一种新型导向溶栓剂，其制备方法及用途的利记博彩app

专利名称：一种新型导向溶栓剂，其制备方法及用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物技术领域，更确切地说涉及一种新型导向溶栓剂，还涉及其制备方法及应用。
背景技术：
随着社会工业化程度的提高，生活节奏加快及饮食习惯的改变，心血管疾病已经成为当今世界上威胁人类最严重的疾病之一，其发病率和死亡率已超过肿瘤性疾病而跃居第一。其中血栓病引起的死亡率和致残率极高，常见的血栓性疾病主要有急性心肌梗死、脑血栓和静脉血栓等。血栓在血液循环系统中的非正常形成往往是导致此类疾病的直接原因。因此有效地清除堵塞血管的病理性血栓，疏通血管，恢复缺血组织正常的血液流通，实现对组织正常的营养、氧气供应，成为治疗的关键。目前的治疗主要包括两个方面手术治疗及药物治疗。作为常规的治疗手段，选用良好的溶栓药物一直是治疗方案的首选。
经过30多年的研究和实践，溶栓制剂经历了多次的更新换代，第一代溶栓制剂包括链激酶、尿激酶等，第二代溶栓制剂包括t-PA，scu-PA和葡激酶等。但这些溶栓制剂在临床应用中都出现了一些明显的问题，主要集中体现在对血栓的特异性差、临床使用剂量大，并导致全身性出血等毒副作用。因而目前，国内外都在积极地开展第三代溶栓药物的研制。第三代溶栓制剂研制的思路是通过基因工程技术，对天然的溶栓药物进行结构改造，以提高溶栓剂的血栓特异性和延长溶栓剂的半衰期，从而减少溶栓剂的临床使用剂量，减少其毒副作用。目前的研究主要集中在两个方面，其一为改造t-PA或构建t-PA/scu-PA嵌合体，以期提高溶栓制剂对血栓特异性溶解能力。第二个方面则主要是利用血栓特异性抗体进行导向溶栓。目前，在导向溶栓制剂的研制中都是采用尿激酶或低分子量单链尿激酶作为溶栓剂，因而研究的焦点在于导向抗体。由于在血栓形成过程中，产生了一些新的抗原标志，包括纤维蛋白，激活的血小板表面GPIIb/IIIa受体以及损伤血管内皮等，因而这些抗原标志提供了导向抗体的结合靶位作用。
在国外，早在二十世纪九十年代初就开始了利用抗人纤维蛋白的抗体进行导向溶栓药物的研制，在不同的动物(包括仓鼠和狒狒等)体内进行溶栓实验表明，构建的抗体-尿激酶杂合体能够降低溶栓剂的使用剂量10倍以上，而且能够极大的延长溶栓剂在体内的半衰期。(Characterization of achimeric plasminogen activator consisting of a single-chain Fv fragment derivedfrom a fibrin fragment D-dimer-specific antibody and a truncated single-chainurokinase.J Biol Chem.1991 Oct 15；266(29)19717-24.)在1999年，德国汉堡大学的一个研究小组利用抗人纤维蛋白抗体和抗活化血小板抗体与尿激酶进行偶联，制备了双特异性的导向溶栓制剂，体外实验表明，制备的双特异性的导向溶栓制剂的纤溶活性提高约10倍(Abispecific antifibrin-antiplateleturokinase conjugate(BAAUC)induces enhanced clot lysis and inhibits plateletaggregation.Biochim Biophys Acta 2001 Apr 7；1546(2)399-405)。但是这些研究所用的导向抗体都为鼠抗体，而鼠抗体用于体内时因其较强的免疫原性而导致人抗鼠抗体反应(HAMA)，并降低了重复用药的效果。因而近年来，国外大量的研究单位和制药公司都在积极的研制免疫原性低的人源化(humanized)抗体或人抗体。截至到2002年，文献报导的在美国进行临床试验的约100多种抗体中，其中绝大部分为人源化抗体和人源性抗体(其中有大约60％为人源化抗体)。因而在现阶段，制备和采用免疫原性更低的人源化抗体或人源性抗体作为导向抗体研制导向溶栓药物是大势所趋。

发明内容
