专利名称：在预靶向的放射免疫治疗中有效增加放射性生物素浓度的抗生物素蛋白二聚体的利记博彩app
技术领域：
在此描述的发明涉及经修饰的抗生物素蛋白，其用于人类和动物的诊断和治疗，特别是用于诊断和治疗病理状况如肿瘤。
在此描述的发明涉及制备药物和诊断工具的技术领域，并提供化合物、其制备方法、其使用方法和在药学领域适于工业应用的包含所述化合物的组合物。
在此描述的发明提供化合物、组合物和方法，其用于诊断性和治疗性药物，作为图象获取技术和对器官和组织的病理情况的治疗。
特别地，但并非除外地，本发明涉及通过放射性药物进行肿瘤治疗的领域。
背景技术：
肿瘤治疗主要通过使用旨在杀死肿瘤细胞的物质来实施。这可以采用必须进入肿瘤细胞以发挥其全部效应的细胞毒性物质来实现，或通过用足够能量的辐射处理肿瘤细胞以杀死细胞。在这两种情况下，均存在尽可能选择性地将物质递送到靶细胞的问题，以避免对周围健康细胞的可能损伤。对于放射性药物，即负载放射性部分的物质，将活性部分(也就是说放射性部分)选择性地递送到肿瘤靶标，避免放射性核素在体内或在围绕肿瘤周围的健康细胞中扩散的问题尤为令人关注。
一种特别有效的肿瘤检测和治疗方法描述于专利EP 0 496 074。该专利的方案已被应用于对脑肿瘤进行的所谓的预靶向的抗体引导的放射免疫治疗(PAGRIT)。在该方法中，在生物素化的抗腱生蛋白单克隆抗体(Mab-B)后，将抗生物素蛋白注射到人类对象中，通过与其形成复合体而从血流中除去未与肿瘤结合的任何游离的Mab-B，所述复合体由肝脏有效除去(追踪效应)。然后给予链霉抗生物素输注，目的在于与用抗生物素蛋白可获得的相比，获得对肿瘤的更好抗生物素蛋白化，其中与链霉抗生物素相比，抗生物素蛋白在血液中的持久性太短。
虽然该体系显示出阳性的临床反应(Cremonesi，M.等人，1999；Paganelli，G.等人，1999；Paganelli，G.等人，2001)，一个主要的限制因素在于链霉抗生物素引起的强免疫应答(Paganelli，G.等人，1997)。为了克服这两个障碍，即链霉抗生物素的高度免疫原性，和抗生物素蛋白的快速清除，已采用了经化学修饰的抗生物素蛋白，通过将聚乙二醇(PEG)链共价结合到抗生物素蛋白，基于使用不同分子量的直链或支链PEG而具有不同衍生水平。初步研究显示，随着PEG对抗生物素蛋白官能化(在下文中称为聚乙二醇化)程度的增加，抗生物素蛋白的血浆半衰期延长，免疫原性下降，并且该物质相对于肿瘤的特异性生物分布改善。
由于聚乙二醇化降低抗生物素蛋白-PEG结合Mab-B生物素的能力，结果是衍生物的效力的下降(Chinol，M.等人，1998)。
对这个问题的解决方案在以Immunomedics的名义提交的专利申请WO 94/23759中提出，其中基于高分子量分子(优选大于5,000Da，如葡聚糖、蛋白质和聚羧酸)的化学衍生描述了抗生物素蛋白共聚物。但在该专利中实际描述的五种多聚体中没有一种就其在预靶向过程或其它过程中的作用效力进行过表征。
如在此描述的发明所表明的，在上述专利申请WO 94/237599中给出的多聚化(也包括二聚化)的一般构思并未对一般技术人员提供完全和充分的指导以寻找能满足在三步预靶向方法应用中的必要条件的通用抗生物素蛋白多聚体。事实上，使用不同的双官能交联剂获得的不同的二抗生物素蛋白(diavidin)尽管具有结合游离生物素的相同能力，但当在体外在三步预靶向中进行测定时其效力不同，差异程度在某些情况下被证实是完全无效力的。
该观察结果表明，抗生物素蛋白的多聚化并不自动产生有用的功能性产物，对于适于预靶向的加强分子的选择而言，生物学表征是必要的。
发明概述现已发现，通过用选自二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(二聚体在下文中称为二抗生物素蛋白1)和分子量3400的PEG二胺(二聚体在下文中称为二抗生物素蛋白2)的能结合抗生物素蛋白的氨基和/或羧基基团的双官能接头结合两个抗生物素蛋白分子，获得两个抗生物素蛋白二聚体，其满足用于称为PAGRIT的肿瘤治疗方法的必要条件。
