专利名称：含有糖蛋白Ⅵ结构域的免疫粘附素的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种含有特定糖蛋白VI结构域的免疫粘附素。本发明的免疫粘附素可以通过以二聚体形式提供免疫粘附素的特定方法获得。本发明还涉及具有糖蛋白VI的免疫粘附素用于制备预防特定病人群体中动脉内血栓形成的药物的用途。此外，本发明还涉及具有糖蛋白VI的免疫粘附素用于制备预防和治疗动脉粥样硬化发展(atheroprogression)的药物的用途。本发明还涉及具有糖蛋白VI的免疫粘附素用于制备预防和治疗糖尿病患者动脉粥样硬化慢性发展的药物的用途。本发明还涉及由GPVI介导的血小板与活性血管内损伤粘附的抑制剂的体外和体内筛选方法。
急性冠状动脉或颈动脉综合征是西方社会导致死亡的主要原因。即使是在从这样的心血管事件中首次存活下来，许多病人仍然患有象血管内血栓形成这样导致进一步心肌梗死或中风的危及生命的并发症。
血管内血栓形成是血小板在血管内凝集的结果，血管内的血流由此可能被严重减弱或者甚至完全阻断。特别地，动脉粥样硬化斑块的破坏引发一串级联事件使动脉血栓形成和下游组织缺血达到高峰、导致象心肌梗死或缺血性中风这样的疾病。血管损伤的第一个反应是循环血小板粘附于暴露的内皮下基质蛋白质，这启动随后的血小板凝集。内皮下层的大分子成分中原纤维状胶原蛋白被视为最主要的血栓形成要素，因为它起着强血小板激活剂的作用并在体内和体外都支持血小板粘附(1-3)。
已被报道为推定的胶原蛋白受体的血小板膜蛋白可以分为那些通过与胶原蛋白结合型von Willebrand因子(vWf)而与胶原蛋白间接互作的血小板膜蛋白，包括GPIbα和整合蛋白αIIbβ3，和那些直接与胶原蛋白互作的血小板膜蛋白，包括GPVI、整合蛋白α2β1、和CD36(综述于(2))。只是在最近，血小板糖蛋白VI(GPVI)已经被鉴定为主要的血小板胶原蛋白受体(4)。GPVI是一个60-65kDa的I型跨膜糖蛋白VI，它属于免疫球蛋白超家族(5；6)。在人和小鼠血小板中GPVI与FcRγ-链在细胞表面形成复合物(7；8)。与GPVI结合的配体启动Fc受体g链ITAM基序的酪氨酸磷酸化从而引发经Syk激酶、LAT、SLP-76、和磷脂酶C的下游信号(9-13)。GPVI缺陷的血小板在体外表现出丧失由胶原蛋白诱导的粘附和凝集(4；14)。同样，功能阻断型抗GPVI单克隆抗体会减弱由于对胶原蛋白或胶原蛋白相关蛋白CRP的应答而产生的离体血小板凝集，其中胶原蛋白相关肽CRP模拟了胶原蛋白的三螺旋(15；16)。
已知由血小板凝集而产生的并发症问题可以通过施用血小板凝集抑制剂来进行解决。对于治疗急性冠状动脉综合征，象ReoPro这样的GP IIb/IIIa抑制剂显著改善病人的情况。然而，最近的临床试验meta-分析揭示，尽管优化了抗血栓干涉但却存有显著的死亡或心肌梗死风险(Boersma E，Harrington RA，Moliterno DJ，White H，TherouxP，Van de Werf F，de Torbal A，Armstrong PW，Wallentin LC，Wilcox RG，Simes J，Califf RM，Topol EJ，Simoons ML.Plateletglycoprotein VI IIb/IIIa inhibitors in acute coronary syndromesa meta-analysis of all major randomised clinical trials.Lancet2002；359189-98)。这种治疗方案的特别严重的副作用是出血并发症。它们以2.4％在患者中出现，并且最严重的颅内出血形式以0.1％出现于被治疗的患者中。已经揭示了几种解释次优效果和副作用的关于GP IIb/IIIa受体阻断的机制缺陷(Dickfeld T，Ruf A，Pogatsa-Murray G，Muller I，Engelmann B，Taubitz W，Fischer J，Meier O，Gawaz M.Differential antiplatelet effects of variousglycoprotein IIb-IIIa antagonists.Thromb Res.2001；10153-64.Gawaz M，Neumann FJ，Schomig A.Evaluation of platelet membraneglycoprotein VIs in coronary artery diseaseconsequences fordiagnosis and therapy.Circulation.1999；99E1-E11)。
对血小板凝集的抑制导致对血小板凝集能力的总体损伤。相应地，不仅使不期望的血栓形成收到影响，还影响了血小板终止出血的一般能力。因此，施用血小板凝集抑制剂固有地会导致象出血这样的可能进一步引起危及生命的并发症的严重副作用。这些副作用对于糖尿病患者当然更成问题。
糖尿病是动脉粥样硬化的主要风险因子。因此糖尿病在表现急性血管特别是冠状动脉综合征的患者中构成了一种增长的危及生命的并发症、以及额外发病率的风险。伴有不稳定心绞痛的糖尿病患者比非糖尿病患者呈现更高的溃疡斑和冠状动脉内血栓形成发生率。(Biondo-Zoccai GGL；Abbate A；Liuzzo G，Biasucci LAtherothrombosis，inflammation，and diabetes.J Am Coll Cardiol41；1071-1077；2003)。
人们日益认识到血小板是动脉粥样硬化进展的主要开关。升高的动脉粥样硬化进展与升高的血小板应答及糖尿病之间的关联迄今仍是未解决的问题。糖尿病人患急性血管并发症不依赖于动脉粥样硬化的程度，这一程度预示糖尿病急性血管并发症和动脉粥样硬化急性血管并发症发展过程中血小板活化的几种不同的目前未知的机制。
因此，本发明的问题是提供一种用于避免急性冠状动脉或颈动脉综合征后危及生命的并发症并保持血液止血潜能的药物。
本发明进一步的问题是，提供一种用于治疗或预防动脉粥样硬化进展的药物。
本发明进一步的问题还是提供一种用于治疗糖尿病、特别是糖尿病相关并发症的药物。
本发明进一步的问题是提供一种体外和体内筛选血小板与血管内损伤粘附的抑制剂的方法。
发明概述上述问题按照权利要求来解决。本发明提供第一项体内直接证据，该证据表明在血管损伤后的生理剪切压力下GPVI实际上是血小板募集过程中严格必需的。在不同的内皮剥落小鼠模型中，GPVI抑制或缺失都实质上废除了血小板-血管壁互作和血小板凝集，据此将GPVI鉴定为动脉血栓形成的主要决定因素。这预示着，对GPVI-配体互作的抑制预防动脉粥样硬化过程中的动脉血栓形成。本发明利用GPVI的一种特异可溶形式的抗血栓形成潜力。更确切地，提供了一种融合蛋白，它含有GPVI细胞外结构域和人N-末端Fc标签。人GPVI的这一可溶形式以高亲和力与胶原蛋白特异结合，使血小板在体外与固定的胶原蛋白、在体内与血管损伤位点的粘附减弱。因此，本发明是以以下认识为基础的动脉内血栓形成成为急性临床并发症的前提条件是血小板与血管壁中活性损伤的初始粘附。本发明人已经认识到，血小板经糖蛋白VI(GPVI)受体在血管壁损伤处与内皮下基质胶原蛋白的粘附是血栓形成的关键事件。因此，本发明融合蛋白对血小板粘附于内皮下基质胶原蛋白的抑制不仅能防止血小板粘附于活性损伤，而且能防止血小板在活性损伤处凝集。因此，可以有效地避免血管内血栓形成而不破坏血小板的一般凝集能力。
令人惊讶的是，根据内皮下层不同成分是象层粘连蛋白、纤连蛋白、von Willebrand因子(vWf)和胶原蛋白这样的血小板配体或激活剂这一事实，可以通过对单个血小板受体的抑制来抑制血栓形成这一复杂过程。此外，血小板上的大量受体已被体外考察鉴定，但是在体内影响血小板粘附于损伤的相关受体或受体组合在之前是未知的。
本发明还基于这一认识GPVI是动脉粥样硬化发展过程中血小板活性的主要介导物(meditor)。已经证实，对由胶原蛋白介导的GPVI活化的抑制会削弱易患动脉粥样硬化的Apo e-/-小鼠中的动脉粥样硬化进程(参见附图16)。此外还证实，也倾向于患进行性动脉粥样硬化和增强的血栓形成并发症的糖尿病患者的血小板显示GPVI-共受体Fc-受体的表达增强。因此，糖尿病患者的血小板或许在由于斑块破裂或内皮脱落而暴露于内皮下血管层的胶原蛋白的地方显示出对胶原蛋白刺激的增强应答，从而导致临床观察到不稳定心绞痛中增强的血栓形成并发症。
本发明因此提供对患者，尤其是糖尿病患者中动脉粥样硬化发展的治疗。此外，本发明提供治疗特别是糖尿病患者中象血管内血栓形成这样的急性血管并发症的药物。免疫粘附素Fc-GPVI-nt是一种减弱动脉粥样硬化进程以及减弱血小板经GPVI受体对胶原蛋白的增强应答的潜在治疗工具。因此，Fc-GPVI-nt是一种用于治疗动脉粥样硬化且特别是治疗糖尿病动脉粥样硬化并发症的药物。
该发明提供了一种含有下列片段的融合蛋白(Fc-GPVI-nt)(a)糖蛋白VI(GPVI)细胞外结构域或其具有胶原蛋白结合功能的变体，和(b)免疫球蛋白的Fc结构域或其功能保守性部分。
该融合蛋白的特征在于附图7所示的氨基酸序列。根据本发明的融合蛋白获自或可以获自以下方法(a)感染后2天收集已用编码附图7所示氨基酸序列的Fc-GPVI-nt腺病毒感染的Hela细胞培养物上清液；
(b)离心(3800g，30分钟，4℃)步骤(a)的上清液；(c)过滤(0.45μm)步骤(b)的上清液；(d)加入一倍体积的硫酸铵使免疫粘附素沉淀，并于4℃搅拌过夜；(e)离心(3000g，30分钟，4℃)使蛋白质成团，(f)将步骤(e)中的成团蛋白质溶于0.1倍体积的PBS，并在PBS中4℃透析过夜；(g)离心(3000g，30分钟，4℃)使蛋白质溶液澄清；(h)将步骤(g)中的溶液上载至蛋白质A柱(HiTrapTM蛋白质AHP，Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)；(i)用结合缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.0，0.02％ NaN3)洗涤柱直至OD280＜0.01；(k)用洗脱缓冲液(100mM甘氨酸pH2.7)将级分洗脱；(l)用中和缓冲液(1M Tris/HCl pH9.0，0.02％ NaN3)中和洗脱的级分；(m)合并级分；(n)4℃下将合并的级分在PBS中透析过夜，(o)将透析产物等分并于-20℃冷冻。
在上述条件下，融合蛋白以共价连接的二聚体形式获得，在非还原条件下用SDS-PAGE测定该二聚体的分子质量为160kDa。推测通过与GPVI片段相邻的特定结构域中的链间半胱氨酸二硫键来形成融合蛋白的二聚化，GPVI片段的氨基酸序列如附图7所示。融合蛋白的二聚体性质至少依赖在Fc部分和附图7所含的GPVI部分间的特定区域的存在以及制备方法。实践中将单体融合蛋白用作治疗性试剂是没有用的，因为为获得相似的效果，与二聚体融合蛋白相比的单体融合蛋白的内部结合特性要求其以比二聚体融合蛋白高出约一个数量级的量施用，参见附图9(e)。然而，从治疗和经济角度考虑，施用大量蛋白质是有问题的，尤其是对于慢性疾病的治疗。
本发明的融合蛋白是一种免疫粘附素。它具有一个片段(a)，该片段具有血小板GPVI细胞外结构域的功能。所述GPVI可以是哺乳动物GPVI，优选为人GPVI。所述功能优选为与GPVI配体胶原蛋白结合。GPVI的整个细胞外结构域或其任何片段可用于所述的融合蛋白，前提是所述片段能与胶原蛋白结合。融合蛋白变体可以在所述融合蛋白的一或数个氨基酸处有修饰(例如糖基化、磷酸化、乙酰化、形成二硫键、生物素化、象荧光素标记这样的显色标记，等)。优选，变体是所述融合蛋白的同源物。用本文公开的方法可以容易地测试工程化变体与胶原蛋白结合的能力。最优选，将SEQ ID No1残基1至267的多肽用作片段(a)。然而，也可以通过交换所选择的氨基酸或通过截短所述序列而不剥夺所述功能来修饰所述多肽。
所述融合蛋白的片段(b)至少满足以下目的从产生所述融合蛋白的细胞分泌融合蛋白、以能结合胶原蛋白的形式提供片段(例如折叠或凝集状态)、亲和纯化所述融合蛋白、用抗体识别所述融合蛋白、当融合蛋白用作药物时为其提供有利的特性。令人惊奇且最为重要的是，片段(b)允许所述融合蛋白在哺乳动物细胞中优选在人细胞中生产，并允许其以活性形式分泌至上清液中，即以能与胶原蛋白结合的形式。片段(b)最优选为免疫球蛋白的Fc结构域。适宜的免疫球蛋白是IgG、IgM、IgA、IgD、和IgE。IgG和IgA为优选。IgG为最优选。所述Fc结构域可以是整个Fc结构域或其功能保守性变体。如果一个Fc变体保留有至少一种上述所列的片段(b)的功能，那么它就是功能保守性的。最优选的是SEQ ID No.1残基273至504的多肽。然而，这样的多肽可以经修饰或截短而不使其丧失功能，这是一般常识。
本发明融合蛋白的片段(a)和(b)可通过接头连接。接头可由约1至100，优选1至10个氨基酸残基组成。
最优选，所述融合蛋白具有氨基酸序列SEQ ID No.1(本文称作Fc-GPVI-nt)。
本发明进一步提供编码本发明融合蛋白的核酸序列。所述核酸序列含有选自下组的序列(i)SEQ ID No2的核酸序列或其根据简并密码编码相同多肽的变体；(ii)编码与由SEQ ID No2编码的多肽具有至少70％同源性的多肽的核酸序列；(iii)编码至少300个氨基酸的多肽的核酸，其中具有至少100个氨基酸的片段其功能是结合胶原蛋白、具有至少200个氨基酸的片段其功能是作为Fc结构域；和(iv)编码权利要求1的融合蛋白的核酸序列。
本发明进一步提供预防或治疗动脉内血栓形成的药物，该药物包含含有糖蛋白VI细胞外结构域或其具有胶原蛋白结合功能的变体的蛋白质。优选地，所述蛋白质是本发明所述的融合蛋白质。如果所述药物含有所述融合蛋白，所述药物优选进一步包含适宜的载体。所述药物优选经非肠道途径、更优选经静脉内给药。正如已由本发明人所发现的，GPVI-胶原蛋白互作是血小板与受伤血管壁粘附的主要因素。本发明的融合蛋白能通过阻断暴露于血液的胶原蛋白而不抑制血小板的其它功能，来阻止血小板在血管系统中与所述暴露于血液的胶原蛋白结合。