本发明提供了一种新型导向溶栓制剂，该溶栓制剂是一种杂合体，是将抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶(scu-PA-32k，残基144-411)融合而成。本发明主要包括如下内容鼠抗人纤维蛋白单链抗体(A11)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，残基144-411)杂合体，它具有序列表中序列1所示的氨基酸序列，或序列表中序列1的一个或几个氨基酸经过取代，缺失或增加后衍生的，具有与原序列相同功能的氨基酸序列。
编码上述杂合体氨基酸序列的DNA序列，其中之一如序列表中序列2所示。
上述杂合体的制备方法包括如下步骤1、A11-scuPA32k融合基因的构建和克隆鼠抗人纤维蛋白单链抗体(A11)为本发明的发明人利用噬菌体表面呈现技术筛选到的一株对人纤维蛋白特异的鼠抗体。利用PCR等方法，构建出A11-scuPA32k融合基因，该融合基因的DNA序列之一如序列表中序列2所示。然后利用常规的分子克隆技术将该融合基因克隆至原核表达载体pET15，转化大肠杆菌BL21(DE3)，建立表达A11-scuPA32k融合基因的工程菌株。
2、A11-scuPA32k融合基因在大肠杆菌中的可溶性表达利用IPTG诱导，如上所述的工程菌株能够表达重组A11-scuPA32k杂合体，而且胞内可溶组分中能够检测到明显的尿激酶活性，表明重组蛋白至少部分以可溶蛋白形式存在于胞内。
3、重组A11-scuPA32k杂合体的纯化利用兔抗尿激酶抗体，采用亲和层析方法对表达的重组A11-scuPA32k杂合体进行纯化，纯化产物达到电泳纯(图1)。重组A11-scuPA32k杂合体具有序列表中序列1所示的氨基酸序列。
4、重组A11-scuPA32k杂合体的体外活性分析利用溶圈法分析纯化后重组A11-scuPA32k杂合体的尿激酶的溶纤功能，利用体外血栓吸附实验分析纯化后重组A11-scuPA32k杂合体结合血栓的能力，结果表明制备的重组A11-scuPA32k杂合体保持了良好的双功能(图2，图3)。
5、重组A11-scuPA32k杂合体的体内溶栓实验在大鼠体内制备血栓模型，分析重组A11-scuPA32k杂合体的体内溶栓效果，结果表明得到相同体内溶栓效果时，重组鼠单链抗体-尿激酶融合蛋白的用量约为尿激酶用量的1/4(图4，5，6，7)。
人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体(IIn)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，残基144-411)杂合体，它具有序列表中序列5或7所示的氨基酸序列，或序列表中序列5或7的一个或几个氨基酸经过取代，缺失或增加后衍生的，具有与原序列相同功能的氨基酸序列。
编码上述杂合体氨基酸序列的DNA序列，其中编码序列表中序列5所述氨基酸序列的DNA序列之一如序列表中序列6所示，编码序列表中序列7所述氨基酸序列的DNA序列之一如序列表中序列8所示。
上述杂合体的制备方法包括如下步骤1、IIn-scu-PA-32k融合基因的构建和克隆在分子模建的基础上，利用表面重塑的人源化方案对鼠抗人纤维蛋白单链抗体进行了人源化改造。然后借助于噬菌体表面呈现技术，采用CDR3突变和DNA shuffling等方法对人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体进行了体外亲和力成熟，并筛选到如序列表中序列3所示的一株人源化单链抗体，该人源化单链抗体的亲和力和特异性都较亲本鼠抗体更好(图8)。
利用PCR等其他分子生物学方法，构建出如序列表中序列6和8中所示的两种IIn和scuPA32k的融合基因，两种融合基因的主要差别在于IIn和scuPA32k的顺序不同，一种为IIn-scuPA32k，另一种为scuPA32k-IIn。然后利用常规的分子克隆技术分别将该融合基因克隆至真核表达载体pMCE(图9)，构建了两种融合基因的真核表达载体pMCE-IIn-scuPA32k(图10)和pMCE-scuPA32k-IIn(图11)。
2、高效表达IIn和scuPA32k融合基因的CHO细胞株的建立利用invitrogen公司的脂质体lipofectinAMINE2000，分别将构建的两种融合基因，即IIn-scuPA32k和scuPA32k-IIn的真核表达质粒转染CHO/dhfr-细胞株。分别用G418筛选表达IIn-scuPA32k杂合体或scuPA32k-IIn杂合体的阳性克隆，然后利用MTX分别对阳性克隆进行加压以扩增目的基因在基因组中拷贝数，并筛选和亚克隆高表达IIn-scuPA32k杂合体或scuPA32k-IIn杂合体的细胞株。表达该两种杂合体细胞株的表达量都达到10μg/106细胞·24小时。