因此在此描述的本发明的目的是其中两个抗生物素蛋白分子通过辛二酸酯经由-NH2基团结合的抗生物素蛋白二聚体，和其中两个抗生物素蛋白分子通过分子量为3400的聚乙二醇经由-COOH基团结合的抗生物素蛋白二聚体。
在此描述的本发明的另外目的是包含上述二抗生物素蛋白的药物组合物和/或诊断组合物。
本发明的其它目的是二抗生物素蛋白作为用于器官和组织的病理情况的药物或诊断剂的用途，特别是用于制备用于治疗或诊断肿瘤的药物。
与本发明相关的这些和其它目的将在以下详细说明，同时还提供了试验实施例。
发明详述在本发明中，抗生物素蛋白意指抗生物素蛋白和链霉抗生物素，但在其中链霉抗生物素用作本发明的特定具体实施方案的情况下，会指明这一实际情况。
二抗生物素蛋白1是这样制备的使抗生物素蛋白与具有N-羟基琥珀酰亚胺基(NHS酯)作为活性酯的二琥珀酰亚胺基辛二酸酯(DSS)反应，DSS是有结合抗生物素蛋白的-NH2基团的活性的同双官能交联剂。
二抗生物素蛋白2和二抗生物素蛋白3(阴性对照)是分别使用分子量为3400的PEG二胺(PEG(NH2)2)和分子量为3400的聚乙二醇-二琥珀酰亚胺基丙酸[PEG(SPA)2]作为同双官能交联剂产生的。
由于与抗生物素蛋白相比链霉抗生物素较慢地从循环中消除，二链霉抗生物素是本发明一个特定的具体实施方案。较长的半衰期对于实现抗生物素蛋白效力的最大增加是关键的。对于链霉抗生物素交联的方案与二抗生物素蛋白1制备所用的相类似。
在此描述的本发明的药物组合物或诊断组合物包含至少一种在此描述的二抗生物素蛋白。二抗生物素蛋白将处于与药学中常用的合适的载体和/或赋形剂所形成的混合物中，所述载体和/或赋形剂诸如描述于最新版“Remington’s Pharmaceutical Sciences Handbook”中的那些。本发明的组合物将含有有效量的二抗生物素蛋白。
优选的药物组合物的实例是那些允许胃肠外和局部区域给药的组合物。适于所述目的的药物组合物是溶液、悬浮液和有待在用时重构的冻干形式。
有关本发明的二抗生物素蛋白的用途，这些物质特别适于制备用于通过称为用抗体进行预靶向的技术来诊断或治疗组织的病理情况如肿瘤的药物或诊断工具，并且出于此原因，这些物质还适于体外预靶向技术。举例来说在一个实施方案中，用生物素化的抗腱生蛋白抗体，优选单克隆抗体，来实施预靶向技术。
本发明的工业应用的合适形式还有用于诊断或治疗的试剂盒，特别是用于肿瘤的放疗，例如描述于EP 0 496 074，公开在EuropeanJournal of Nuclear Medicament Vol.26，No 4；April 1999；348-357中的Paganelli，Chinol等人的研究，US 5.968.405和相关文献。
在此描述的本发明的另一个目的是用于肿瘤治疗或诊断的试剂盒，特别是通过放射性的方式，例如采用预靶向方法，优选三步，特征在于所述试剂盒的至少一种组分含有二抗生物素蛋白。在所述试剂盒中，一种优选的生物素化抗体是抗腱生蛋白抗体，甚至更优选单克隆抗体。
以下实施例进一步例示本发明。
实施例1二抗生物素蛋白1将1ml抗生物素蛋白溶液(300μM在PBS中，pH7.4)与25μlDSS(Pierce)(25mM在DMSO中)混合(抗生物素蛋白∶DSS比1∶2)。将混合物在0℃温育2小时，然后用50μl Tris(1M，pH8.0)阻断反应。上述反应比的选择是基于采用1∶1-1∶10的比例的初步试验。
反应方案如下 (二抗生物素蛋白1)实施例2二抗生物素蛋白2将1ml抗生物素蛋白(450μM在PBS中，pH7.4)与120μlPEG(NH2)2(Shearwater Corp.)(9mM，在H2O中)和50μl 1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺-HCl(EDAC)(260mM，在DMSO中)混合(抗生物素蛋白∶PEG比约1∶2.5)，并置于室温下反应2小时。反应结束时，加入50μl Tris(1M，pH8.0)，将混合物进行凝胶过滤。抗生物素蛋白∶PEG比是在1∶1-1∶10的范围内于4.0-8.0的反应pH进行研究的。在纯化的二抗生物素蛋白2终产物中的PEG∶抗生物素蛋白的比值为0.9，使用Sim等人1980所述的方法。简而言之，将二抗生物素蛋白2在水中稀释至300μM，向1ml体积中加入250μl在1N HCI中的5％BaCl2溶液，然后加入250μl通过在100ml2％KI中混合1.27g I2而制备的溶液。将混合物温育15分钟，然后在535nm读取吸光度。用PEG(NH2)2获得标准曲线。