作为选择，本发明的药物可以包含编码本发明所述融合蛋白的核酸以用于基因治疗。所述核酸优选包含上述定义的核酸序列。所述核酸优选包含在载体中，优选为病毒载体。可以将编码所述融合蛋白的载体导入病人的血管系统中，由此可以用其转导例如内皮细胞。适宜用于基因治疗的载体是本领域已知的。它们可以基于例如腺病毒、腺伴随病毒、逆转录病毒、或单纯疱疹病毒。根据病人的需要，可以修饰载体使转导细胞长期或短期表达融合蛋白。融合蛋白的Fc结构域使得融合蛋白由被转导细胞能以活性形式分泌。
本发明进一步提供体外筛选糖蛋白VI与胶原蛋白结合的抑制剂的方法，包括(i)提供暴露胶原蛋白的表面；(ii)在预先确定的允许所述融合蛋白与所述表面结合的条件下，将所述表面的一部分与本发明的融合蛋白接触；(iii)在与步骤(ii)相同的条件下将所述表面的另一部分与所述融合蛋白在测试化合物存在下进行接触；(iv)确定在所述测试化合物不存在和存在的情况下，与所述表面结合的所述融合蛋白的量；(v)如果与所述测试化合物不存在时相比该测试化合物存在时所述融合蛋白与所述表面的结合更少，则将该测试化合物鉴定为抑制剂；和(vi)可选地测定所述抑制剂对血小板凝集和/或血小板激活的功能效果。
步骤(i)的表面可以是用胶原蛋白包被的玻璃或塑料表面。所述表面的部分可以是滴定板或多孔板的板孔。暴露胶原蛋白的表面可以容易地如实施例中所述通过用胶原蛋白包被玻璃或塑料表面来制备。胶原蛋白包被的板或多孔板也可从商业获得。在步骤(ii)中，将预先确定量的所述融合蛋白与所述表面的第一个部分在允许融合蛋白与该表面结合的条件(特别是pH、缓冲液、温度)下接触。优选地，根据允许与所述表面的优化结合来选择条件。在步骤(iii)中，在预先确定量或浓度的测试化合物存在下，将表面另一部分与和步骤(ii)中相同量的融合蛋白、以及在相同条件下进行接触。可以使用测试化合物的不只一种量或浓度。步骤(iv)的所述确定优选包括，洗涤根据步骤(ii)和(iii)进行接触的所述表面部分一或多次以去除未结合的融合蛋白。之后可以通过例如测定与融合蛋白结合的荧光标记(例如荧光素、罗丹明，等)的荧光来确定已结合的融合蛋白的量。作为选择，已结合的融合蛋白可以用针对所述融合蛋白的抗体检测，其中所述抗体可以用荧光标记。作为选择，抗体可以用能产生显色或发光反应产物的酶(例如碱性磷酸酶、过氧化物酶、萤光素酶)标记。最方便的是，该融合蛋白可以用显色标记进行标记，这样与胶原蛋白结合后该标记会改变其光吸收或放射特征。在这种实施方式中，不需要洗去未结合的融合蛋白。
在步骤(v)中，可以鉴定抑制剂。已鉴定的抑制剂或其已选择部分可用作改进该抑制剂的引导结构。这样的引导结构可用化学方法进行修饰，经修饰的结构可再用该筛选方法进行测试。具有改进特性的经修饰结构或测试化合物可进行选择或可选地进一步经化学方法改变。以这种方式，可以实现对抑制剂的重复改进。用本发明筛选方法鉴定的抑制剂有用作对抗血栓形成和动脉粥样硬化的潜在药物的价值。
在步骤(vi)中，所述抑制剂对血小板凝集和/或血小板激活的功能效应可根据下述方法进行测定，例如活体荧光显微术。
依赖于所测试的测试化合物数量，可以小、中或大规模实施所述筛选方法。如果要测试许多测试化合物(例如化合物文库)，筛选方法优选采用高通量筛选形式(HTS)。对于HTS，优选用荧光标记的融合蛋白检测已结合的融合蛋白量。
也可用上述筛选方法筛选抑制GPVI与胶原蛋白结合的抗体，特别是对抗GPVI细胞外结构域的抗体。这样的抗体筛选可以与例如产生单克隆抗体的杂交瘤技术或其它任一产生抗体的技术相结合，由此优选将本发明的融合蛋白用作抗原。杂交瘤细胞上清液中的抗体可用作所述测试化合物。
本发明进一步提供用本发明的融合蛋白作为免疫原产生的抗体。此外，提供了针对GPVI的抗体用于制备预防血小板在活性动脉粥样硬化损伤中粘附于暴露的内皮下基质胶原蛋白而作为急性冠状动脉或颈动脉综合征启动开关的药物的用途。这样的适应症可以根据下述进行诊断。优选地，病人进一步以患有不稳定动脉粥样硬化斑块为特征。所述药物优选经非肠道途径给药。优选地，所述抗体为单克隆抗体。这样的抗体可以例如用本发明的融合蛋白作为免疫原进行制备。
此外，本发明提供体外筛选由GPVI介导的血小板与活性血管内损伤粘附的抑制剂的方法，所述方法包括步骤(i)提供暴露胶原蛋白的表面；(ii)在预先确定的允许血小板粘附于胶原蛋白的条件下，将所述表面与血小板接触；(iii)在测试化合物存在下测定血小板的粘附；和(iv)如果与所述测试化合物不存在时相比该测试化合物存在时血小板与胶原蛋白的粘附更少，则将该测试化合物鉴定为GPVI的抑制剂；和(v)可选地测定所述抑制剂对血小板凝集和/或血小板激活的功能效果。
该方法中使用的血小板可以根据已知的方法分离(参见实施例7)。它们可以分离自象小鼠、大鼠、兔、猪等这样的哺乳动物血液。优选地，它们分离自人。所述血小板可以用例如象荧光素这样的荧光染料标记。血小板对所述表面的粘附可以根据实施例中描述的进行测定。该方法的测试化合物可以是有机小分子。优选地，该方法的测试化合物是在上述筛选GPVI与胶原蛋白结合的抑制剂的方法中鉴定的抑制剂。以这种方式，可以显著减少将要用血小板筛选的化合物数量，而且可以提高发现对血小板有功能的抑制剂的可能性。
也提供了体内筛选由GPVI介导的血小板与活性血管内损伤粘附的抑制剂的方法，所述方法包括步骤(i)提供活性血管内损伤的体内模型；(ii)在测试化合物存在下测定血小板与活性血管内损伤的粘附，和(iii)如果与测试化合物不存在时相比在测试化合物存在下血小板与活性血管内损伤的粘附更少，则将该测试化合物鉴定为GPVI的抑制剂。
所述体内模型可以是适宜的哺乳动物例如小鼠、大鼠、兔，等。优选为小鼠。在测试化合物存在和不存在下测定血小板与活性血管内损伤的粘附之前，将优选已用荧光标记的血小板导入模型。所述测试化合物优选已经在上述体外筛选方法之一中鉴定为抑制剂。用实施例8中所述的体内荧光显微术实施血小板与活性血管内损伤的粘附。
本发明还提供融合蛋白用于制备治疗糖尿病的药物的用途，该融合蛋白包括(a)糖蛋白VI细胞外结构域或其具有胶原蛋白结合功能的变体，和(b)免疫球蛋白的Fc结构域或其功能保守性部分。
用于制备治疗糖尿病的药物的融合蛋白优选为二聚体融合蛋白。为提供二聚化的可能性，在本发明的融合蛋白结构域(a)和(b)间必需存在铰链区。该铰链区对于允许多肽链的适宜定向和链间二硫键的形成是必需的。因此，铰链区必需具备充足的长度并包含半胱氨酸残基，优选至少两个半胱氨酸残基。优选地，该融合蛋白包含SEQ IDNo1的残基1至267。该融合蛋白用于治疗糖尿病的急性并发症或治疗糖尿病患者中的慢性动脉粥样硬化进程。优选地，该融合蛋白为Fc-GPVI-nt。
本发明还提供制备本发明融合蛋白(Fc-GPVI-nt)的方法，它包括以下步骤(a)感染后2天收集已用编码附图7所示氨基酸序列的Fc-GPVI-nt腺病毒感染的Hela细胞培养物上清液；(b)离心(3800g，30分钟，4℃)步骤(a)的上清液；(c)过滤(0.45μm)步骤(b)的上清液；(d)加入一倍体积的硫酸铵(761g/l)使免疫粘附素沉淀，并于4℃搅拌过夜；(e)离心(3000g，30分钟，4℃)使蛋白质成团，(f)将步骤(e)中的成团蛋白质溶于0.1倍体积的PBS，并在PBS中4℃透析过夜；(g)离心(3000g，30分钟，4℃)使蛋白质溶液澄清；(h)将步骤(g)中的溶液上载至蛋白质A柱(HiTrapTM蛋白质AHP，Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)；(i)用结合缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.0，0.02％ NaN3)洗涤柱直至OD280＜0.01；(k)用洗脱缓冲液(100mM甘氨酸pH2.7)将级分洗脱；(l)用中和缓冲液(1M Tris/HCl pH9.0，0.02％ NaN3)中和洗脱的级分；(m)合并级分；(n)4℃下将合并的级分在PBS中透析过夜，(o)将透析产物等分并于-20℃冷冻。
附图1C57BL6/J小鼠体内总颈动脉血管损伤后血小板的粘附和凝集。(a)血管损伤前(左列)和2小时后(右列)的颈动脉扫描电镜显微图。内皮剥落诱导血小板粘附和凝集，导致血小板富集(左下图)的血栓形成。(b)血管损伤5分钟后用体内原位颈总动脉荧光显微术调查血小板-内皮细胞互作(黑柱)。以没有血管损伤的动物作对照(空柱)。左和右列分别概括了各组八个试验的瞬间和稳定血小板粘附。血小板根据它们与所述24内皮细胞系的相互作用进行分类，并以每mm2的血管表面给出。平均值±s.e.m.，星号表示与对照相比的显著差异，P＜0.05。(c)血管损伤后的血小板凝集根据体内荧光显微术测定(黑柱)。以没有血管损伤的动物作对照(空柱)。平均值±s.e.m.，各组n＝8，星号表示与野生型小鼠相比的显著差异，P＜0.05。显微照片(右)显示对照动物中(上图)或血管损伤后(下图)的典型荧光显微镜图像。白箭头指示粘附的血小板。
附图2对GPVI的抑制废除了血管损伤后的血小板粘附和凝集。(a)用活体内视频荧光显微镜检测血管损伤后的血小板粘附。荧光血小板与50μg/ml抗-GPVI(JAQ1)Fab片段或对照大鼠IgG预孵育。未经mAb预孵育的血小板用作对照。左图和右图分别概括了瞬间和稳定血小板粘附。平均值±s.e.m.，各组n＝8，星号表示与对照相比的显著差异，P＜0.05。(b)图示了在初始粘连/缓慢表面易位后形成不可逆粘附的血小板百分数。(c)体内血管损伤后的血小板凝集。根据用所述的荧光显微镜评估与tyrodes、无关大鼠IgG、或抗-GPVI Fab(JAQ1)预孵育的血小板凝集。平均值±s.e.m.，各组n＝8，星号表示与对照相比的显著差异，P＜0.05。(d)显微照片显示阐明在不存在或存在抗GPVI Fab(JAQ1)或对照IgG时血小板粘附的代表性体内荧光显微镜图形。
附图3GPVI缺陷型小鼠中内皮脱落后的血小板粘附。(a)经JAQ1处理的小鼠缺乏GPVI。上图将经无关对照IgG(左)或抗GPVI(JAQ1)(右)预处理的小鼠的血小板于室温下与FITC标记的JAQ1和PE标记的抗小鼠CD41孵育10分钟，并直接在FACScanTM上分析。给出了每组3只小鼠的代表性点杂交印迹。下图在非还原条件下用SDS-PAGE对三个对照IgG或JAQ1处理的小鼠的全血小板溶解产物进行分离，并用FITC-标记的JAQ1进行免疫印迹，之后与HRP-标记的兔抗-FITC mAb孵育。(b)对照动物(上图)或GPVI缺失小鼠(下图)中血管损伤2小时后的颈动脉扫描电子显微图。对照动物中内皮脱落诱导了血小板粘附和血小板凝集。相反，在GPVI缺失小鼠中只有非常少的血小板沿受损血管壁附着。沿剥落区可见内皮下胶原蛋白纤维。(c)血小板粘连和稳定的血小板粘附，(d)初始粘连向稳定捕获的转换(粘连的血小板的百分数)，和(e)在GPVI缺陷(JAQ1预处理的小鼠)或对照IgG预处理的小鼠中测定了颈动脉血管损伤后的血小板凝集(详见材料和方法)。该图概括了各组八个试验中的血小板粘附(瞬间的和稳定的)以及血小板凝集。平均值±s.e.m.，星号指示与对照IgG相比的显著差异，P＜0.05。(f)显微照片显示，阐明GPVI缺陷(JAQI)和对照IgG处理的小鼠中血小板粘附的代表性体内荧光显微镜图形。
附图4离体评估在生理流条件下血小板对经胶原蛋白包被的玻璃盖玻片表面的粘附。左图在生理流条件下调查来自经无关对照IgG免疫粘附素(对照)(左)或抗GPVI免疫粘附素(Fc-GPVI-nt)(右)预处理小鼠的血小板。在各试验末期经FACS对洗涤过的盖玻片计数来评估血小板数量。流式条件下于30秒后评估作为血小板粘附第一步的血小板粘连(tethering)，5分钟后评估稳定的血小板粘附。(详见实施例6)。图版概括了各组八个试验中的瞬间和稳定血小板粘附。平均值±s.e.m.，星号指示与对照IgG相比的显著差异，P＜0.05。
附图5在一项以ELISA为基础的检测中监控Fc-GPVI-nt与胶原蛋白的相互作用。调查了由GPVI细胞外结构域和IgG Fc部分组成的免疫粘附素Fc-GPVI-nt与经胶原蛋白包被的板间的粘附，其中Fc-GPVI-nt和浓度逐渐升高(0.5μg到10μg)。用针对Fc-GPVI-nt的Fc部分的并且经过氧化物酶标记的二级抗体将这一结合可视化。最后用ELISA探测过氧化物酶。在该代表性试验中，Fc-GPVI-nt与胶原蛋白的结合用充分的亲和力进行控制，在μg浓度处达到饱和。
附图6用抑制性抗小鼠GPVI抗体JAQ1证实Fc-GPVI-nt与胶原蛋白间的相互作用和筛选GPVI抑制剂的可能性。Fc-GPVI-nt(2μg/孔)与胶原蛋白包被的ELISA板间的粘附被显示为特异性的单独免疫粘附素Fc-nt不显示任何结合。因此，这为以上升至高通量能力的潜力来筛选针对GPVI抑制剂提供了以ELISA为基础的检测方法。
附图7Fc-GPVI-nt的氨基酸序列SEQ ID No1。
附图8免疫粘附素Fc-GPVI-nt的DNA序列SEQ ID No.2。碱基1至807编码GPVI细胞外结构域。碱基817至1515编码IgG的Fc部分。
