡萄糖苷。b)用10mM Tris/Hepes缓冲液(pH7.4)/75mM KCl/5mMMgCl2/1mM EGTA/1mM DTT/1％TritonX-100/1％正辛基葡萄糖苷(“增溶缓冲液”)增溶。该增溶方法使得可以通过柱层析将刷状缘膜蛋白成功分离。
生物素标记的2-氮杂环丁烷酮光亲和探针的设计为了进行胆固醇吸收抑制剂标记蛋白的一步骤纯化，申请人将含有光不稳定基团生物素N-(生物素基)-4-叠氮基苯基丙氨酸经间隔基与胆固醇吸收抑制剂的2-氮杂环丁烷酮的N-苯基或苄氨基环的对位偶连。构效关系表明，该位置可以进行多种化学该性而在体内仍然保持抑制肠胆固醇吸收的能力。将生物素标记的光亲和标记C-4应用于NMRI鼠，肠胆固醇吸收呈剂量依赖性抑制，这表明了生物素标记的光不稳定的胆固醇吸收抑制剂的生物学作用，这是用该探针确定蛋白与肠胆固醇吸收有关的首要条件。用叠氮基苯甲酰基衍生物[3H]C-1光亲和标记的兔小肠BBMV，随着存在的生物素标记的胆固醇抑制剂C-4的浓度的增加导致标记的145kDa蛋白呈浓度依赖性降低，这表明C-4与在小肠细胞的刷状缘膜中作为胆固醇吸收抑制剂的145kDa结合蛋白具有特异性的相互作用。
用氚标记的2-氮杂环丁烷酮胆固醇吸收抑制剂C-1光标记的145kDa结合蛋白的纯化光标记的145kDa结合蛋白位于这样一种分子量区，即在进行SDS凝胶时，大量的刷状缘膜的膜蛋白(如蔗糖酶/异麦芽糖酶复合物或氨基肽酶N)发生迁移，从而使得可以分离这些蛋白并用于序列测定。生物化学研究表明，为糖基化的整合膜蛋白的145kD蛋白在用N-葡聚糖酶去糖基化后分子量从145kDa变为110kDa。因此，申请人研究了各种凝集素作为亲和柱层析假设的配体。用小麦胚芽凝集素琼脂糖可使光标145kDa蛋白得到充分的延后，但是洗脱后蔗糖酶和氨基肽酶N的酶活性仅为70-80％。用N-乙酰基葡糖胺可使放射标记的145kDa蛋白全部洗脱，而氨基肽酶N和蔗糖酶的活性仅为30-50％。大体上说来，可使作为胆固醇吸收抑制剂的145kDa结合蛋白浓集4-5倍。为了进一步纯化，可考虑一些不同的方法。在Mono Q或Mono S柱上进行离子交换柱层析，可使它从蔗糖酶/异麦芽糖酶中完全分离，但是仅从氨基肽酶N中部分分离，而用金属螯合的亲和柱层析无明显的分离。用羟基磷灰石柱层析，可使145kDa蛋白更浓集，并且能够从蔗糖酶和氨基肽酶中分离。选取最佳梯度的磷酸盐柱层析可使145kDa蛋白与其他膜蛋白几乎完全分离；高浓度磷酸盐洗脱145kDa蛋白，无明显的蔗糖酶或氨基肽酶N酶的活性。将羟基磷灰石柱层析取得的洗脱液经制备性SDS-PAGE进行最后的纯化。纯化145kDa蛋白的预计量为上样到羟基磷灰石柱的物质的1-3％，这表明就刷状缘膜而言浓集因子为＞150至＜500倍，而就肠细胞总蛋白而言浓集因子为2500-10000倍。
将生物素标记的光不稳定的胆固醇吸收抑制剂进行光亲和标记后，通过链霉抗生物素-生物素亲和层析纯化胆固醇吸收抑制剂的145kDa结合蛋白将兔小肠BBMV与200μM C-4共同孵育，通过254nm波长处的紫外线照射使其交联。溶解后，用链霉抗生物素珠萃取共价变性的蛋白(含有生物素标记的2-氮杂环丁烷酮胆固醇吸收抑制剂)。充分洗涤后，将结合蛋白用10mM生物素溶液洗脱并用SDS-PAGE分析。链霉抗生物素珠中主要保留了Mr 145kDa的蛋白，但是如果不进行紫外线照射的话则不能观察到蛋白，这表明对于生物素标记的光不稳定的胆固醇吸收抑制剂C-4来说，145kDa蛋白是主要的结合蛋白。从链霉抗生物素珠得到的生物素萃取物不含有可测得的蔗糖酶/异麦芽糖酶或者氨基肽酶N的活性，这表明洗脱的145kDa蛋白可能只存在一种蛋白，它是由生物素标记的胆固醇吸收抑制剂的共价结合而改性的。在用C-4光标记期间，在200μM的其他胆固醇吸收抑制剂(如依折麦布)的存在下，减少了由链霉抗生物素珠萃取的145kDa蛋白的量，这表明胆固醇吸收抑制剂与C-4直接竞争同样的结合位点；相反，其他肠营养物质胆汁酸、脂肪酸、葡萄糖、寡肽或氨基酸的转运蛋白底物不影响萃取的145kDa蛋白的量。用来自各种器官的细胞膜所作的标记实验表明，只有标记兔小肠-十二指肠、空肠和回肠的BBMV才可以萃取145kDa蛋白，而标记胃、盲肠、结肠、直肠、肾、肝的BBMV或脂肪细胞，则链霉抗生物素珠没有阻滞145kDa蛋白。因此，只能将来自吸收胆固醇的解剖位点(十二指肠、空肠和回肠)的145kDa结合蛋白纯化。在SDS凝胶上通过小麦胚芽凝集素和羟基磷灰石柱层析以及通过链霉抗生物素-生物素亲和柱层析纯化的145kDa蛋白之间没有区别。用糜蛋白酶进行酶裂解后，得到许多分子量为4-35kDa的肽类型几乎相同的肽，这表明，由两种方法纯化的145kDa蛋白相同，并且如果不除外还可能存在其他成分的话，则该蛋白为主要成分。