3、重组IIn-scuPA32k和scuPA32k-IIn杂合体的体外活性分析利用溶圈法分析重组IIn-scuPA32k和scuPA32k-IIn杂合体的尿激酶的溶纤功能，利用ELISA分析表达的IIn-scuPA32k杂合体或scuPA32k-IIn杂合体对抗原D-Dimer的结合能力。结果表明CHO细胞表达的IIn-scuPA32k杂合体或scuPA32k-IIn杂合体都保持了良好的双功能(图12，表1)。
表1ELISA分析IIn-scupa32k和scupa32k-IIn杂合体的抗体活性样品(n＝3)CHO/dhfr- IIn-scupa32kScupa32k-IInOD4920.04±0.010.87±0.15 0.76±0.10本发明的抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶的杂合体，为一种具有导向溶栓功能的新型溶栓制剂，可用于治疗血栓性心脑血管疾病。
本发明的杂合体，具有单链抗体结合抗原D-dimer(DD)活性，其对血栓的结合能力强，得到相同体内溶栓效果时，重组鼠单链抗体-尿激酶融合蛋白的用量比尿激酶用量少的多，具有导向和溶栓双功能，具有广阔的临床应用前景。


图1为纯化后重组A11-scupa32k的SDS-PAGE。其中A为纯化后重组A11-scupa32k，B为低分子量蛋白标准图2为溶圈法分析A11-scupa32k溶纤活性。其中
A为PBS标准B为纯化后重组A11-scupa32kC为尿激酶标准(1IU)图3为体外血栓吸附实验分析A11-scupa32k的血栓结合能力。
图4为近心端血管温度变化(UK组)。
图5为近心端血管温度变化(Ab-UK组)。
图6为血栓块重量变化(UK组)。
图7为血栓块重量变化(Ab-UK组)。
图8为人源化单链抗体与鼠单链抗体的相对亲和力和特异性比较。
图9为质粒pMCE结构示意图。
图10为质粒pMCE-IIn-scuPA32k结构示意图。
图11为质粒pMCE-scuPA32k-IIn结构示意图。
图12为溶圈法分析IIn-scupa32k和scupa32k-IIn杂合体的溶纤能力。
其中A为2IU尿激酶标准B为含IIn-scupa32k杂合体的细胞培养上清C为含scupa32k-IIn杂合体的细胞培养上清D为CHO/dhfr-细胞的培养上清(对照)具体实施方式
实施例一 鼠抗人纤维蛋白单链抗体(A11)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，残基144-411)融合基因的构建、表达、纯化和体内外活性分析一、材料菌株E.coli BL21(DE3)购自novagen公司；质粒pET15b-HLSP2为本室构建，克隆有低分子量尿激酶基因(参见文献生物工程学报，2000，16(4)514-516)，质粒pCANTAB5E-A11为本室构建，克隆有鼠抗人纤维蛋白单链抗体(A11)基因(参见文献生物技术通讯，1996，7(1)1-5)。
引物P1见序列表中序列9，P2见序列表中序列10。
化学试剂与酶类常用限制性内切酶、T4 DNA连接酶、pfu DNA聚合酶，dNTP等购自TAKARA公司和上海生工生物技术公司；抗原D-dimer(DD)，为人交联纤维蛋白经纤溶酶原水解后产生的一个特异性降解片段，带有交联纤维蛋白的特异性抗原表位(Pizzo SV，Taylor LM Jr，Schwartz ML，et al.Subunit structure of fragment from fibrinogen and cross-linked fibrin.J Biol Chem.1973 Jul 10；248(13)4584-90.)；兔抗人尿激酶IgG为本室制备；其他常用生化试剂市购，为分析纯。