附图9GPVI-Fc的表征。(a)上图Fc-GPVI-nt和缺少细胞外GPVI结构域的对照Fc用于还原条件下的SDS-PAGE。考马斯蓝染色(左)以及与过氧化物酶耦联的山羊抗人Fc抗体的免疫印迹(右)将Fc-GPVI-nt分子量鉴定为～80kDa。中图用抗-GPVI单克隆抗体5C4与Fc、Fc-GPVI-nt、或人血小板进行的免疫印迹。5C4检测到了腺病毒表达的Fc-GPVI-nt融合蛋白和血小板GPVI，但是不检测对照Fc。下图还原(右)和非还原(左)条件下的分子量。尽管在还原条件下Fc-GPVI-nt的分子量约为80kDa，在非还原条件下完整nt鉴定为～160kDa的蛋白质。(b-d)Fc-GPVI-nt胶原蛋白互作的表征。(b)用不同浓度的可溶Fc-GPVI-nt和固定化胶原蛋白(10μg/ml)完成结合检测以定义Fc-GPVI-nt-胶原蛋白互作。结合的Fc-GPVI-nt用抗-Fc mAb抗体(1∶10000稀释)进行了检测，并以相对于在10μg/mlFc-GPVI-nt处观察到的结合给出。Fc-GPVI-nt以可饱和方式与胶原蛋白结合。平均值±s.e.m.，n＝6个Fc-GPVI-nt浓度，星号指示与0μg/ml Fc-GPVI-nt相比的显著差异，P＜0.05。(c，左图)显示Fc-GPVI-nt(20μg/ml)与各种底物的结合。Fc-GPVI-nt与BSA(10μg/ml)或vWF(10μg/ml)的结合以GPVI-二聚体与固定化胶原蛋白的结合的百分数给出。BSA或vWF未出现与Fc-GPVI-nt的结合，这支持Fc-GPVI-nt的结合特异性。平均值±s.e.m.，星号指示与胶原蛋白相比的显著差异，P＜0.05。(c，右图)图示了Fc-GPVI-nt(20μg/ml)或Fc(20μg/ml)与固定化胶原蛋白(10μg/ml)的结合。结合的Fc-GPVI-nt或Fc用抗-Fc mAb抗体(1∶10000稀释)进行了检测，并以相对于观察到的Fc-GPVI-nt结合给出。只有Fc-GPVI-nt，而不是Fc或抗-Fc mAb与固定化的胶原蛋白结合。平均值±s.e.m.，各组n＝8，星号指示与Fc-GPVI-nt结合的显著差异，P＜0.05。(d)Fc-GPVI-nt(20μg/ml)与不同浓度的可溶胶原蛋白预孵育10分钟。孵育后洗涤板，并用过氧化物酶耦联的山羊抗人IgG抗体(1∶10000稀释)检测Fc-GPVI-nt结合。Fc-GPVI-nt的结合以相对于不存在可溶胶原蛋白时观察到的结合给出。可溶性胶原蛋白以剂量依赖方式抑制GPVI-Fc-二聚体-二聚体与固定化胶原蛋白的结合。平均值±s.e.m.，n＝3个胶原蛋白浓度，星号指示与0mg/ml胶原蛋白相比的显著差异，P＜0.05。(e)通过直接比较来评估GPVI-Fc融合蛋白单体形式与Fc-GPVI-nt间的结合亲和力差异。在用1型胶原蛋白包被的ELISA板上评估单体和二聚体的结合。升高的GPVI融合蛋白浓度以可饱和方式与胶原蛋白结合。此处，亲和评估给出了一个LinewaverBurke图(e)。单体GPVI融合蛋白的亲和力比等摩尔浓度二聚体形式Fc-GPVI-nt约低10倍。
附图10Fc-GPVI-nt抑制CD 62P在人血小板上的激活，这一激活被看作通过提高胶原蛋白的剂量从α颗粒释放细胞内递质的参数。人血小板分离自全血并与PE标记的抗-CD 62抗体孵育(详见材料和方法)。在Becton Dickenson FACS装置中检测荧光。示出代表性柱形图。在对照Fc蛋白(100μg/ml；蓝线)存在下，从0至10μg/ml逐渐升高的胶原蛋白浓度诱导了荧光的转变。在Fc-GPVI-nt(100μg/ml；红线)存在下，荧光的转变及由此的CD 62P激活被显著抑制。
附图11Fc-GPVI-nt对由胶原蛋白介导的血小板凝集和内源递质从致密和α颗粒中释放的特异性抑制。(a)将人血小板与对照Fc(80μg/ml)或Fc-GPVI-nt(80μg/ml)孵育。用胶原蛋白(1μg/ml)或ADP(5μM)或TRAP(10μM)诱导血小板凝集，并于搅拌条件下在凝集测量器(aggregometer)中测定凝集(详见材料和方法)。作了三次从n＝5个不同血液供体的测定。平均值±s.e.m以相对于不含融合蛋白的对照凝集的凝集百分比给出。(b)与对照Fc(80μg/ml)或Fc-MGPVI-nt(80μg/ml)孵育后在同一探测器中同时测定ATP释放。ATP释放量以不含融合蛋白的对照的百分比给出。(c)在基本条件下、并用胶原蛋白(20μg/ml)刺激后用特异于人PDMGF的ELISA系统测定人血小板中的PDMGF释放(详见材料和方法)。与对照Fc的预孵育对从经胶原蛋白刺激的血小板中释放PDMGF没有显著影响，而Fc-MGPVI-nt(100μg/ml)显著降低PDMGF释放。在未经刺激的血小板中未出现对PDMGF释放的抑制。
附图12Fc-GPVI-nt对离体人类血液的流血时间没有显著影响。ADP/胶原蛋白刺激和肾上腺素/胶原蛋白刺激后在PFA-100装置中离体测定人血液的流血时间。Fc-GPVI-nt(5和20μg/ml)和Fc(5和20μg/ml)不会延长流血时间，而两种条件下治疗相关浓度(5μg/ml)的ReoProR最大限度地延长流血时间。概括了从n＝4个血液供体三次测定的平均值±s.e.m.。
附图13Fc-GPVI-nt在流式条件(flow condition)下抑制血小板粘附于固定化的胶原蛋白。人血小板(2×108细胞/ml)分离自全血(详见材料和方法)。将板用固定化的胶原蛋白(10μg/ml)或vWF(10μg/ml)包被。在平行板流式腔中在Fc-GPVI-nt或缺乏细胞外GPVI结构域的Fc(200μg/ml)存在下检测血小板与包被板的粘附。Fc-GPVI-nt对血小板粘附的抑制以对照(Fc对照)的百分比给出。在剪切率分别为500秒-1和1000秒-1时，Fc-GPVI-nt显著削弱血小板在固定化胶原蛋白上的粘附。相反，Fc-GPVI-nt未影响血小板在固定化vWF上的粘附。平均值±s.e.m.，各组n＝4，星号指示与对照Fc相比的显著差异，P＜0.05。下图显示代表性的显微图像。
附图14腹膜内注射至小鼠体内后，Fc-GPVI-nt具有延长的血浆半衰期以及有利的药物代谢动力学。用特异性抗Fc抗体和ELISA测定Fc-GPVI-nt的血液浓度(详情请参见材料和方法)。(a)单次Fc-GPVI-nt腹膜内注射(4μg/g)导致Fc-GPVI-nt在24小时后快速达到峰值血液浓度，其后Fc-GPVI-nt血液浓度缓慢降落。示范了来自10种动物的平均值±s.e.m.。(b)重复腹膜内应用(10μg/g；每周两次)导致Fc-GPVI-nt在小鼠体内连续累积超过28天。示范了来自6种动物的平均值±s.e.m.。(c)每只小鼠静脉内单剂量注射30μgFc-GPVI-nt(1μg/g体重)、60μg(2μg/g体重)和100μg Fc-GPVI-nt(3μg/g体重)导致剂量依赖性的免疫粘附素血浆浓度升高。在这些小鼠体内两个较高剂量下的血浆浓度在5至60分钟时达到延长的提升水平，24小时后足够有效清除胶原蛋白及由此有效抑制血小板上GPVI受体的激活。示范了来自5种动物的平均值±s.e.m.。
附图15Fc-GPVI-nt在体内对血小板粘附和凝集的效果。(a)小鼠(各组n＝6)用2mg/kg或4mg/kg Fc-GPVI-nt静脉内处理。将经Integrilin(0,2mg/kg)处理的小鼠用作阳性对照(n＝8)。根据所述方法(参见材料和方法)测定流血时间。与对照动物相比Fc-GPVI-nt融合蛋白未曾提高尾部流血时间。在经Integrilin处理的小鼠，尾部流血时间被大大延长。**P＜0.05vs.对照。(b)对GPVI的抑制废除了血管损伤后血小板的粘附和凝集。用活体视频荧光显微术测定血管损伤后的血小板粘附。小鼠用1或2mg/kg Fc-GPVI-nt或等摩尔量的对照Fc预处理。左和右图分别概括了血小板粘连和稳定血小板粘附。平均值±s.e.m.，各组n＝5，星号指示与Fc相比的显著差异，P＜0.05。(c)Fc-GPVI-nt对体内血管损伤后血栓形成的影响。根据所述用荧光显微术评估了血小板血栓数量(右)和总血栓区域(左)。平均值±s.e.m.，各组n＝5，星号指示与Fc相比的显著差异，P＜0.05。(d)显微照片显示代表性的体内荧光显微图像，这些图像图示了在1或2mg/kg Fc-GPVI-nt或对照Fc存在下的血小板粘附。标尺代表50μm。(e)在经Fc或Fc-GPVI-nt处理过的动物中血管损伤1小时后的颈动脉扫描电镜图。在经Fc处理过的小鼠中，内皮脱落诱导血小板粘附和血小板凝集。相反，在经Fc-GPVI-nt处理过的小鼠中仅有非常少的血小板沿受损血管壁附着。沿脱落区域可见内皮下胶原蛋白纤维。标尺代表10μm。(f)Fc-GPVI-nt特异性结合于颈动脉内皮下层。在经过氧化物酶耦联的山羊抗人IgG抗体染色的颈动脉切片上检测到Fc-GPVI-nt与内皮下层的这一结合。将获自经Fc-处理的小鼠的颈动脉用作对照。根据棕色染色的指示，在内皮下层检测到了Fc-GPVI-nt而非Fc对照蛋白。原始放大100倍。
附图16Fc-GPVI-nt显著减弱apo e-/-敲除小鼠体内的动脉粥样硬化进程。Apo e-/-小鼠用Fc-GPVI-nt(4μg/g)或对照Fc(4μg/g)腹膜内处理四周，每周两次。用苏丹红对大血管染色以使粥样斑和斑块形成可视化后，mortem后调查动脉粥样硬化进程。在对照动物中，特别是分支区域中的红色指示颈动脉标本广泛的斑块形成。在经Fc-GPVI-nt处理的动物中，apo e-/-小鼠颈动脉中的动脉粥样硬化几乎完全被废除了。显示了用Fc-GPVI-nt(左侧)处理四周后的apoe-/-小鼠和用对照Fc蛋白(右侧)处理四周后的apo e-/-小鼠的有代表性的肉眼可见的整个颈动脉血管标本。
附图17从糖尿病患者新鲜分离的血小板显示降低的纤维蛋白原受体(CD61，顶部)表达、和增强的Fc受体(CD32，中间)表达以及由此而增强的GPVI的表达。CD32表达与GPVI表达(由特异性单克隆抗体4C9检测)间的相关性显示在人血小板上(底部)。人血小板分离自糖尿病患者的全血，并与荧光标记的抗-CD61和抗CD32抗体或FITC标记的4C9抗体孵育。在Becton Dickenson FACScalibur装置中检测荧光。概括了来自n＝11名患糖尿病的病人和来自n＝363名未患糖尿病的病人的平均值+/-s.e.m.。计算CD32荧光与4C9荧光的相关性，相关系数r＝0.516。
附图18基于Fc-GPVI-nt的单体融合蛋白的氨基酸序列。
发明详述以前的一种假说曾提出，与von vWf结合的血小板糖蛋白VI(GP)Ib将流动的血小板招募至受伤血管壁(Ruggeri，Z.M.Mechanismsinitiating platelet thrombus formation.Thromb.Haemost.1997；78，611-616)，而内皮下纤维状胶原蛋白支持血小板的稳定粘附和激活(van Zanten，G.H.等人，Increased platelet deposition onatherosclerotic coronary arteries.J Clin.Invest 1994；93，615-632；Clemetson，K.J.& Clemetson，J.M.Platelet collagenreceptors.Thromb.Haemost.2001，86，189-197)。然而，本发明通过对小鼠颈动脉的荧光电子显微术证实，内皮糜烂后对主要血小板胶原蛋白受体GPVI的抑制或使其缺失反而废除血小板-血管壁间的互作。出乎意料的是，对GPVI的抑制使血小板在内皮下层上的粘连和粘附降低约89％。此外，在这些条件下基本上废除了对血小板的稳定捕获和凝集。在这些过程中严格需要GPVI，这在GPVI缺陷型小鼠中得到证实，这些小鼠中血小板也未能附着和凝集到受损血管壁上。这些发现揭示了GPVI在引发血小板附着至血管损伤部位中的一种意想不到的作用，并明确地将血小板-胶原蛋白互作鉴定为由动脉血小板诱导的动脉粥样硬化并发症的主要决定因素。
GPVI通常作为内皮下基质胶原蛋白的受体起作用，这一事实已经得到描述(Moroi M，Jung SM，Okuma M，Shinmyozu K.A patient withplatelets deficient in glycoprotein VI that lack bothcollagen-induced aggregation and adhesion.J Clin Invest 1989；841440-1445)。这些作者描述了体外源自GPVI受体缺陷病人的血小板的特征。然而，胶原蛋白与GPVI受体在体内环境中的互作的生理重要性、以及GPVI受体对血管损伤后粘附的相对贡献是未知的。特别是，不知道对该受体的抑制会抑制血管内血栓形成中的关键步骤——即血小板粘连。本发明揭示了，GPVI受体是血小板在体内经内皮下基质胶原蛋白粘附至内皮下层的必需受体。在各种其它血小板表面受体蛋白例如GPIb(von Willebrand受体)、αIIβ3整合素受体、α2β1整合素或GPV受体中，我们已经令人惊讶地将GPVI受体鉴定为介导血小板粘附至血管壁的必需受体。由于血小板粘附是在生理剪切压力下血小板凝集和动脉内血栓形成的第一个且最为重要的步骤，因此以下导致动脉内阻塞的有害效果是心肌梗死或脑中风临床综合征的功能性基础。在慢性情况下，血小板和内皮的相互作用促进动脉粥样硬化的早期步骤。我们的发明还第一次显示，GPVI受体在几个血小板表面蛋白的复杂种类中对最初的血小板粘附和动脉粥样硬化发展中的慢性血小板-内皮互作起关键作用。
WO 01/16321和WO 01/00810公开了人GPVI受体的DNA和蛋白质序列。然而，内皮损伤对血小板粘附和激活的重要性还未曾在体内背景中得到证实。
US 6,383,779公开了GPVI融合蛋白。然而，该文献并未公开二聚体融合蛋白或GPVI的任何治疗效果。
近来，调查了体外灌注的条件下人造胶原蛋白上的血小板-胶原蛋白互作的不同相(Moroi M，Jung SM，Shinmyozu K，Tzomiyama Y，Ordinas A和Diaz-Ricart M.Analysis of platelet adhesion tocollagen-coated surface under flow conditionsthe involvementof glycoprotein VI in the platelet adhesion.Blood 1997；882081-2092)。该研究的作者已经指出剪切压力条件下胶原蛋白-GPVI互作的重要性。然而，在该体外人工环境下无法研究内皮下基质胶原蛋白与粘附的相关性。作为他们的体外模型的有限相关性的结果，上述研究的作者得出结论认为，GPVI受体涉及血小板激活而不涉及血小板对内皮的粘附。相反，von Willebrand GPIb受体显著涉及血小板-内皮下层互作。在一份对现有文献的综述里，这些作者汇集了所有可获得的关于血小板-胶原蛋白互作的信息。之前，Moroi M和Jung，SM(Platelet receptors for collagen.Thromb.Haemost.1997；78439-444)已经讨论了为血小板粘附和血栓形成而发生的胶原蛋白纤维与血小板上不同的胶原蛋白受体间的互作。然而，作者并未预计在临床相关的体内环境中GPVI受体对于粘附的相关作用，因为他们不能确认不同胶原蛋白受体对粘附过程的重要性。