二抗生物素蛋白2的反应方案如下
(二抗生物素蛋白2)实施例3二抗生物素蛋白3将1ml抗生物素蛋白(150μM在PBS中，pH7.4)与20μl PEG二琥珀酰亚胺基-丙酸酯(SPA-PEG-SPA)(20mM在H2O中)混合(抗生物素蛋白∶PEG比1∶3.5)，并置于0℃反应2小时。反应比的选择是基于采用1∶2-1∶10的比例进行的初步试验。如使用上述Sim等人开发的方法所测定的，在纯化的二聚体中PEG∶抗生物素蛋白的比值为3∶1。反应方案如下 (二抗生物素蛋白3)在实施例1、2和3中描述的3个反应的二抗生物素蛋白产率为大约20-30％。增加反应中的3种接头的量，获得的抗生物素蛋白寡聚体(三聚体等，未显示)的最终量增大，结果在色谱分离中有困难。在Superdex 200-10/30凝胶过滤柱上分析反应混合物，而产物的纯化在Superdex 200-16/60柱上完成。二抗生物素蛋白1、2和3的反应混合物的色谱曲线图分别如
图1a，b和c所示。在各自的洗脱时间标明了一系列标准蛋白质的分子量(校准)。柱的校准如图1d所示采用葡聚糖蓝(Vo)，铁蛋白(444KDa)，醛缩酶(158KDa)，白蛋白(67KDa)，和核糖核酸酶(14KDa)。
纯化的抗生物素蛋白二聚体呈现于图1e，f和g。样品在Superdex200-10/15上分离，流速0.5ml/min(a-d)和1ml/min(e-g)，在PBS中，在连接至280nm分光光度计的Jasco HPLC系统上进行。
实施例4二链霉抗生物素蛋白将1ml链霉抗生物素(300μM在PBS中，pH7.4)与25μl DSS(25mM，在DMSO中)以链霉抗生物素∶DSS比为1∶2混合，并在0℃温育2小时，然后用50μl 1M TRIS(pH8.0)终止反应。总共测试了4种反应条件，链霉抗生物素∶DSS比从1∶1-1∶10。我们选择上述比1∶2。
反应方案类似于在之前实施例中所报道的。
对于二链霉抗生物素，在反应结束时交联混合物的色谱曲线图如图5a所示。纯化的二链霉抗生物素如图5b所示，而链霉抗生物素如图5c所示。样品在Superdex 200 10/15柱上分析，流速1ml/min，在PBS中，在连接至测量280nm吸光度的分光光度计的Jasco HPLC系统上进行。
测定二抗生物素蛋白结合生物素的能力为了比较抗生物素蛋白和二抗生物素蛋白结合生物素的能力，采用HABA(4-羟基-偶氮苯-2’-甲酸)方法。抗生物素蛋白和二抗生物素蛋白均为相当于3μM 67KDa抗生物素蛋白单体的浓度，在0.1M磷酸盐，0.4mM HABA中，pH7.0。然后加入溶解于磷酸盐的生物素至终浓度从0-20μM，在500nm测量吸光度。
结合生物素的能力被评价为置换50％结合的HABA所必需的生物素浓度。
对于抗生物素蛋白和3种二抗生物素蛋白，大约5μM生物素都能置换50％HABA(图2)，由此可以推出二抗生物素蛋白在交联之后保存了结合位点总数。二抗生物素蛋白的生物素结合特性与抗生物素蛋白的相当。
体外预靶向试验为了测试二抗生物素蛋白增加通过生物素化抗腱生蛋白单克隆抗体(Mab-B)与腱生蛋白结合的放射性标记的生物素的量的能力，采用如图3所示的体外预靶向试验。