实验设备PCR仪(PE GeneAmp PCR system 2400)，超声波破碎仪(ColePalmer CPX-600)，透射式紫外分析仪(LKB 2011 Macrovue)，高速冷冻离心机(Beckman J2-21)，台式高速冷冻离心机(Sigma 3K 12)，低温循环水浴槽(LKB 2219 Multiteivip II)，低温冰箱(San Yo Medical freezer)，电子分析天平(Chyo JP-300 WP)，微型蛋白电泳仪(BioRAD Mini II)，721型分光光度计(上海，冷光牌)，恒温空气浴摇床(哈尔滨医疗器材厂)，恒温水浴摇床(哈尔滨医疗器材厂)。
二、方法与结果1、鼠抗人纤维蛋白单链抗体(A11)-低分子量尿激酶(scu-PA-32k，残基144-411)融合基因的构建以质粒pET15b-HLSP2为模板，以P1和P2为引物，用pfuDNA聚合酶扩增低分子量尿激酶基因(scuPA32k)，并在其5’端添加连接肽(G4S)3的编码基因。电泳回收约870bp的PCR产物，用NotI和NdeI双酶切处理；载体pCANTAB5E-A11用NcoI和NotI双酶切处理，电泳回收约750bp的A11基因；载体pET15用NcoI和NdeI双酶切处理，回收载体大片段。随后进行三片段连接，构建原核表达质粒pET15b-A11-scuPA32k，转化E.coliBL21(DE3)。挑取单克隆，首先提质粒进行酶切鉴定，取酶切鉴定正确者进行序列分析，结果表明序列完全正确。
2、A11-scuPA32k融合基因在大肠杆菌中的可溶性表达将鉴定正确的pET15b-A11-scuPA32k质粒转化E.coliBL21(DE3)，同时以pET15b-A11质粒转化E.coliBL21(DE3)作为对照。分别挑取单克隆，接种于3ml含200μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中，37℃，250rpm培养过夜。然后按1∶500转接于500ml含200μg/ml氨苄青霉素(Amp)的LB培养基中，30℃，250rpm培养至OD600达到0.8，加入IPTG至终浓度为1mM诱导表达5小时，然后5000g，4℃，20min离心收菌，重悬于200mlPBS中，5000g，4℃，20min收菌，重悬于50ml PBS中，超声破碎细菌。然后10000g，4℃，20min离心，取上清，用溶圈法分析上清中尿激酶活性，结果表明表达上清中能够检测到尿激酶活性。
3、重组A11-scuPA32k杂合体的纯化首先用抗人尿激酶IgG与CNBr活化的Sepharose 4B偶联，制备人尿激酶抗体亲和柱；然后将如上制备的上清上抗体亲和层析柱，随后用0.2MHcl-Glycine(pH2.0)洗脱，收集洗脱液，进行SDS-PAGE电泳分析，结果表明纯化产物达到电泳纯(图1)。
4、重组A11-scuPA32k杂合体的体外活性分析4.1溶圈法测定尿激酶的溶纤活性，详见文献(军事医学科学院院刊，1987；11101)，结果表明纯化产物具有尿激酶的溶纤活性(图2)。
4.2体外血栓结合实验分析单链抗体活性4.2.1血栓的制备取新鲜人血浆5ml，加入2单位牛凝血酶原，迅速混匀，用注射器灌注入硅胶管内，置37℃温育30分钟，凝固后用刀片将硅胶管切成1cm小段，用注射器吹出硅胶管内血浆凝块，即为体外制备的血栓柱。
4.2.2体外血栓结合实验取干净试管，加入2ml经适当稀释的纯化样品，然后加入上述制备的血栓柱两条，放37℃水浴，每10分钟取出50μl上清至干净离心管中，取出的样品同样置37℃水浴。80分钟后结束实验。
4.2.3用溶圈法检测各时间点样品中尿激酶活性残留情况，以确定重组A11-scuPA32k杂合体与血栓结合能力。结果表明纯化产物具有明显的体外血栓结合能力(图3)。
5、重组A11-scuPA32k杂合体的体内溶栓实验5.1实验动物实验采用Wistar雌性大鼠，180～200g。
5.2血栓模型的建立动物用2％戊巴比妥钠麻醉，取腹主静脉，阻断血管两端，取出血管内血液，注入0.2ml人的血液，30min后即可。
5.3给药方法及给药剂量给药方法采用尾静脉给药，给药剂量为8、2、1、0.5万单位/Kg。
5.4实验分组实验设正常对照组(注射生理盐水)，2、8万单位尿激酶(UK)给药组和0.5、1、2、8万单位A11-scuPA32k(Ab-UK)给药组。对照组10只动物，UK组90只动物，AB-UK组180只动物。
5.5观察指标及疗效评价A远心端、近心端温度变化。血栓形成后在血管远心端和近心端分别测定给药前血管温度的正常值，给药后每隔15min测定温度一次，直至给药后3小时，比较动物给药前后及不同时间血管温度变化情况。