因此，本发明提供抑制血小板-内皮下层互作和血小板粘附相关靶物而不激发出不期望的出血并发症副作用这一问题的解决办法。除了熟知的经GPVI受体的胶原蛋白-血小板互作，我们可以提供根据体内血小板粘附测定的天然内皮下基质与血小板互作的资料。接着，我们可以证实GPVI-内皮互作作为血管内血栓形成最初步骤对于血小板粘附的重要性。因此，我们的发明解决用有效的抗血小板药物治疗血小板粘附的重要问题而不带有不期望的副作用问题。
进一步，本发明提供一种免疫粘附素(本发明的融合蛋白)。在一个特定实施方式中，该免疫粘附素由GPVI受体细胞外结构域和IgG免疫球蛋白(Fc-GPVI-nt)的Fc部分一起组成。这一新融合蛋白以约50％的以前公开的GPVI原始DNA序列为基础。该免疫粘附素的蛋白质结构是新的，因为该重组融合蛋白不形成象GPVI受体那样的膜蛋白，而是一种由各自宿主细胞释放的可溶的、免疫球蛋白样免疫粘附素。该免疫粘附素可以阻断胶原蛋白与GPVI的配体-受体互作。我们的结果证实，该免疫粘附素对由胶原蛋白刺激诱导的血小板主要生理功能有显著影响。胶原蛋白诱导的凝集、粘附和释放功能能被该免疫粘附素以与特异性单克隆抗体相同的程度抑制。然而，这一机制是不同的抗体通过与GPVI受体的配体结合位点直接结合来抑制GPVI激活，而该免疫粘附素清除GPVI配体胶原蛋白并由此防止由配体介导的GPVI激活。
本发明的免疫粘附素是新的GPVI抑制剂。它具有通过配体清除而选择性抑制由GPVI介导的效应的激活支路的优势。次级效应，象由抗体介导的对GPVI受体内化的效应，被阻止。Fc-GPVI-nt可用于治疗由带有斑块破裂或内皮损伤的不稳定动脉粥样硬化斑块引起的动脉粥样硬化并发症。因此，免疫粘附素Fc-GPVI-nt用作由胶原蛋白介导的GPVI激活的治疗性抑制剂而不影响GPVI受体对相关信号系统的内在活性。
此外，GPVI免疫粘附素用作抗体选择的一种理想的表位。Fc部分使得可以对蛋白质进行方便的纯化以及将其固定到表面以对抗体文库(即通过噬菌体展示)进行大规模抗体选择。这一选择可以选择性筛选针对具有与天然蛋白质相似的结构、代表完整蛋白的相关表位的抗体。
最后，Fc-GPVI-nt是筛选GPVI受体激活的抑制剂的重要工具。我们已经建立了一种以ELISA-为基础、通过以经胶原蛋白预包被的板为配体模拟胶原蛋白GPVI互作的体外检测方法。这种检测方法也可以用荧光标记的Fc-GPVI-nt进行，且由此可以扩展为高通量形式。这种检测方法可以通过荧光测定来筛选抑制性抗体或具有抑制GPVI功能的潜力的小分子。用这种无细胞筛选检测方法，已经为药物测试建立了一种可高通量化的荧光筛选检测方法的原型方法。
基于近来通过血管内超声或核磁共振成像在成像技术中的发展，有可能鉴定动脉粥样硬化患者是否处于象急性冠状动脉或颈动脉综合征这样的急性临床并发症的危险之中，由此急性损伤会成为患者血管内血栓形成的可能原因。因而，借助本发明有可能通过施用含有针对血小板糖蛋白VI(GPVI)的抗体来预防血管内血栓形成而不带有不期望的副作用。
活性损伤是以内皮下基质胶原蛋白的暴露和血小板活化为特征的。可以通过例如血管内超声或温度记录(例如，Fayed和Fuster，Clinical imaging of the high-risk or vulnerable atheroscleroticplaque.Circulation 2001；89305-316)或核磁共振成像(Helft等人，Progression and Regression of Atherosclerotic Lesions.Circulation 2002；105993-998)来调查这样的损伤的出现。这样的损伤在急性冠状动脉或颈动脉综合征患者中是极有可能产生的，例如心肌梗死或中风这样的急性临床并发症的复发风险是很高的，这种风险随着与首次事件的时间间距延长逐渐降低。
因此，本发明提供一种治疗患有急性冠状动脉或颈动脉综合征的病人的方法，所述方法包括以下步骤以避免血管内血栓形成(a)确定病人体内存在或不存在活性血管内损伤；和(b)如果存在血管内损伤则用针对血小板糖蛋白VI(GPVI)的抗体治疗病人。
此外，基于本发明，有可能治疗由于复杂动脉粥样硬化斑块破裂而处于血管内血栓形成风险的病人。这一破裂还会使内皮下胶原蛋白基质暴露。动脉内血栓形成的一个后果是，上述重要的、危及生命的临床综合征阻断对重要器官的灌注。
本发明还提供治疗患有慢性动脉粥样硬化综合征的病人的方法，所述方法包括以下步骤以避免血管内血栓形成(a)确定病人体内存在或不存在动脉粥样硬化进程发作；和(b)如果存在血管内损伤则用针对血小板糖蛋白VI(GPVI)的抗体治疗病人。
因此，基于本发明，有可能治疗处于动脉粥样硬化风险的病人。为预防动脉粥样硬化发展，用本发明的融合蛋白治疗病人以预防血小板与暴露的内皮下胶原蛋白间的互作。本发明的融合蛋白阻断血管壁(例如内皮下层)中的GPVI血小板受体的配体，这样就可以抑制血小板与暴露的胶原蛋白间的互作。
本发明的融合蛋白可以是冻干粉末形式，在将其施用给病人之前将之分散在适宜的药学可接受液体载体中。如果对急性并发症的治疗优选经动脉内或静脉内给药，本发明的融合蛋白也可以被整合入适宜经非肠道途径给药的药物组合物。这样的组合物通常包括融合蛋白和药学可接受载体。药学可接受载体包括在药物给药上相容的溶剂、分散介质、抗细菌和抗真菌剂以及等渗剂。本发明包括生产治疗慢性或急性心血管疾病的药物组合物的方法。这样的方法包括将药学可接受载体与本发明融合蛋白配制在一起。对于急性心血管疾病的治疗，组合物优选经静脉内或动脉内给药。对于慢性心血管疾病的治疗，组合物也可以经皮下或腹膜内给药。这样的组合物可以进一步包括其它的活性化合物，例如另外的多肽(例如胰岛素)或治疗性活性小分子。因此，本发明进一步包括通过将药学可接受载体和本发明的融合蛋白以及一或多种其它的活性化合物例如胰岛素配制在一起而制备药物组合物的方法。对于融合蛋白和胰岛素的共同配制以治疗糖尿病患者，优选其剂量形式允许分别储存不同的蛋白，而仅在该组合物施用前完成蛋白质的混合。因此，考虑了应用多室注射器。本发明的药物组合物被配制成与目的非肠道给药途径相容。非肠道给药途径的例子包括，例如动脉内和静脉内给药。用于非肠道给药的溶液或悬液可以包括无菌稀释剂，例如注射用水、盐溶液、聚乙二醇、固定油、丙三醇、丙二醇、TWEEN或其它合成溶剂；抗细菌剂，例如苄基醇或羟苯甲酸甲酯；螯合剂，例如乙二胺四乙酸；抗氧化剂，例如抗坏血酸或重亚硫酸钠；缓冲液，例如醋酸盐、柠檬酸盐、磷酸盐，和调节渗透压的试剂，例如氯化钠、葡萄糖、蔗糖、甘露糖。pH可以用酸或碱调节，例如盐酸或氢氧化钠。非肠道制剂可以封装在用玻璃或塑料制成的安瓿瓶、一次性注射器或多剂量小药瓶中。适于可注射用途的药物组合物包括无菌水溶液或分散液和用于临时制备无菌可注射溶液或分散液的无菌粉末。对于静脉内注射，适宜载体包括生理盐水、抑菌水、或磷酸盐缓冲液(PBS)。载体可以是含有例如水、乙醇、多元醇(例如，丙三醇、丙二醇、和液体聚乙二醇)的溶剂或分散介质，及其适宜的混合物。可以通过，例如利用卵磷脂包被、保持分散液中所需的颗粒大小、以及使用表面活性剂，来保持适当的流动性。可以用各种抗细菌或抗真菌剂，例如，对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞，及类似，来实现对微生物作用的预防。在许多情况下，优选组合物中包括等渗剂，例如，糖类、多元醇例如甘露醇、山梨醇、氯化钠。可以通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸铝或明胶，来延长对可注射组合物的吸收。根据需要，可以将活性化合物(例如，多肽或抗体)以所需量同以上列举成分的一或多种组合整合进适宜的溶剂接着过滤灭菌来制备无菌可注射溶液。一般，通过将活性化合物整合进无菌载体来制备分散液，该无菌载体含有基本分散介质和所需的以上列举的其它成分。对于用于制备无菌可注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法是真空干燥和冻干，该法从其预先无菌过滤的溶液产生活性成分加上任何其它想要的成分的粉末。特别有利的是以剂量单位形式配制口服或非肠道途径的组合物。剂量单位形式是适于以单元剂量施用给病人的独立单位。各单位含有产生预期治疗效应的预先确定量的活性化合物以及所需的药物载体。治疗急性并发症的融合蛋白有效治疗剂量(即，有效剂量)是从0.05至5mg/kg体重，优选0.1至2mg/kg体重，更优选0.1至1mg/kg体重。治疗慢性动脉粥样硬化发展的融合蛋白有效治疗剂量(即，有效剂量)是从0.5至6mg/kg体重，优选1至5mg/kg体重，更优选2至5mg/kg体重。用治疗有效量的融合蛋白对对象进行的治疗可包括单次治疗，优选，可包括一系列治疗。在优选实施例中，针对慢性动脉粥样硬化进程以0.5至6mg/kg体重，优选1至5mg/kg体重，更优选2至5mg/kg体重，每周至少两次用本发明融合蛋白治疗对象。
调查血小板-胶原蛋白互作和由抑制剂调节的方法血小板凝集和ATP释放用0.2至4μg/ml升高浓度的I型牛胶原蛋白刺激小鼠血小板富集的血浆，引发2至95％的剂量依赖型凝集和剂量依赖型的0至1.66nM ATP释放。选择胶原蛋白的半最大浓度进行进一步试验。将特异性抗小鼠GPVI抗体JAQ1(50μg/ml和100μg/ml)与小鼠血小板富集的血浆孵育几乎完全废除了用2μg胶原蛋白/ml(对50μg JAQ12+/-0.7；对100μg JAQ11.5+/-0.3％)刺激后的血小板凝集。此外，ATP释放以剂量依赖方式被抑制至1.09nM ATP(10μg抗体/ml)或全部废除(50和100μg抗体/ml)。
类似地，用GPVI的免疫粘附素(Fc-GPVI-nt)(50μg/ml和100μg/ml)孵育小鼠血小板富集的血浆几乎完全废除了用2μg胶原蛋白/ml(对50μg Fc-GPVI-nt2+/-0.7；对100μg Fc-GPVI-nt1.5+/-0.3％)刺激后的血小板凝集，而且ATP释放为0nM ATP。
因此，免疫粘附素通过清除天然GPVI配体胶原蛋白而充分抑制GPVI激活。正如由ATP释放所测定的，关键的血小板功能凝集和血小板释放机制都可能被Fc-GPVI-nt影响。
生理流条件下由GPVI介导的粘附(流式腔)在流式腔中测试生理剪切条件下的血小板粘附。加入Fc-GPVI-nt免疫粘附素将初始和稳定的血小板粘附抑制了60％(参见附图4)。
GPVI结合检测在以ELISA为基础的荧光检测法中检测Fc-GPVI-nt对胶原蛋白包被的板的粘附。在0.2至10μg浓度的Fc-GPVI-nt下，免疫粘附素Fc-GPVI-nt的结合以剂量依赖的方式上升至饱和水平(请参见附图5)。通过比较Fc-GPVI-nt的结合与空免疫粘附素Fc-nt或未包被塑料表面的结合证实了特异性(参见附图6)。
在血管损伤处体内调查血小板粘附和凝集作为急性血管事件中血小板激活关键步骤的方法为测试体内损伤粘附过程中血小板-胶原蛋白互作的生物学重要性，评估了小鼠颈动脉血管损伤后的血小板-血管壁互作。对这一重要血管床的血管损伤可以用作动脉粥样硬化最初步骤，例如动脉粥样硬化早期阶段的内皮损伤或伴随胶原蛋白纤维从内皮下层暴露的动脉粥样硬化后期阶段的斑块破裂，的模型。此外，该模型允许对血管损伤后的并发症进行研究。小的内皮损伤导致伴随着之后的血小板粘附和凝集步骤的对血小板的最大激活。在进一步的步骤中，血小板凝集可以导致颈动脉栓塞和之后的缺血性脑中风。因此，这一试验设置用作患有涉及导致急性冠状动脉综合征和中风的斑块破裂和内皮损伤的不稳定动脉粥样硬化的病人亚组的相关体内模型。
根据扫描电子显微术的评估，持续紧扎颈动脉5分钟导致内皮细胞层完全丧失并引发血小板在损伤部位粘附(附图1a)。体内荧光显微术可用于直接将血管损伤后的血小板聚集的动力过程可视化并定量。内皮剥落后的最初几分钟无数血小板粘连至血管壁(4620±205血小板/mm2)。事实上所有与内皮下层建立联系的血小板最初都表现“停止-启动”型的缓慢表面易位(Savage，B.，Saldivar，E.&Ruggeri，Z.M.Initiation of platelet adhesion by arrest ontofibrinogen or translocation on von Willebrand factor.Cell1996；84，289-297)。而我们在88％的全部血小板中观察到从最初的缓慢表面易位向不可逆血小板粘附的转变(4182±253血小板/mm2)(附图1b)，只在12％中保持瞬间的血小板捕获(543±32血小板/mm2)。一旦建立了稳定的捕获，附着的血小板就从血循环中招募另外的血小板，导致凝集形成(附图1c)。用固定化的胶原蛋白在体外获得了与血小板募集相似的特征。相反，生理条件下仅有极少血小板被粘连到完整血管壁(P＜0.05vs.血管损伤)，而且实际上100％的这些血小板都从这些血管壁转移而未产生稳定捕获(P＜0.05vs.血管损伤，附图1a-c)。