简而言之，在4℃使96孔板吸附0.5μg/孔的人腱生蛋白(Tn-C)16小时。用PBS和0.1％Tween 20洗3次之后，将孔中的剩余吸附位点用PBS，2％BSA2％和0.1％ Tween 20在室温下封闭1小时。然后在孔中于10μg/ml的饱和浓度将两种生物素化抗腱生蛋白单克隆抗体(ST2146或ST2077)温育2小时。如上冲洗后，以增加的浓度在孔中一式两份温育抗生物素蛋白或二抗生物素蛋白。最后，在每孔中温育5pmol饱和量的生物素-3H(1.6TBq/mmol)1小时。冲洗之后，在β计数器中读板。如图4所示，对于所用的两种MAb，与抗生物素蛋白相比，二抗生物素蛋白1和二抗生物素蛋白2使结合的生物素增加；二抗生物素蛋白3对于MAb ST2146未显示增加，或对MAbST2077显示出结合能力下降。
与抗生物素蛋白相比，对于Mab ST2077，二抗生物素蛋白2在2.5μg/ml的浓度显示出结合的生物素-3H的量增加2.1倍(3次试验的平均值)。对于二抗生物素蛋白1，增加为1.6倍(6次试验的平均值)，而对于二抗生物素蛋白3，结合能力低于(90％)抗生物素蛋白单体。
由这些试验可以得出结论，接头的长度和在二抗生物素蛋白二聚体中包含的结合位点均影响二聚体在生物素化抗体介导的预靶向中的活性。
二链霉抗生物素证实在体外比链霉抗生物素更有效，如图6所示。
在4℃，用0.5μg/孔的人Tn-C包被96孔微量滴定板16小时，用PBS，0.1％Tween 20洗3次，然后用PBS/2％BSA/0.1％ Tween-20封闭非特异性结合。以10μg/ml的浓度加入生物素化抗-TnC抗体ST2146温育2小时。用PBS/Tween-20将孔洗3次，然后以指示的浓度加入链霉抗生物素或二链霉抗生物素。最后，加入5pmol 3H-生物素(1.6TBq/mmol)，将孔温育2小时，冲洗，并在β计数器中计数。
如图6所示，与链霉抗生物素相比，二链霉抗生物素介导放射性标记的生物素的结合增加。
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权利要求
1.抗生物素蛋白二聚体，其中两个抗生物素蛋白分子通过辛二酸酯经由-NH2基团结合。
2.抗生物素二聚体，其中两个抗生物素蛋白分子通过分子量为3400的聚乙二醇经由-COOH基团结合。
3.权利要求1或2的二聚体，其中抗生物素蛋白是链霉抗生物素。
4.药物和/或诊断组合物，包含权利要求1-3任一项的二聚体。
5.权利要求4的组合物，其可胃肠外或局部区域给药。
6.权利要求1-3任一项的二聚体用于制备药物和诊断工具的用途。
7.权利要求1-3任一项的二聚体在制备用于诊断或治疗器官或组织的病理情况的药物中的用途。
8.权利要求1-3任一项的二聚体在制备用于治疗或诊断肿瘤的药物或诊断工具中的用途。
9.权利要求1-3任一项的二聚体在体外采用抗体的预靶向方法中的应用。
10.权利要求1-3任一项的二聚体在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中所述治疗是用抗体采用预靶向方法进行的。
11.权利要求10的用途，其中所述疾病是肿瘤。
12.权利要求10的用途，其中所述抗体是抗腱生蛋白抗体。
13.权利要求12的用途，其中所述抗腱生蛋白抗体是单克隆抗体。
14.权利要求10的用途，其中所述药物是试剂盒的一部分，所述试剂盒用于通过三步预靶向技术诊断和治疗肿瘤。
15.权利要求14的用途，其中所述试剂盒包含放射性药物。
16.用于肿瘤的放疗或诊断的试剂盒，特征在于所述试剂盒的至少一种组分包含权利要求1或2的二聚体。
17.权利要求16的试剂盒，用于预靶向技术。
18.权利要求17的试剂盒，其中所述预靶向技术是三步。
19.权利要求16、17或18任一项的试剂盒，包含生物素化抗腱生蛋白抗体。
20.权利要求19的试剂盒，其中所述抗体是单克隆抗体。
全文摘要
本发明描述了抗生物素蛋白和链霉抗生物素的二聚体(二抗生物素蛋白)，其中接头是辛二酸酯，其依次结合到生物素的不同官能基团(－NH
文档编号A61K39/395GK1638807SQ03804636
公开日2005年7月13日 申请日期2003年3月6日 优先权日2002年3月8日
发明者R·德圣缇斯, R·林德斯特德, C·A·奴佐罗 申请人:希格马托制药工业公司