B根据实验分组，正常对照组动物，血栓形成后立即取出血管血块，称其重量，作为药前值。给药组分别在给药后30、45、60、75、90、105、120、150、180min取出血栓，称重，观察比较不同药物、给药不同时间血栓大小变化情况。
结果表明得到相同体内溶栓效果时，重组鼠单链抗体-尿激酶融合蛋白的用量约为尿激酶用量的1/4(图4，5，6，7)。
实施例二 人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体(IIn)和低分子量尿激酶(scu-PA-32k，残基144-411)融合基因的构建、表达及活性分析一、材料菌株E.coli XL1-blue为本室保存，CHO/dhfr-细胞株购自美国ATCC公司；质粒pcDNA3.1(+)购目invitrogen公司；质粒pSV2-dhfr，购自ATCC公司；质粒pIRESneo购自Clontech公司。质粒pET15b-IIn-UK为本室构建(参见文献生物工程学报，2002，18(4)509-511)，该质粒克隆有人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体(IIn)基因及低分子量尿激酶(scuPA32k)突变基因，该基因的突变都为同义突变，不改变其编码的氨基酸序列，详见序列表中序列3，质粒pET15b-HLSP2克隆有低分子量尿激酶基因(参见文献生物工程学报，2000，16(4)514-516)。引物P3见序列表中序列11，P4见序列表中序列12，P5见序列表中序列13，P6见序列表中序列14，P7见序列表中序列15，P8见序列表中序列16，P9见序列表中序列17，P10见序列表中序列18。
化学试剂与酶类常用限制性内切酶、T4 DNA连接酶、pfu DNA聚合酶，dNTP等购子自TAKARA公司和上海生工生物技术公司；抗原D-dimer(DD)，为人交联纤维蛋白经纤溶酶原水解后产生的一个特异性降解片段，带有交联纤维蛋白的特异性抗原表位，为本室制备；羊抗兔IgG-HRP购自北京中山生物技术公司；其他常用生化试剂购自军事医学科学院条件处，为分析纯。
实验设备PCR仪(Perkin Elmer GeneAmp PCR system 2400)，超声波破碎仪(Cole Palmer CPX-600)，透射式紫外分析仪(LKB 2011Macrovue)，高速冷冻离心机(Beckman J2-21)，台式高速冷冻离心机(Sigma 3K 12)，低温循环水浴槽(LKB 2219 Multiteivip II)，低温冰箱(SanYo Medical freezer)，电子分析天平(Chyo JP-300 WP)，微型蛋白电泳仪(BioRAD Mini II)，台式高速离心机(上海，TGL·16G型)，洁净工作台(北京半导体一厂)，721型分光光度计(上海，冷光牌)，恒温空气浴摇床(哈尔滨医疗器材厂)，恒温水浴摇床(哈尔滨医疗器材厂)，二氧化碳培养箱(德国，Hereaus)二、方法与结果1、真核表达质粒pMCE的构建以质粒pSV2-dhfr为模板，以P9和P10为引物，扩增出DHFR基因，然后利用smaI+xbaI双酶切分别处理载体pIRESneo和回收的PCR产物，将DHFR基因克隆至载体pIRESneo(替换neo基因)，构建质粒pIRESdhfr；然后利用EcoRV+xbaI双酶切，分别处理载体pIRESdhfr和pcDNA3.1(+)，前者回收约1700bp的小片断，后者回收约5400bp的载体大片断，连接，构建载体pMCE(图9)。转化E.coli XL1-blue，挑取单克隆，提取质粒进行酶切鉴定和序列分析，结果表明序列完全正确。
2、融合基因IIn-scuPA32k的构建与克隆以质粒pET15b-IIn-UK为模板，首先以P4和P2(见实施例1)为引物，用pfuDNA聚合酶进行PCR反应，然后再以回收的PCR产物为模板，以P5和P2为引物，用pfuDNA聚合酶扩增出IIn-scuPA32k融合基因，并在融合基因的5’端添加一个抗体的信号肽的编码基因。然后对PCR产物首先用NdeI切开，并用T4DNA聚合酶补平，热灭活T4DNA聚合酶后，再用EcoRV处理；载体pMCE先用EcoRI，并用T4DNA聚合酶补平，热灭活T4DNA聚合酶后，再用EcoRV处理，随后将处理后的载体和PCR产物进行连接，构建真核表达质粒pMCE-IIn-scuPA32k(图10)，转化E.coli XL1-blue，挑取单克隆，提取质粒进行酶切鉴定和序列分析，结果表明序列完全正确。