将GPVI鉴定为体内血管损伤的血小板中的新型相关靶蛋白涉及种种不同受体和信号途径的血小板-血管壁互作的高度复杂性使得难于体内抑制这一过程。除了经von Willebrand因子(vWF)与胶原蛋白间接互作的GPIb-V-I-X和αIIbβ3整合素之外，已经在血小板上鉴定了大量胶原蛋白受体，包括最重要的α2β1整合素(Santoro，S.A.Identification of a 160,000 dalton platelet membraneprotein that mediates the initial divalent cation-dependentadhesion of platelets to collagen.Cell 1986；46，913-920)、GPV(Moog，S.等人，Platelet glycoprotein VI V binds to collagenand participates in platelet adhesion and aggregation.Blood2001；98，1038-1046)、和GPVI(Moroi M.，Jung，S.M.，Okuma，M.& Shinmyozu，K.A patient with platelets deficient inglycoprotein VI that lack both collagen-induced aggregation andadhesion.J Clia.Invest 84，1440-1445)。在几份关于在体外起作用的不同信号系统的报告中，现在也已经讨论了GPVI(Gibbins，J.M.，Okuma，M.，Farndale，R.，Barnes，M.& Watson，S.P.glycoprotein VI is the collagen receptor in platelets whichunderlies tyrosine phosphorylation of the Fc receptorgamma-chain.FEBS Lett.1997；413，255-259；Nieswandt，B.等人，Long-term antithrombotic protection by in vivo depletion ofplatelet glycoprotein VI in mice.J.Exp.Med.2001；193，459-469，Nieswandt，B.等人，Glycoprotein VI but not α2β1integrinis essential for platelet interaction with collagen.EMBO J2001；20，2120-2130)。
为直接测试血小板-胶原蛋白互作在动脉血栓形成中的体内相关性，我们在体内抑制或缺失了GPVI。单克隆抗体(mAb)JAQ1阻断小鼠GPVI上的主要胶原蛋白结合位点(Schulte，V.等人，Evidence fortwo distinct epitopes within collagen for activation of murineplatelets.J Biol.Chem.2001；276，364-368)，并在高剪切流条件下几乎完全抑制血小板向固定化纤维状胶原蛋白的稳定粘附(Nieswandt，B.等人，glycoprotein VI but not alpha2beta1integrin is essential for platelet interaction with collagen.EMBO J 2001；20，2120-2130)。为研究GPVI-胶原蛋白互作在动脉血栓形成中的血小板粘附/凝集动力学过程中的重要性，使小鼠接受用JAQ1 Fab片段或同型匹配的对照IgG预孵育的同源、荧光标记血小板，并如上述诱导颈动脉损伤。非常出人意料的是，我们发现对GPVI的抑制使正常颈动脉内皮剥落后的初始血小板粘连减少了89％(P＜0.05vs.对照IgG，附图2a)，这一过程被认为主要由GPIbα与固定的vWF间的互作所介导(Goto，S.，Ikeda，Y.，Saldivar，E.& Ruggeri，Z.M.Distinct mechanisms of platelet aggregation as a consequenceof different shearing flow conditions.J.Clin.Invest.1998；101，479-486；Sixma，J.J.，van Zanten，G.H.，Banga，J.D.，Nieuwenhuls，H.K.& de Groot，P.G.Platelet adhesion.Semin.Hematol.1995；32，89-98)。此外，JAQ1使稳定的血小板捕获减少了93％(附图2a)。我们只在58％的那些已与内皮下层建立初始接触的血小板中观察到从最初的粘连/缓慢表面易位向不可逆血小板粘附的转变(与用对照IgG预处理的血小板的89％相比，P＜0.05，附图2b)。用JAQ1 Fab片段预处理血小板后基本上未见附着血小板的凝集，但在对照中不是这样(P＜0.05vs.对照，附图2c和d)。这些资料证明，直接的血小板-胶原蛋白互作对于在血管损伤部位的初始血小板粘连和之后的稳定血小板粘附和凝集是关键的。此外，这些发现显示，GPVI是这一过程中的关键调节因子，而其它表面受体，最重要的GPIb-V-IX和α2β1，在体内不足以在内皮下层上引发血小板粘附和凝集。
为了排除该效应是以其它受体，例如GPIb-V-IX，通过表面结合的JAQ1形成的空间损害为基础的这一可能性，我们通过在血管损伤前五天注射JAQ1产生了GPVI-缺陷型小鼠。正如之前的报道，这样的处理基本上导致GPVI的完全丧失，例如通过循环血小板上的GPVI的内化和蛋白酶降解，从而产生与“GPVI敲除”类似的表型至少两个星期(Nieswandt，B.等人，Long-term antithrombotic protection byin vivo depletion of platelet glycoprotein VI in mice.J.Exp.Med.2001；193，459-469)。如附图3a中所示例的，注射100μg/小鼠的JAQ1后第五天在来自经JAQ1处理的小鼠的血小板中检测不到GPVI，但对照IgG却不，尽管在两组小鼠中所有其它受测试受体，包括GPIb-V-IX、αIIbβ3、和α2β1，的表面表达和功能都未改变，这证实了早些时候的结果(数据未给出，Nieswandt，B.等人，Long-termantithrombotic protection by in vivo depletion of plateletglycoprotein VI in mice.J.Exp.Med.2001；193，459-469)。
如扫描电子显微术所示，总颈动脉内皮剥落后的血小板粘附和凝集在GPVI缺型小鼠中基本缺失，但在IgG预处理小鼠中却不(附图3b)。接着，将体内视频荧光显微术用于定义GPVI缺陷小鼠中血管损伤后的血小板粘附动力学(附图3c-f)。GPVI的丧失使血小板在血管损伤处的粘连/缓慢表面易位显著减少(与IgG预处理的小鼠相比减少83％，P＜0.05)。这一GPVI非依赖的缓慢表面易位需要vWF-GPIbα-互作，因为将血小板与针对GPIbα的功能阻断型mAb(p0p/B)的Fab片段预孵育会将其取消，这证明GPIbα在这一过程中的关键作用(未显示)。GPVI缺乏时，与对照(IgG-处理)相比，稳定的血小板粘附被降低约90％，但是基本上不存在附着血小板的凝集(附图3b-f)。我们仅在所有最初粘连至损伤位点的血小板的58％中看到从血小板粘连到稳定血小板粘附的转变(与经对照mAb-预处理的血小板的89％相比，P＜0.05，附图3d)，指示GPIbα-依赖性的表面易位不足以促进稳定的血小板粘附和之后的凝集。
GPVI阻断对血小板粘连的具有深远意义的抑制是令人惊讶的，并暗示着这种受体在血小板向血管损伤稳定粘附的最初始阶段中具有之前未曾被识别的功能。纤维状胶原蛋白是人动脉粥样硬化损伤的主要组分(Rekhter，M.D.Collagen synthesis in atherosclerosistoomuch and not enough.Cardiovasc.Res.1999；41，376-384；Rekhter，M.D.等人，Type I collagen gene expression in humanatherosclerosis.Localization to specific plaque regions.Am.J Pathol.1993；143，1634-1648)；被增强的胶原蛋白合成(通过内膜平滑肌细胞和成纤维细胞)在动脉粥样硬化形成过程中显著促进腔室变窄(Opsahl，W.P.，DeLuca，D.J.& Ehrhart，L.A.Acceleratedrates of collagen synthesis in atherosclerotic arteriesquantified in vivo.Arteriosclerosis 1987；7，470-476)。斑块破裂和裂隙(自发发生的或在气囊血管形成术后发生的)导致胶原蛋白纤维暴露于血流。
本发明首次教导这样的内皮下层胶原蛋白是动脉血栓形成的主要开关，并揭示了胶原蛋白受体GPVI在将血小板募集至受伤血管壁中的意料不到的功能。在提高的剪切力条件下的血小板粘连和缓慢表面易位过程已知大部分依赖于GPIbα与固定的vWF的互作。然而，由于还需要有功能的GPVI，因此这一互作尚不足以在体内建立最初的血小板-血管壁互作(附图2和3)。因此，GPIbα和GPVI都必需共同作用以将血小板招募至内皮下层。在血小板粘连过程中，GPVI的连接可将αIIbβ3和α2β1整合素从低亲和力状态转变为高亲和力状态。αIIbβ3和α2β1之后都共同作用以促进之后血小板在胶原蛋白上的稳定捕获，而αIIbβ3对于随后的附着血小板的凝集很重要。因此，在血小板和内皮下层胶原蛋白最初接触过程中的GPVI连接提供了对随后的稳定血小板粘附和凝集很重要的激活信号。重要的是，GPIbα占位或在侧边聚集(在GPIbα-依赖的表面易位过程中)，其在体外诱导低水平的αIIbβ3整合素激活(Kasirer-Friede，A.等人，Lateral clustering of plateletGPIb-IX complexes leads to up-regulation of the adhesivefunction of Integrin IIb 3.J.Biol.Chem.2002；Vol 27711949-11956)，但在体内不足以促进血小板粘附。
本发明因此已经鉴定了抑制血小板附着至内皮下层的重要受体。阻断GPVI与暴露的胶原蛋白相互作用的抗体能特异性抑制血栓形成的所有主要阶段，即，在动脉损伤部位的血小板粘连、稳定粘附、和凝集(例如在急性冠状动脉综合征过程中)。由对GPVI的抑制或消耗而实现的这一意义重大的保护作用确立了对GPVI-胶原蛋白互作的选择性药理学调节以控制病理动脉粥样硬化损伤的发作和发展的重要性。
动脉粥样硬化斑块破裂后，内皮下胶原蛋白的暴露是引发血小板在损伤位点粘附和凝集的主要开关，随后是动脉血栓形成(1；24；25)。最近已被克隆(5；6)的血小板糖蛋白GPVI已被本发明鉴定为主要的血小板胶原蛋白受体(4)，其在体外(22)和体内(病理)生理条件下(3)都介导血小板粘附。因此，如本发明所示，通过特异性融合蛋白Fc-GPVI-nt对血小板粘附的体外和体内抑制活性，对GPVI的抑制会阻止患严重动脉粥样硬化的病人中血小板募集和动脉血栓的形成。
用腺病毒表达系统在HELA细胞中表达Fc-GPVI-nt融合蛋白得到可溶性Fc-GPVI-nt。GPVI可溶形式的表征揭示，Fc-GPVI-nt以分子量约为160kDa的二聚体分泌。相应地，Miura和同事近来报道，GPVI-Fc-二聚体以二聚体存在，其中两个GPVI-Fc-二聚体分子通过各分子Fc结构域中的Cys形成的二硫键交联(21)。重要的是，已经报道，只有GPVI的二聚体形式，而不是GPVI细胞外结构域单体，表现胶原蛋白结合亲和力并减弱胶原蛋白诱导的血小板凝集(21)。
为定义GPVI-Fc-二聚体-胶原蛋白互作完成了结合检测。可溶性GPVI以可饱和方式与固定化的胶原蛋白结合。与纤维状胶原蛋白结合的GPVI-Fc-二聚体是高亲和性的，因为它对固定化的vWF或BSA不发生结合。此外，与固定化胶原蛋白结合的GPVI能被可溶性胶原蛋白抑制。需要高浓度的可溶胶原蛋白来阻断GPVI-Fc-二聚体结合，这指示融合蛋白以高亲和力与固定化的胶原蛋白结合。相应地，已经报道了GPVI-胶原蛋白互作的高结合和解离常数(KD约为5.8×10-7M)(21)。
较早时候已证实，可溶性Fc-GPVI-nt能减弱对以高亲和力与GPVI结合的胶原蛋白或convulxin(蛇毒素)应答的血小板激活和凝集(6；21；27)。除了血小板凝集，GPVI还关键地参与血小板对胶原蛋白的粘附过程(3；22)。因此，在本研究中我们体外测试了在生理流条件下Fc-GPVI-nt对血小板粘附的效应。我们显示，可溶性Fc-GPVI-nt在体外低和高剪切条件下以剂量依赖方式抑制血小板粘附。在Fc-GPVI-nt而非对照Fc肽存在下，基本上未出现附着血小板的凝集，表明GPVI通过固定化的胶原蛋白促成血小板粘附和之后的激活这两个过程。GPVI以受体密度依赖方式进行胶原蛋白应答(即粘附和凝集)(22)。相应地，已经报道，如果转染RBL-2H3细胞的GPVI表达降低超过50％，则这些细胞中缺乏由胶原蛋白诱导的凝集(8；22)。虽然由于已经报道了在小样本群体中GPVI受体密度的低可变性(22)，仍然可以预计对胶原蛋白-GPVI结合约50％的抑制足以减弱血小板向已暴露胶原蛋白的募集。在本研究中，需要1mg/kg Fc-GPVI-nt的剂量来诱导流体条件下对血小板粘附的显著抑制，这支持在各胶原蛋白纤维中具有多个GPVI结合位点的想法。需要类似量的功能阻断型抗-GPVI抗体来减弱体内血小板-血管壁损伤(3)。