图1合成5-(2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸-[2-(4-叠氮基-苯基)-1-(4-{4-[3-(3-羟基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮杂环丁烷-1-基]-苯基氨基甲酰基}-丁基氨基甲酰基)-乙基]-酰胺(14)反应流程的第一部分图2合成5-(2-氧代-六氢-噻吩并[3，4-d]咪唑-6-基)-戊酸-[2-(4-叠氮基-苯基)-1-(4-{4-[3-(3-羟基-3-苯基-丙基)-2-(4-甲氧基-苯基)-4-氧代-氮杂环丁烷-1-基]-苯基氨基甲酰基}-丁基氨基甲酰基)-乙基]-酰胺(14)反应流程的第二部分。
权利要求
1.分离蛋白的方法，该方法包括a]提供生物材料，b]将来自a]的生物材料与光敏的化合物2-氮杂环丁烷酮共同孵育，所述2-氮杂环丁烷酮被放射标记并且能够与所述蛋白特异性结合，c]将生物材料溶解并去除细胞碎片，d]将上清液加至含有小麦胚芽凝集素琼脂糖的装置上，e]将来自d]的小麦胚芽凝集素琼脂糖的洗脱液上样于羟基磷灰石柱上，f]将来自e]的放射标记部分上样于制备性SDS-PAGE上，g]收集放射标记部分且可能沉淀。
2.根据权利要求1的方法，其中所述生物材料为肠组织或肠细胞培养液中的细胞或者取自人、大鼠、小鼠或兔的回肠的刷状缘细胞。
3.根据权利要求1的方法，其中所述光敏的2-氮杂环丁烷酮光化合物具有如下通式I的结构式I 其中R选自如下a)-e)基团中任一个a)-CH2NH-CO-CH3
4.分离胆固醇结合蛋白的方法，该方法包括a]制备生物材料，b]将来自a]的生物材料与光敏的胆固醇吸收抑制剂共同孵育，所述胆固醇吸收抑制剂被放射标记或生物素标记，c]将来自b]的生物材料溶解并去除细胞碎片，d]将上清液进行柱层析或者置于链霉抗生物素-琼脂糖上，e]将洗脱液置于SDS-PAGE上，f]分离、洗脱并且可能再折叠的大小为140-150kDa的蛋白。
5.根据权利要求4的方法，其中所述生物材料为取自肠组织或肠细胞培养液中的细胞或者取自人、大鼠、小鼠或兔的回肠的刷状缘细胞。
6.根据权利要求5的方法，其中所述生物素标记的光敏的胆固醇吸收抑制剂的结构如下
7.根据权利要求1-6的方法分离的能够与胆固醇吸收抑制剂特异性结合的蛋白。
8.根据权利要求7的蛋白，其中所述蛋白的大小为140-150kDa。
9.根据权利要求8的蛋白，其中所述蛋白的大小为145kDa。
10.根据权利要求8的蛋白，其中所述蛋白为糖基化蛋白。
11.权利要求7-10的蛋白和式I化合物形成的复合物式I 其中R选自如下a)-e)基团中任一个a)-CH2NH-CO-CH3
12.权利要求7-10的蛋白和下式结构的化合物组成的复合物
13.药物组合物，该组合物包括权利要求7-10的蛋白和用于配制药物的药学上可接受的化合物。
14.药物组合物，该组合物包括权利要求11或12的复合物和用于配制药物的药学上可接受的化合物。
15.权利要求7-10的蛋白在生产用于治疗高胆固醇相关疾病的权利要求13的药物组合物中的用途。
16.权利要求11和12的复合物在生产用于治疗高胆固醇相关疾病的权利要求14的药物组合物中的用途。
17.权利要求7-10的蛋白在鉴定抑制胆固醇吸收的化合物中的用途，其中a]提供含有权利要求7-10的蛋白的生物材料，b]提供化合物，c]使来自a]的生物材料与来自b]的化合物接触，d]测定由来自c]的生物材料所吸收的胆固醇的量，e]将d]的结果与对照实验组结果进行比较，其中对照实验组的胆固醇吸收量通过使与来自a]的生物材料具有相同种类和/或组织特异性、但是不与b)的化合物接触的生物材料进行测定，f]当细胞与b]的化合物接触后测定的胆固醇吸收量减少时，e]的结果表明化合物抑制胆固醇重吸收。
18.治疗高胆固醇相关疾病的药物，该药物含有权利要求17的方法鉴定的化合物以及药学上可接受的赋形剂。
19.权利要求18的药物，其中所述化合物的分子量在100-50 000Da之间。
20.权利要求19的药物，其中所述分子量在100-5000Da之间。
21.权利要求18的药物，其中所述化合物为胆固醇类似物或含有蛋白或肽或脂肪酸的化合物。
全文摘要
本发明描述了分离能够结合胆固醇和/或胆固醇吸收抑制剂的肠蛋白的方法。
文档编号A61K38/00GK1668642SQ03817332
公开日2005年9月14日 申请日期2003年7月28日 优先权日2002年8月6日
发明者W·克拉默, W·弗里克 申请人:安万特医药德国有限公司