3、融合基因scuPA32k-IIn的构建和克隆以质粒pET15b-HLSP2为模板，以P5和P6为引物，用pfuDNA聚合酶进行PCR反应，然后再以回收的PCR产物为模板，以P3和P6为引物，用pfuDNA聚合酶扩增出scuPA32k基因，并在scuPA32k基因的5’端添加一个抗体的信号肽的编码基因，在3’端添加连接肽(G4S)3的编码基因，随后HindIII单酶切处理该PCR产物；以质粒pET15b-IIn-UK为模板，以P7和P8为引物，用pfuDNA聚合酶扩增出IIn基因，并用HindIII和NotI对该PCR产物进行双酶切处理；载体pMCE用EcoRV和NotI双酶切进行处理；随后利用T4DNA连接酶对处理过的载体和两种PCR产物进行三片段连接，构建表达质粒pMCE-scuPA32k-IIn(图11)，转化E.coli XL1-blue，挑取单克隆，提取质粒进行酶切鉴定和序列分析，结果表明序列完全正确。
4、高效表达IIn和scuPA32k融合基因的CHO细胞株的建立分别用SspI对质粒pMCE-IIn-scuPA32k和pMCE-scuPA32k-IIn进行线形化，然后利用invitrogen公司的脂质体lipofectin AMINE2000分别转染CHO/dhfr-细胞。随后用400μg/ml的G418筛选，挑取至少20个阳性克隆，取表达上清用溶圈法进行尿激酶活性分析。然后选择表达量较高的克隆用MTX进行逐步加压，以扩增目的基因的拷贝数并提高目的蛋白的表达量。MTX浓度依次为2.5×10-8，5×10-8，1×10-7，每次MTX加压后，都挑选至少20个单克隆分析表达量，然后挑选表达量较高的克隆进行下一步加压。
5、重组IIn-scuPA32k和scuPA32k-IIn杂合体的体外活性分析5.1溶圈法测定尿激酶的溶纤活性，详见文献(军事医学科学院院刊，1987；11101)结果表明表达上清中具有明显的尿激酶溶纤活性(图12)。
5.2 ELISA分析单链抗体的活性抗原DD包被酶联孔，随后用1％BSA-1‰Tween20封闭；培养上清样品中先加BSA至1％，加Tween20至1‰进行封闭，然后加封闭后的上清样品至酶联孔，37℃，1h；洗涤后加入兔抗尿激酶IgG，37℃，1h；洗涤后加入HRP-羊抗兔IgG抗体，37℃，1h；洗涤后加入OPD底物液显色至适当强度，用2mol/L H2SO4终止反应并测定OD492。结果表明，表达上清产物具有单链抗体结合抗原DD活性(表1)。
序列表<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所<120>一种新型导向溶栓剂，其制备方法及用途<130>
<160>18<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>530<212>PRT<213>
<400>1Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro1 5 10 15Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Phe Gly Tyr Thr Phe Thr20 25 30Ser Tyr Pro Ile Glu Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu35 40 45Trp Ile Gly Asn Phe His Pro Tyr Asn Asp Asp Thr Lys Tyr Asn Glu50 55 60Lys Phe Lys Gly Arg Ala Lys Leu Thr Val Glu Lys Ser Ser Ser Thr65 70 75 80Val Tyr Leu Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Asp Asp Ser Ala Val Tyr85 90 95Tyr Cys Ala Ile Tyr Phe Gly Lys Pro Trp Phe Thr Tyr Trp Gly Gln100 105 110Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly115 120 125