纤维状胶原蛋白是正常血管壁中，以及动脉粥样硬化损伤中的主要成分(28)。动脉粥样硬化斑块的破裂或裂隙导致胶原蛋白纤维暴露于循环血小板。如以前所报道的，GPVI-胶原蛋白互作本质上参与血管损伤后的动脉血栓形成(3)。这里我们证实了动脉损伤后可溶性Fc-GPVI-nt对血小板募集的体内效应。内皮剥落由对该颈动脉的可逆扎紧诱导，根据描述的，血小板附着的动力学过程通过活体视频荧光显微术进行监视(3)。我们首次体内证实了，可溶性Fc-GPVI-nt减弱内皮剥落后的稳定血小板粘连、粘附和血小板凝集。Fc-GPVI-nt对血小板募集的抑制是剂量依赖型的。除了阻止血小板的稳定捕获之外，Fc-GPVI-nt还显著降低在内皮剥落部位的初始血小板粘连/缓慢表面易位。我们早前已经证实，对GPIba或GPVI的抑制以相似的程度减弱血小板粘连程度(3)，这支持了GPVI和GPIbα互作需要接触作用以促进血小板向内皮下胶原蛋白的粘连(2；29-31)。实际上，已经报道的GPVI-配体互作的高结合解离率(“on”-and“off”-rates)(22)与GPVI作为粘连受体的作用是一致的。
本发明将Fc-GPVI-nt鉴定为减弱血管损伤后动脉血栓形成的药物中的活性成分。这个概念得到用组织化学所证实的Fc-GPVI-nt靶向血管损伤部位的已暴露内皮下层这一观察结果的进一步支持。这暗示着，对GPVI-胶原蛋白互作的抑制可能被限制在血管损伤位点，而对血小板功能的延长的系统性抑制受到未结合Fc-GPVI-nt的预计的短半衰期的限制。相反，施用针对GPVI的单克隆抗体不可避免地导致对所有循环血小板上的GPVI的系统性抑制。而且，施用Fc-GPVI-nt并不影响血小板计数。相反，抗-GPVI mAbs可能最终导致免疫血小板减少症或循环血小板上GPVI完全丧失(14；32)，从而妨碍它们在临床实践中的用途。因此，与以抗-GPVI mAb为基础的策略相比，Fc-GPVI-nt疗法将可能具有较低的临床出血风险。
血管损伤位点的血小板粘附和凝集对于止血是关键的，但可能导致动脉粥样硬化环境下动脉阻塞以及例如冠状动脉血栓形成和心肌梗死这样的沉积性疾病。静脉内GPIIb-IIIa受体抑制剂的应用显著改善了进行冠状动脉支架术的病人的临床成功率(33-35)。然而，已经报道严重的流血并发症妨碍了用阿昔单抗进行治疗的病人的成功率(36)。本发明证实，Fc-GPVI-nt对GPVI-胶原蛋白互作的抑制足以在体外和体内都显著降低血小板粘附；然而，GPVI的可溶形式只适度延长尾部出血时间。类似地，在带有GPVI缺陷型血小板的病人中已经报道了中度的出血疾病(37)，这指示甚至在完全缺失GPVI时凝固和止血也是有效的。这种差异可能部分由这一事实引起对GPVI的抑制或缺失不干扰对胶原蛋白以外的血小板激动剂，例如ADP、组织因子或凝血酶，应答而产生的血小板凝集。相反，对GPIIb-IIIa的直接抑制，例如通过7E3或其人源化衍生物，阻断了纤维蛋白原与血小板的结合——它是血小板凝集的关键过程，并显著减弱血小板对大多数目前已知的激动剂的凝集。因此，与以抗-GPIIb-IIIa为基础的策略相比，Fc-GPVI-nt疗法将可能具有较低的临床出血风险。
总之，本发明首先提供体内证明在体外流式条件下以及在体内小鼠颈动脉中的内皮剥落后，Fc-GPVI-nt减弱血小板粘附。这进一步支持了这一概念GPVI-胶原蛋白互作在血栓形成的所有阶段，即在动脉损伤(例如急性冠状动脉综合征)部位的血小板粘连、稳定粘附、和凝集，中都起着重要作用。本发明进一步支持这一概念GPVI在动脉粥样硬化进程中起重要作用。此外，本发明首次显示GPVI和糖尿病间的因果关系。
参照以下特定实施例，本发明现将得到更进一步的详细描述。
实施例动物。特定无病C57BL6/J小鼠来自Charles River(Sulzfeld，Germany)。用12周龄的雄性小鼠进行试验。对动物进行的所有试验程序都已经过德国动物保护立法会(German legislation onprotection of animals)批准。
单克隆抗体。根据所述产生单克隆抗体(mAb)抗GPVI(JAQ1)和抗GPIbα(p0p/B)和源自JAQ和p0p/B的Fab片段(Bergmeier，W.，Rackebrandt，K.，Schroder，W.，Zirngibl，H.& Nieswandt，B.Structural and functional characterization of the mouse vonWillebrand factor receptor GPIb-IX with novel monoclonalantibodies.Blood 2000；95，886-893；Nieswandt，B.，Bergmeier，W.，Rackebrandt，K.，Gessner，J.E.& Zirngibl，H.Identification ofcritical antigen-specific mechanisms in the development ofimmune thrombocytopenic purpura in mice.Blood 2000；96，2520-2527)。无关对照大鼠IgG获自Pharmingen(Hamburg，Germany)。
GPVI-缺陷型小鼠的产生。
为产生缺失GPVI的小鼠，用100μg JAQ1 i.c.注射C57BL6/J野生型小鼠。注射mAb后第五天将动物用于血小板粘附体内评估。用Western印迹分析和流式细胞术核实血小板上GPVI表达的缺失。
流式细胞术用改良Tyrodes-HEPES缓冲液(134mM NaCl，0.34mM Na2HPO4，2.9mM KCl，12mM NaHCO3，20mM HEPES，5mM葡萄糖，和1mM MgCl2，pH6.6)以1∶30稀释获自野生型C57BL6/J小鼠或GPVI-清除型小鼠的肝素化全血。将样品与用荧光团标记的mAb抗-GPVI(JAQ1)和抗-CD41在室温下孵育10分钟，并直接在FACScanTM(Becton Dickinson)上进行分析。
可溶性人和鼠GPVI的克隆、病毒表达和纯化。为产生人GPVI的可溶形式，根据下面实施例1至3对人GPVI细胞外结构域进行克隆并将其与人免疫球蛋白Fc结构域融合。制备编码GPVI-Fc-融合蛋白或对照Fc的腺病毒构建物以产生重组蛋白。用人HELA细胞系以分泌可溶形式表达GPVI-Fc和对照Fc以防止错误折叠和被表达蛋白的非糖基化。
实施例1免疫粘附素GPVI(Fc-GPVI-nt)的克隆通过产生同时具有GPVI n-末端部分和IgG Fc部分的重组融合蛋白，我们构造了GPVI受体免疫粘附素，其中GPVI n-末端部分编码GPVI细胞外结构域。用正向引物5′-cgcggggcggccgcgagt-ccaaatcttgtgacaaaac-3′和反向引物5′-gcgggaagctttcatttacccggagacagggag-3′进行PCR从人心脏cDNA文库(Clonetech，Palo Alto，CA)扩增得到Fc。用Expand HighFidelity PCR Sytem(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)在58℃退火温度下进行20循环以完成PCR反应。将PCR片段克隆进带有NotI/HindIII的质粒pADTrack CMV，并通过测序对序列进行核查(MediGenomix，Martinsried，Germany)。
为克隆人GPVI细胞外结构域，根据制造商的程序从培养的巨核细胞分离RNA(RNeasy Mini试剂盒；Qiagen，Hilden，Germany)，并用2μg RNA在37℃过夜完成反转录(Omniscript RT试剂盒；Qiagen)。将100ng反应物用做模板，用引物5′-gcggggagatctaccaccatgtctccatccccgacc-3′和5′-cgcggggcggccgccgttgcccttggtgtagtac-3′进行hGPVI的PCR扩增反应。用Expand High Fidelity PCR Sytem(Roche MolecularBiochemicals，Mannheim，Germany)在54℃退火温度下进行24循环以完成PCR反应。将PCR片段克隆进带有BgIII/NotI的质粒pDATrackCMV，并通过测序对序列进行核查。
基于Fc-GPVI-nt的单体融合蛋白的构建用引物对5′-cgcggggcggccgcccagcacctgaactcctg-3′和5′-cgcggggatatctcatttacccggagacagggag-3′和模板pADTrack CMVgpVI-Fc，PCR扩增Fc单体片段。用Expand High Fidelity PCR Sytem(Roche Molecular Biochemicals，Mannheim，Germany)在58℃退火温度下进行20循环以完成PCR反应。如上所述克隆Fc单体PCR片段(NotI/EcoRV)和来自pADTrack CMV gpVI-Fc(BglII/NotI)的gpVI片段。
实施例2产生Fc-GPVI-nt的腺病毒(Ad-Fc-GPVI-nt)质粒pADTrack CMV Fc-GPVI-nt用PmeI(New England Biolabs，Beverly，MA)线性化过夜，去磷酸化并纯化(GFX DNA and GelPurification Kit；Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)。为进行重组，用1μg线性化的质粒和0.1μg pAdeasy1共转化电感受态大肠杆菌BJ5183(Stratagene，La Jolla，California)，转化条件为2500V，200Ω和25μFD(E.coli-pulser；Biorad，Heidelberg，Germany)，铺平板并于37℃培养过夜。微量制备带有PacI的质粒-DNA后核查克隆，并将阳性克隆重新转化进大肠杆菌DH5α。
为转染(Effectene Transfection reagent；Qiagen，Hilden，Germany)293细胞，用PacI消化质粒-DNA。细胞培养7天，通过刮取收集并离心。将离心物重悬于Dulbecco’s PBS中，并经四次反复冻(-80℃)融(37℃)循环将细胞裂解。离心除去细胞碎片，裂解物保存于-80℃。
为重组病毒的斑点选择，室温下将293细胞在含有不同稀释倍数转染裂解物的Dulbeccos PBS中轻轻搅动感染1小时。感染后，用含0.5％琼脂糖的生长培养基(改良Eagles培养基2×和Gibco LifeTechnologies #21935的1∶1混合物，补加了20％血清、2×青霉素/链霉素、2×L-谷胺酰胺和溶于水中的1％琼脂糖，Seacam)覆盖细胞。感染后5～14天，监视细胞层斑块的形成，用巴斯德吸管挑取斑块，重悬于0.5ml Dulbeccos PBS，并保存于-80℃。斑块进一步用于在293细胞上的扩增循环。
表达稳定CHO的人gpVI-Fc单体的构建根据实施例2产生表达单体的细胞。
实施例3Fc-GPVI-nt蛋白质和Fc对照免疫粘附素的纯化感染后2天收集Ad-Fc-GPVI-nt-感染的Hela细胞培养物上清液，离心(3800g，30分钟，4℃)并过滤(0.45μm)。加入1倍体积的硫酸铵(761g/l)使免疫粘附素沉淀，4℃搅拌过夜。离心(3000g，30分钟，4℃)使蛋白质成团，溶于0.1倍体积的PBS，并在PBS中4℃透析过夜。离心(3000g，30分钟，4℃)使蛋白质溶液澄清，并将其上载至蛋白质A柱(HiTrapTMprotein A HP，Amersham PharmaciaBiotech AB，Uppsala，Sweden)。用结合缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.0，0.02％ NaN3)洗涤柱直至OD280＜0.01，并用洗脱缓冲液(100mM甘氨酸pH2.7)洗脱。用中和缓冲液(1M Tris/HCl pH9.0，0.02％NaN3)中和洗脱的级分，收集，在PBS中4℃透析过夜，等量分装并冷冻于-20℃。
根据考马斯蓝染色、或用过氧化物酶缀合的山羊抗-人Fc抗体或抗-GPVI mAb 5C4做的免疫印迹检测，Fc-GPVI-nt蛋白在SDS-PAGE中的还原条件下分子量为～80kDa(附图1a，上图和中图)。相反，在非还原条件下鉴定到了～160kDa的蛋白质(附图1a，下图)，这支持了这一想法GPVI-Fc仅以二聚体形式获得(21)。
实施例4GPVI抑制剂筛选检测试验在100μl 50mM Tris/HCl pH8.0中，用1μg/孔胶原蛋白(I型，牛；BD Bioscience，Bedford，MA)于4℃包被ELISA板(Immulon2HB，Dynx Technologies，Chantilly，VA)过夜。将板用250μl/孔PBS/0.05％Tween 20(PBST)洗涤两次，并用250μl/孔Roti-Block(Roth，Karlsruhe，Germany)封闭过夜。将板用250μl/孔PBST洗涤两次。加入100μl溶于PBST中的Fc-GPVI-nt(理想的是2μg/孔)，并将板在室温下孵育1小时。用250μl PBST洗涤五次后，加入100μl以1∶10000稀释的过氧化物酶缀合的山羊抗-人IgG抗体(Dianova，Hamburg，Germany)，于室温下孵育1小时。用250μl PBST重复洗涤后，加入100μl检测试剂(BM Blue POD Substrate；Roche，Mannheim，Germany)，并孵育15分钟。加入100μl 1M H2SO4使反应终止，于450nm处测定板，对照波长为690nm。为筛选潜在的抑制剂，将测试化合物以不同浓度加到100μl PBST孵育物中。
实施例5血小板凝集和发光测定用两通道Chronolog凝集测定计(Nobis，Germany)于37℃在柠檬酸化血液样品中通过光学凝集测定来评估离体或体外血小板凝集。通过离心(200g，20分钟)从柠檬酸化的全血制备血小板富集的血浆。用自体同源血浆将最终的血小板计数调节至2×108血小板/ml。基线调节后，加入0.2至4μg/ml的胶原蛋白(I型，牛)，记录凝集5分钟。同时，用萤火虫发光测定法记录ATP释放。用50μg/ml单克隆GPVI抗体JAQ1孵育15分钟。
实施例6GPVI/胶原蛋白互作的体外血小板粘附试验从ACD(20％终浓度)血液制备血小板富集的血浆，并用HepesTyrode(pH6.5)将其调节至终浓度108血小板/ml。盖玻片用不同浓度的各种粘附蛋白(胶原蛋白、vWF)单层包被。在产生自玻璃盖玻片的灌注室中完成灌注研究。在代表低介质流的500/s剪切速率下和代表高剪切速率的2000/s下完成灌注。37℃下测定粘附20分钟，之后用自动注射器泵在固定的壁剪切速率下抽室5分钟。灌注后用HepesTyrode轻轻洗涤从室中取出的盖玻片。用Hepes Tyrode反复洗涤盖玻片直至完全去除粘附的血小板。用FACS测定法定量分析悬浮血小板。根据标准流式细胞程序通过分析表面标记(CD41；CD61和CD62P)的表达对血小板功能状态的分析作进一步评估。
实施例7为活体显微检查制备血小板血小板(野生型，或GPVI-缺陷型)分离自所述的(Massberg，S.等人，Platelet-endothelial cell interactions duringischemia/reperfusionthe role of P-selectin.Blood 1998；92，507-515)全血，并用5-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(DCF)。将DCF-标记的血小板悬浮液调节至终浓度200×106血小板/250μl。在指明的地方，用50μg/ml抗-GPVI(JAQ1)Fab片段、或抗GPIbα(p0p/B)Fab片段将荧光野生型血小板预孵育10分钟。之后，将经过预处理的血小板和Fab片段一起注入野生型受体小鼠，颈动脉损伤前或后用体内视频显微术评估血小板粘附，如下述。
实施例8通过活体显微术估测血小板粘附和凝集。
腹膜内注射咪达唑仑(5mg/kg体重，Ratiopharm，Ulm，Germany)、美托咪定(0.5mg/kg体重，Pfizer，Karlsruhe，Germany)、和芬太尼(0.05mg/kg体重，CuraMed Pharma GmbH，Munich，Germany)溶液麻醉野生型C57BL6/J或GPVI-缺陷型小鼠。将聚乙烯导管(Portex，Hythe，England)植入右颈静脉，并经静脉内注入荧光血小板(200×106/250μl)。将右总颈7动脉分离出来，并在颈动脉二分叉处紧扎5分钟，以诱导血管损伤。血管损伤之前及之后借助对右总颈动脉的体内视频显微术将荧光血小板原位可视化。用带100W HBO水银灯落射显微镜灯的Zeiss Axiotech显微镜(20×水浸物镜，W20×/0.5，Zeiss)监视血小板-血管壁互作。用计算机辅助图像分析程序(Cap Image 7.4，Dr.Zeintl，Heidelberg，Germany)评估所有视频记录的图像。将瞬间附着的血小板定义为以显著低于中线速度的速度穿过血管假想垂直线的细胞；它们的数量以每mm2内皮表面的细胞数表示。通过10秒钟内未移动或未从内皮表面脱离的细胞进行计数来估算附着的血小板数量。还定量了在血管损伤处凝集的血小板数量，并以每mm2表示。
实施例9扫描电子显微术。
活体视频荧光显微术后，用PBS(37℃)灌注颈动脉1分钟，之后用磷酸缓冲的戊二醛(1％vol/vol)灌注固定。将颈动脉切离，纵向切开，浸没在1％PBS-缓冲的戊二醛中进一步固定12小时，在乙醇中脱水，并用CO2做临界点干燥处理。之后，将颈动脉样本内腔暴露定向，用碳染料封固，喷铂包被，并用场发射扫描电子显微镜(JSM-6300F，Jeol Ltd.，Tokyo，Japan)检查。
实施例10对与固定化胶原蛋白结合的Fc-GPVI-nt的评估。检测Fc-GPVI-nt与固定化胶原蛋白的结合。用1μg胶原蛋白(I型，牛；BD Bioscience，Bedford，MA)在100μl包被缓冲液(1.59g/l Na2CO3，2.93g/l NaHCO3，0.2g/l NaN3，pH9.6)中将ELISA板(Immulon2HB，Dynx Technologies，Chantilly，VA)在4℃包被过夜。板用250μl/孔PBS/0.05％ Tween 20(PBST)洗涤两次，并用250μl/孔Roti-Block(Roth，Karlsruhe，Germany)封闭过夜。板用250μl/孔PBST洗涤两次，之后添加3.0、6.0、12.5、25.0、50.0或100μg/ml溶于PBST的Fc-GPVI-nt，室温下将板孵育1小时。在指明的地方，Fc-GPVI-nt(20μg/ml)与可溶性胶原蛋白预孵育10分钟。孵育后将板用250μl PBST洗涤五次，并以1∶10000稀释加入特异性的过氧化物酶缀合的山羊抗-人IgG抗体Fcγ片段(109-035-098；Dianova，Hamburg，Germany)，室温下孵育一小时。用250μl PBST洗涤五次后，加入100μl探测试剂(BM Blue POD Substrate；Roche，Mannheim，Germany)，孵育至10分钟。加入100μl 1M H2SO4使反应终止，在450nm处测定板，参照波长为690nm。
Fc-GPVI-nt与固定化胶原蛋白的结合表现剂量依赖和可饱和方式(附图9b)。在6.0μg/ml的Fc-GPVI-nt终浓度处观察到半最大胶原蛋白结合。GPVI-Fc未出现对BSA、vWF(附图9c，左图)或Poly-L-Lysin(未显示)的结合，这支持了Fc-GPVI-nt结合的特异性。此外，在相同条件下我们未探测到缺少外部GPVI结构域的对照Fc结构域的显著结合(附图9c，右图)。
为进一步说明GPVI-结合的特异性，我们测试了可溶性纤维状胶原蛋白与固定化胶原蛋白竞争结合Fc-GPVI-nt的能力。可溶性胶原蛋白以剂量依赖方式抑制Fc-GPVI-nt与固定化胶原蛋白的结合(附图9d)。将Fc-GPVI-nt结合降低超过50％需要浓度为100μg/ml的可溶胶原蛋白。这些资料共同表明，Fc-GPVI-nt与胶原蛋白的结合是特异性的，而且是以高亲和力为特征的。
实施例11针对人GPVI的单克隆抗体的产生。基本根据(17)所述产生单克隆抗体。用腺病毒表达的人Fc-GPVI-nt融合蛋白免疫Lou/C大鼠。用Fc-GPVI-nt或GPVI结构域缺失的Fc在固相免疫检测中筛选杂交瘤上清液。筛选鉴定了与Fc-GPVI-nt特异性结合但不与缺失外部GPVI结构域的Fc结合的杂交瘤5C4上清液。用大鼠Ig类别(抗-IgM)和IgG亚类特异性小鼠mAbs确定了免疫球蛋白类别。用蛋白质G-琼脂糖凝胶(Protein G-Sepharose)柱纯化单克隆抗体。通过针对Fc-GPVI-nt和对照Fc的免疫印迹核实了5C4的抗体特异性。5C4单克隆抗体探测到腺病毒表达的Fc-GPVI-nt，但不探测对照Fc。此外，从获自人的血小板的裂解液中回收人GPVI。此外，如流式细胞术所证实的，5C4特异性与血小板表面结合，而不与白细胞或红细胞结合(未显示)。
实施例12对CD62P外化的FACS测定。从志愿者收集人柠檬酸盐血液。2000rpm 4℃离心洗涤(PBS 1×；pH7.2)并重悬之后产生血小板富集的血浆(PRP)。将稀释于含有0.1％叠氮化钠和2％胎牛血清(FBS)、2mM CaCl2的染色缓冲液(1×PBS(w/o Ca2+和Mg+)中的PRP，在Fc-GPVI-nt(100μg/ml)或等摩尔浓度对照Fc存在下，与马1型胶原蛋白孵育(0；2；5和10μg/ml；Nobis)。加入用荧光团过氧化物酶标记的抗CD62P抗体(Immunotech)。用BectonDickenson FACScalibur装置完成FACS测定。
根据CD62P外化的指示，提高的胶原蛋白浓度导致血小板从α颗粒分泌。根据FACS所检测的，胶原蛋白与Fc-GPVI-nt的共孵育使CD62P的外化钝化(附图10)。
实施例13血小板凝集和ATP释放。如上述产生PRP。在全血凝集测定计(Whole-Blood-Aggregometer)500VS(Chrono-LogCorporation)中测定凝集。用Thyrodes-HEPES缓冲液(2.5mmol/lHEPES，150mmol/l NaCl，12mmol/l NaHCO3，2,5mmol/l KCl，1mmol/lMgCl2，2mmol/l CaCl2，5,5mmol D-Glucose，1mg/ml BSA，pH7.4)将来自PRP的血小板细胞数调节至1.0×108细胞/ml。添加Chrono-Lume #395(Chrono-Log Corporation)以进行ATP测定。将激动剂加入血小板，吸入凝集测定计中，在所定义的搅拌条件下开始凝集。根据由于血小板凝结而发生的光传播改变来测定凝集，并将其标准化成内部标准。在Chrono-Lume的ATP特征波长处测定ATP释放，并根据制造商的说明将其标准化成内部标准。
Fc-GPVI-nt特异性抑制由胶原蛋白介导的激动剂刺激(附图11a &b)引起的血小板凝集和ATP释放。ADP-和凝血酶-介导的(TRAP 10μM)血小板凝集和ATP释放不受Fc-GPVI-nt的影响。
实施例14人血小板的PDGF释放。如上所述制备来自人志愿者的PRP。根据制造商的说明用试剂盒系统(R&D Systems #DHD00B)测定PDGF从人血小板的释放。在对照条件和Fc-GPVI-nt(100μg/ml)或等摩尔浓度对照Fc存在下用1型胶原蛋白(20μg/ml；Nobis)刺激PDGF释放。将PDGF释放标准化为制造商的标准探针。
作为内源递质从血小板α颗粒释放的指示的PDGF释放在胶原蛋白刺激后也被钝化(Fig 11c)。
实施例15Fc-GPVI-nt体外对人全血流血时间的效应。用PFA-100装置(Dade-Behring)测定体外流血时间。将800μl人全血注入PFA-100装置。根据制造商的说明，用经ADP/胶原蛋白和肾上腺素/胶原蛋白包被的测定细胞来测定流血时间。
不同激动剂刺激后，浓度升高的Fc-GPVI-nt未显著延长体外(PFA-100装置)流血时间。相反，治疗相关浓度的ReoPro在PFA-100装置中最大程度地延长了流血时间(Fig 12)实施例16流式条件下可溶性GPVI对血小板粘附于固定化胶原蛋白的效果。如(18)所述，人血小板分离自ADC-抗凝结全血。将洗涤过的血小板重悬于Tyrodes-HEPES缓冲液(2.5mmol/l HEPES，150mmol/l NaCl，12mmol/l NaHCO3，2,5mmol/l KCl，1mmol/l MgCl2，2mmol/l CaCl2，5,5mmol D-Glucose，1mg/ml BSA，pH7.4)以获得2×108细胞/ml的血小板计数。在200μg/ml Fc-GPVI-nt或对照Fc存在下在平行板流式腔中测定血小板对经固定化胶原蛋白包被的板的粘附。
GPVI在体外血小板向固定化胶原蛋白的募集过程中起重要作用(22)。我们在体外测定了剪切条件下Fc-GPVI-nt对人血小板向固定化胶原蛋白粘附的效果。正如他人在早前的报道(23)中所述，血小板在低(500秒-1)或高(1000秒-1)剪切速率下都稳定粘附于固定化胶原蛋白而形成血栓(附图13)。可溶性Fc-GPVI-nt，而非缺乏外部GPVI结构域的对照Fc，在剪切速率500秒-1和1000秒-1时分别将血小板向固定化胶原蛋白的粘附显著减弱37和44％(附图13)。抑制是特异性的，因为Fc-GPVI-nt不影响血小板向固定化vWF的粘附。
实施例17Fc-GPVI-nt血浆浓度的测定用定量测定人IgG的IMMUNO-TEK ELISA系统(ZeptoMetrix Corporation；Cat #0801182)来完成。使用了针对Fc-GPVI-nt的Fc部分的特异性过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG抗体(Dianova)。根据制造商的说明书在用PBS-T进行的几个洗涤步骤之后，加入过氧化物酶底物(BM Blue POD，Roche)，并在ELISA检测读取器(Tecan Sunrise)中于450特征性nm波长处进行测定。通过与内部人IgG标准进行比较对Fc-GPVI-nt浓度进行定量。Fc-GPVI-nt在体内显示令人满意的药物代谢动力学。小鼠腹膜内单次注射后24小时可以测得高血浆水平，融合蛋白的半衰期超过96小时(附图14a)。重复腹膜内注射导致融合蛋白在血液中聚集(附图14b)，这暗示着长期应用于慢性疾病治疗的令人满意的动力学。以提高的剂量单次静脉内注射Fc-GPVI-nt后，5至60分钟直至14小时后可探测到剂量依赖型血浆Fc-GPVI-nt浓度(附图14c)。
实施例18为离体荧光显微术制备鼠血小板。如早前(19)报道的，鼠血小板分离自全血，并用5-羧基荧光素二乙酸琥珀酰亚胺酯(DCF)标记。将DCF标记的血小板悬浮液调节至终浓度200×106血小板/250μl。如下述，颈动脉损伤之前和之后借助体内视频显微术评估鼠血小板粘附。