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<400>18agtctagatt agtctttctt ctcgtagact tc 3权利要求
1.一种新型导向溶栓剂，为鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶的杂合体，其特征在于具有序列表中序列1所示的氨基酸序列，或序列表中序列1的一个或几个氨基酸经过取代，缺失或增加后衍生的，具有与原序列相同功能的氨基酸序列。
2.编码权利要求1所述溶栓剂的融合基因，其特征在于具有序列表中序列2所示的DNA序列。
3.制备权利要求1所述溶栓剂的方法，包括以下步骤(1)利用分子生物学方法构建鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶融合基因并克隆至原核表达载体，转化大肠杆菌；(2)将(1)中的大肠杆菌培养和诱导表达；(3)重组鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶的分离纯化；(4)重组鼠抗人纤维蛋白单链抗体-低分子量尿激酶的体内外活性分析。
4.一种新型导向溶栓剂，其特征在于人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶的杂合体，具有序列表中序列5或7所示的氨基酸序列，或序列表中序列5或7的一个或几个氨基酸经过取代，缺失或增加后衍生的，具有与原序列相同功能的氨基酸序列。
5.编码权利要求4所述溶栓剂的融合基因，其特征在于具有如序列表中序列6或8所示的DNA序列。
6.根据权利要求4所述的溶栓剂，其特征在于其中的人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体，具有如序列表中序列3所示的氨基酸序列。
7.根据权利要求4或6所述的溶栓剂，其特征在于编码人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体的融合基因具有如序列表中序列4所示的DNA序列。
8.制备权利要求4所述溶栓剂的方法，包括以下步骤(1)利用分子生物学方法构建两种人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶融合基因的真核表达载体，转染真核细胞；(2)细胞培养，筛选分别表达两种人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶杂合体的阳性克隆，以及利用MTX加压提高重组杂合体的表达量；(3)两种重组人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体与低分子量尿激酶杂合体的体外活性分析。
9.根据权利要求8所述方法，其特征在于真核表达载体为pMCE，真核细胞为CHO/dhfr-细胞，转染方法为脂质体转染，筛选试剂为G418。
10.权利要求1或4所述的溶栓剂在制备心脑血管疾病治疗药物中的用途。
11.根据权利要求10所述的用途，其中的心脑血管疾病为血栓性疾病。
全文摘要
本发明公开了一种新型导向溶栓制剂，还公开了其制备方法及用途。本发明第一部分为鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶杂合体，其制备方法包括表达载体构建，表达，纯化，活性分析等步骤。第二部分为两种人源化鼠抗人纤维蛋白单链抗体－低分子量尿激酶杂合体，其制备方法包括构建真核表达载体，建立细胞株，杂合体的双功能分析等。本发明的杂合体具有导向溶栓功能，具有广阔的临床应用前景。
文档编号A61P7/02GK1593655SQ0315678
公开日2005年3月16日 申请日期2003年9月12日 优先权日2003年9月12日
发明者俞炜源, 刘志刚, 黄君健, 林建波, 徐桂清 申请人:中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所