实施例19颈动脉紧扎以及借助活体显微术所作的血小板粘附和凝集评估。如早前(3)所报道的，完成内皮剥落后的血小板募集。简言之，腹膜内注射咪达唑仑(5mg/kg体重，Ratiopharm，Ulm，Germany)、美托咪定(0.5mg/kg体重，Pfizer，Karlsruhe，Germany)、和芬太尼(0.05mg/kg体重，CuraMed Pharma GmbH，Munich，Germany)溶液麻醉野生型C57BL6/J小鼠。在指明的地方，经静脉内注射Fc-GPVI-nt(1或2mg/kg体重)或与2mg/kg Fc-GPVI-nt等摩尔量的对照Fc。之后，通过在颈动脉二分叉附近紧扎5分钟诱导内皮脱落。诱导血管损伤后，经植入右侧颈静脉的聚乙烯导管(Portex，Hythe，England)静脉内注入荧光血小板(200×106/250μl)。借助带100WHBO水银灯落射显微镜灯的Zeiss Axiotech显微镜(20×水浸物镜，W20×/0.5，Zeiss)通过对右侧颈总动脉的体内视频显微术将荧光血小板原位可视化。用计算机辅助图像分析程序(Cap Image 7.4，Dr.Zeintl，Heidelberg，Germany(19；20))评估所有视频记录的图像。将粘连的血小板定义为所有与血管壁建立初始接触、之后缓慢表面易位(以显著低于中线速度的速度)或稳定粘附的细胞；它们的数量以每mm2内皮表面的细胞数表示。通过对10秒钟内未移动或未从内皮表面脱离的细胞进行计数来估算附着血小板的数量。还定量了在血管损伤处凝集的血小板数量，并以每mm2表示。此外，还用Cap Image7.4评估了总血栓面积。
实施例20扫描电子显微术。活体视频荧光显微术后，用PBS(37℃)灌注各组三只动物颈动脉一分钟，之后用磷酸缓冲的戊二醛(1％vol/vol)灌注固定。切出颈动脉，纵向切开，浸没在1％PBS-缓冲的戊二醛中进一步固定12小时，在乙醇中脱水，并用CO2做临界点干燥处理。之后，将颈动脉样本内腔暴露定向，用碳染料封固，喷铂包被，并用场发射扫描电子显微术检查(JSM-6300F，Jeol Ltd.，Tokyo，Japan)。
实施例21通过免疫组织化学对体内Fc-GPVI-nt结合的评估。将经过Fc-GPVI-nt处理的小鼠颈动脉快速冷冻并包埋入cryoblock(medite，Medizintechnik GmbH，Burgdorf，Germany)。在经特异性过氧化物酶缀合的山羊抗-人IgG抗体Fcγ片段染色的5μm低温保持切片上测定Fc-GPVI-nt对内皮和内皮下层的结合(109-035-098；Dianova，Hamburg，Germany)。将获自经Fc处理的小鼠的颈动脉作为对照。
实施例22可溶性GPVI对体内血小板计数、流血时间和血小板粘附的影响。
用2mg/kg或4mg/kg Fc-GPVI-nt或等摩尔剂量的缺失外部GPVI结构域的对照Fc处理动物。甚至以最高剂量4mg/kg注入Fc-GPVI-nt或对照Fc也未显著影响外周血小板计数。此外，与对照动物相比，Fc-GPVI-nt融合蛋白未诱导出任何尾部出血时间的显著延长(附图15a)。用PBS处理的小鼠的绝对出血时间是1.9±0.9，用2mg/kg或4mg/kg Fc-GPVI-nt处理的小鼠中绝对出血时间为2.9±1.9分钟和4.6±0.6分钟。相反，在经Integrilin(0.2mg每kg IV)处理的动物中，出血时间被大大延长(42.6±21.6)。
小鼠颈动脉损伤模型中Fc-GPVI-nt对血小板募集的影响可以用活体荧光显微术进行研究。如上所述，用1mg/kg或2mg/kg Fc-GPVI-nt或等摩尔量缺少外部GPVI结构域的对照Fc处理小鼠。注入Fc-GPVI-nt或对照Fc后，如之前(3)报道的，通过紧扎诱导小鼠颈动脉内皮脱落。持续结扎颈动脉导致内皮细胞层的完全脱落。借助体内荧光显微术将血小板粘附直接可视化并定量(19；20)(附图15d)。在对照(经Fc处理的)小鼠中，在内皮脱落后最初的几分钟内无数血小板粘连至血管壁(12.026±1.115粘连的血小板/mm2)。与内皮下层建立接触的血小板最初表现缓慢的表面易位，表面易位后常常出现随后的血小板牢固粘附和凝集(5.494±874附着的血小板/mm2和114±17血小板血栓/mm2)。相反，在Fc-GPVI-nt存在下，血小板向血管损伤处的募集被剧烈减弱。与经Fc-处理的动物相比，用1mg/kg或2mg/kgFc-GPVI-nt预处理后血小板粘连被降低65和71％(P＜0.05vs.对照)。同时，稳定血小板粘附以剂量依赖方式被降低(施用1mg/kg或2mg/kg Fc-GPVI-nt后分别降低49和65％；P＜0.05vs.对照)。同样，在经过2mg/kg Fc-GPVI-nt融合蛋白处理的动物中，基本上未出现附着血小板的凝集(P＜0.05vs.对照Fc，附图15b-d)。扫描电子显微术还清楚地证实，在经Fc-GPVI-nt处理而非FC预处理的小鼠中，基本上未出现总颈动脉内皮脱落后的血小板粘附和凝集(附图15e)。为了证实损伤位点处Fc-GPVI-nt的存在，体内显微术后将颈动脉切离，并用过氧化物酶缀合的山羊抗人IgG抗体进行免疫组织化学研究。在经Fc-GPVI-nt-处理的小鼠中，在血管损伤的腔面处检测到了Fc-GPVI-nt(附图15f)。这些资料共同证实了，Fc-GPVI-nt特异性与体内血管损伤位点结合，并防止随后的血小板募集。
可溶性GPVI对动脉粥样硬化的影响。四周龄apoE-/-小鼠(TheJackson Laboratory)饲用0.25％胆固醇饮食(Harlan Research diets)六周。两周后，对四只apoE-/-小鼠用Fc-GPVI-nt(200μg每只小鼠)每周注射两次，同时继续胆固醇饮食。采用类似的方案对四只apoE-/-小鼠注射对照Fc蛋白质(200μg)每周两次，将它们用作对照小鼠。为评估斑块形成，将动物杀死，并从动物中仔细分离出血管树。整个主动脉和颈动脉标本用0.9％氯化钠冲洗并固定。完整的血管标本用SUDAN III红染色以评估斑块形成，并在显微镜下观察。用Fc-GPVI-nt对易患动脉粥样硬化的apoE-/-敲除小鼠处理四周显著削弱动脉粥样硬化进程(附图16)。
实施例23糖尿病患者血小板上的CD61和CD32表面表达的FACS测定。从111名患糖尿病的病人或363名非糖尿病患者收集人柠檬酸盐血液。4℃ 2000rpm离心和洗涤程序(PBS 1×，pH7.2)并重悬后产生血小板富集的血浆(PRP)。加入用荧光团过氧化物酶(Immunotech)标记的抗CD61和抗CD32抗体或FITC标记的抗单克隆抗-GPVI抗体4C9。用Becton Dickenson FACScalibur装置完成FACS测定。用荧光定量表面表达。计算CD32荧光和4C9荧光的相关性，相关系数r＝0.516。
统计分析。用Mann-Whitney Rank Sum Test完成组平均值间的比较。数据代表平均值±s.e.m.。P＜0.05的值视为显著。
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权利要求
1.融合蛋白，包含(a)糖蛋白VI细胞外结构域或其具有胶原蛋白结合功能的变体，和(b)免疫球蛋白的Fc结构域或其功能保守性部分，它以附图7所示的氨基酸序列为特征，此处的融合蛋白可获自(a)感染后2天收集已用编码附图7所示氨基酸序列的Fc-GPVI-nt腺病毒感染的Hela细胞培养物上清液；(b)离心(3800g，30分钟，4℃)步骤(a)的上清液；(c)过滤(0.45μm)步骤(b)的上清液；(d)加入一倍体积的硫酸铵(761g/l)使免疫粘附素沉淀，并于4℃搅拌过夜；(e)离心(3000g，30分钟，4℃)使蛋白质成团，(f)将步骤(e)中的成团蛋白质溶于0.1倍体积的PBS，并在PBS中4℃透析过夜；(g)离心(3000g，30分钟，4℃)使蛋白质溶液澄清；(h)将步骤(g)中的溶液上载至蛋白质A柱(HiTrapTM蛋白质A HP，Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)；(i)用结合缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.0，0.02％NaN3)洗涤柱直至OD280＜0.01；(k)用洗脱缓冲液(100mM甘氨酸pH2.7)将级分洗脱；(l)用中和缓冲液(1M Tris/HCl pH9.0，0.02％NaN3)中和洗脱的级分；(m)合并级分；(n)4℃下将合并的级分在PBS中透析过夜，(o)将透析产物等分并于-20℃冷冻。
2.选自下组的核酸序列(i)SEQ ID No2的核酸序列或其根据遗传密码的简并性编码相同多肽的变体；(ii)编码与由SEQ ID No2编码的多肽具有至少70％同源性的多肽的核酸序列；(iii)编码至少300个氨基酸的多肽的核酸，其中具有至少100个氨基酸的片段其功能是结合胶原蛋白，具有至少200个氨基酸的片段其功能是作为Fc结构域；和(iv)编码权利要求10的融合蛋白的核酸序列。
3.权利要求1所定义的融合蛋白用于制备预防病人中动脉内血栓形成的药物的用途，所述病人的特征在于(i)已患有活性冠状动脉或颈动脉综合征和(ii)具有活性动脉内损伤。
4.根据权利要求3的用途，其中病人进一步的特征为患有不稳定动脉粥样硬化斑块。
5.根据权利要求3的用途，其中病人进一步的特征为患有慢性动脉粥样硬化进程。
6.根据权利要求3、4或5中任一的用途，其中药物经非肠道途径给药，优选以包含0.5至5.0mg/kg的剂量形式。
7.体内筛选由GPVI介导的血小板与活性血管内损伤粘附的抑制剂的方法，所述方法包括步骤(i)提供活性血管内损伤的体内模型；(ii)在测试化合物存在下测定血小板与活性血管内损伤的粘附，和(iii)如果与测试化合物不存在时相比在测试化合物存在下血小板与活性血管内损伤的粘附更少，则将该测试化合物鉴定为GPVI的抑制剂。
8.权利要求7的方法，其中所述模型为小鼠模型。
9.根据权利要求7或8的方法，其中用体内荧光显微术实施血小板与活性血管内损伤的粘附。
10.权利要求9的方法，其中在测试化合物存在下测定血小板与活性血管内损伤的粘附之前，将荧光血小板导入所述模型。
11.体外筛选由GPVI介导的血小板与活性血管内损伤粘附的抑制剂的方法，所述方法包括步骤(i)提供暴露胶原蛋白的表面；(ii)在预先确定的允许血小板粘附于胶原蛋白的条件下，将所述表面与血小板接触；(iii)在测试化合物存在下测定血小板的粘附；(iii)如果与所述测试化合物不存在时相比该测试化合物存在时血小板与胶原蛋白的粘附更少，则将该测试化合物鉴定为抑制剂；和(iv)可选地测定所述抑制剂对血小板凝集和/或血小板激活的功能效果。
12.预防或治疗动脉内血栓形成的药物，此药物含有权利要求1的融合蛋白或病毒载体中的权利要求2定义的核酸。
13.体外筛选糖蛋白VI与胶原蛋白结合的抑制剂的方法，包括(i)提供暴露胶原蛋白的表面；(ii)在预先确定的允许权利要求1的融合蛋白与所述表面结合的条件下，将所述表面的一部分与所述融合蛋白接触；(iii)在与步骤(ii)相同的条件下将所述表面的另一部分与所述融合蛋白在测试化合物存在下进行接触；(iv)确定在所述测试化合物不存在和存在的情况下，与所述表面结合的所述融合蛋白的量；(v)如果与所述测试化合物不存在时相比该测试化合物存在时所述融合蛋白与所述表面的结合更少，则将该测试化合物鉴定为抑制剂；和(vi)可选地测定所述抑制剂对血小板凝集和/或血小板激活的功能效果。
14.权利要求13的方法，其中所述融合蛋白带有荧光标记。
15.治疗患有急性冠状动脉或颈动脉综合征的病人的方法，为避免动脉内血栓形成所述方法包括向病人施用权利要求1的融合蛋白、或病毒载体中的权利要求2所定义的核酸的步骤。
16.融合蛋白用于制备治疗糖尿病的药物的用途，该融合蛋白包括(a)糖蛋白VI细胞外结构域或其具有胶原蛋白结合功能的变体，和(b)免疫球蛋白的Fc结构域或其功能保守性部分。
17.根据权利要求16的用途，其中该药物制备成用于治疗急性糖尿病并发症。
18.根据权利要求16至20任一项的用途，其中该药物经静脉内给药，优选以含有0.5至5.0mg/kg所述融合蛋白的剂量形式给药。
19.根据权利要求16的用途，其中该药物制备成用于治疗糖尿病患者的慢性动脉粥样硬化进程。
20.根据权利要求16至19中任一项的用途，其中该药物经皮下或腹膜内给药，优选以含有1至6.0mg/kg所述融合蛋白的剂量形式给药。
21.根据权利要求16至20中任一项的用途，其中该融合蛋白如权利要求中所定义。
22.根据权利要求16至20中任一项的用途，其中该融合蛋白为二聚体融合蛋白。
23.根据权利要求1的融合蛋白用于制备治疗或预防动脉粥样硬化的药物的用途。
24.根据权利要求22的用途，其中该药物经皮下或腹膜内给药，优选以含有1至6.0mg/kg所述融合蛋白的剂量形式给药。
25.制备如权利要求1所定义的融合蛋白的方法，它包括以下步骤(a)感染后2天收集已用编码附图7所示氨基酸序列的Fc-GPVI-nt腺病毒感染的Hela细胞培养物上清液；(b)离心(3800g，30分钟，4℃)步骤(a)的上清液；(c)过滤(0.45μm)步骤(b)的上清液；(d)加入一倍体积的硫酸铵(761g/l)使免疫粘附素沉淀，并于4℃搅拌过夜；(e)离心(3000g，30分钟，4℃)使蛋白质成团，(f)将步骤(e)中的成团蛋白质溶于0.1倍体积的PBS，并在PBS中4℃透析过夜；(g)离心(3000g，30分钟，4℃)使蛋白质溶液澄清；(h)将步骤(g)中的溶液上载至蛋白质A柱(HiTrapTM蛋白质A HP，Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden)；(i)用结合缓冲液(20mM磷酸钠缓冲液pH7.0，0.02％NaN3)洗涤柱直至OD280＜0.01；(k)用洗脱缓冲液(100mM甘氨酸pH2.7)将级分洗脱；(l)用中和缓冲液(1M Tris/HCl pH9.0，0.02％NaN3)中和洗脱的级分；(m)收集级分；(n)4℃下将收集的级分在PBS中透析过夜，(o)将透析产物等分并于-20℃冷冻。
全文摘要
本发明提供一种融合蛋白，它包括(a)糖蛋白VI细胞外结构域或其具有胶原蛋白结合功能的变体，和(b)免疫球蛋白的Fc结构域或其功能保守性部分。该融合蛋白的特征在于附图7所示的氨基酸序列，而且该融合蛋白可获自一种以特异二聚体形式提供该融合蛋白的方法。
文档编号A61K38/00GK1668721SQ03817279
公开日2005年9月14日 申请日期2003年6月5日 优先权日2002年6月7日
发明者S·玛斯彼尔格, M·伽瓦兹, A·布尔特曼, G·曼驰, M·安格尔, M·佩鲁索 申请人:普罗克得有限公司