专利名称：呼肠病毒基因组及其编码蛋白质在sars相关的研究中的用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及呼肠病毒与SARS相关性，以及呼肠病毒全基因组、全部蛋白质及其在SARS诊断，治疗，药物和疫苗等中的应用。
背景技术：
目前，冠状病毒(coronavirus)已被广泛认定为导致严重急性呼吸综合征(SARS)的病原体。但是，临床和实验证据提示，SARS病因不太可能是单一冠状病毒感染。具体的，在北京临床诊断的SARS病例中，60-80％都追溯不到明确的SARS传染源。另外，在不同地区，约有19.6-66％患者具有腹泻症状，但大多数病例，都没能从患者粪便中分离出与SARS相关的冠状病毒(SCV)。因此，可能部分SARS病例是由另外一种病毒引起的，或者是SCV和其他病毒混合感染引起(David Heymann，WHO负责传染性疾病的执行理事)。
为了有效控制SARS的传播和提高对该疾病的治疗水平，迫切希望确定导致所述疾病的病原体和/或参与疾病病程的所有致病性微生物。
通过电镜观察，本发明人出人意料的从SARS患者咽拭子样本中观察到的一株呼肠病毒样病毒。
目前，通过RT-PCR检测患者样本得到的病原体包括肺炎衣原体、肺炎支原体、副黏液病毒等常见的非典型肺炎的病原体，但其中尚无呼肠病毒感染的报道，甚至没有同一科其它病毒感染的报道。
将所述病毒感染小鼠，能够产生与呼肠病毒引起的动物急性呼吸窘迫综合症(ARDS)十分相似的症状即在发病早期出现以炎症渗出和透明膜形成为典型病理特点的大面积肺泡损伤，且在短期内出现肺纤维化。同时，对SARS感染的流行病学调查表明，其主要传播途径为飞沫传播和粪-口传播，这也是呼肠病毒的传播途径。
因此，本发明人首次发现了呼肠病毒与SARS感染之间的相关性，本发明正是在此基础上完成的。
发明内容
发明人从北京两位SARS患者痰漱液和咽拭子标本分离到两株新的病毒。获自患者的病毒株最初判断可能是SCV的变种，但采用SCV特征性引物通过PCR无法扩增出相应的DNA片段。同时，血清学实验证明，该病毒和SARS的发生相关。
在对所述病毒的培养、形态学观察、血清学凝聚反应和PCR测序的基础上，证实我们用Hep-2细胞分离到病毒直径分别在60-80nm，不同于已知直径为80-120nm的SCV，而且更为符合呼肠病毒属病毒的特征。
另一方面对于本发明所分离的病毒通过RT-PCR得到其基因组中的2个片段，经序列测定，所得PCR产物测序结果与已公布的呼肠病毒序列基本上符合。鉴于呼肠病毒属病毒中可以感染人类的已知病毒株没有引起SARS的能力，因此，推测从SARS患者样本中分离的是一种SARS相关的新呼肠病毒。
提供含有所述病毒样本的两位SARS患者为母女关系，女儿患病后传染给母亲。试验结果表明，从女儿和母亲的标本中均能分离呼肠病毒。所分离到的呼肠病毒能与康复病人血清凝集，表明所分离到的新呼肠病毒可能是引起SARS的病原体之一。
因此，本发明的一个方面涉及与SARS相关的新呼肠病毒。所述病毒已经根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约于2003年6月9日保藏在国际保藏单位中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(中国，北京市，海淀区中关村北一条13号)，并给予了保藏号为BYD1(CGMCC，0950)和BLD1(CGMCC，0951)。本发明的另一方面还涉及呼肠病毒在SARS诊断以及在制备用于诊断SARS的试剂中的用途。
本发明还涉及呼肠病毒在治疗SARS以及制备用于治疗SARS的药物中的用途。
本发明还涉及呼肠病毒在制备SARS相关疫苗，特别是基因工程疫苗、减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗等中的用途。
本发明的又一方面涉及一种SARS疫苗，其中含有免疫有效量的呼肠病毒片段、减毒呼肠病毒、灭活呼肠病毒，和以及药学上可接受的载体，任选的其中还含有用于制备疫苗的常用佐剂。在本发明的一个具体实施方案中，其中所述呼肠病毒选自至少一种本发明所分离的新呼肠病毒CGMCC 0950和CGMCC 0951。
本领域技术人员知晓，免疫有效量是指能够在受试者体内有效引起针对SARS相关呼肠病毒的免疫反应的量。本领域普通技术人员知晓如何根据所选具体给药途径等因素选择适当的剂量。
本发明的再一方面涉及一种SARS疫苗，其中含有免疫有效量的灭活呼肠病毒，以及药学上可接受的载体，任选的，所述疫苗中还含有用于制备疫苗的常用佐剂。在本发明的一个具体实施方案中，其中所述呼肠病毒是本发明所分离的新呼肠病毒。
本发明还涉及保护哺乳动物免受呼肠病毒引起的病毒感染或SARS侵袭的方法，包括给有此需要的动物接种免疫有效量的本发明的疫苗。优选地，接种途径是皮下、鼻内、口服、皮内、肌内、或肠胃外途径。
已知呼肠病毒为双股RNA(dsRNA)病毒，全基因组共约16.7kb，有10个片段L1、L2、L3、S1、S2、S3、S4、M1、M2、M3，分别编码8个结构蛋白质和3个非结构蛋白质，其中S1编码两个蛋白质σ1和σ1S。序列高度保守的蛋白质有λ1、σ3、σ2、σNS、μ1等。其病毒粒子直径在60-80nm之间，具有双层同心二十面体衣壳，无包膜。其双层衣壳的病毒颗粒具有完全的感染力。呼肠病毒外面的双层衣壳由8种结构蛋白质构成，其中内层衣壳也称为核心区域，由5种蛋白质组成(λ1、λ2、λ3、μ2和σ2)，外层衣壳由另外的三种蛋白质(μ1、σ3和σ1)组成。基因组片段和病毒的转录酶被封装在内层衣壳内。
具体地，L2序列编码核心刺突蛋白质λ2，该蛋白涉及到病毒正股转录的酶反应；L3编码核壳蛋白λ1，该蛋白和核酸结合活性密切相关；S1编码蛋白质σ1，这个蛋白质是细胞和呼肠病毒相互作用的主要决定因素，该蛋白可诱导产生特异性中和抗体；S4编码一个主要的病毒外部衣壳组件σ3；M2编码外部衣壳蛋白μ1，该蛋白与σ3、σ1一起在感染细胞中组装成类似果核的颗粒，然后进行子代病毒的生产；S3编码RNA结合多肽σNS，该蛋白质具有和ssRNA的高亲和力，并且出呼肠病毒形态发生中的发挥作用功能；s2编码病毒内部衣壳核心多肽σ2，具有与双股RNA结合的活性；L1序列编码λ3，是RNA依赖的RNA聚合酶。非结构蛋白质有M3基因编码的μNS蛋白、S1基因编码的σ1S蛋白和M1基因编码的μ2蛋白，但它们的功能目前尚不十分明确。
因此，本发明涉及包含呼肠病毒全基因组、及其编码的诸蛋白质在SARS的诊断，治疗，药物和疫苗等中的应用。
具体的，本发明的一个方面，涉及呼肠病毒基因组或其编码特定蛋白质的核苷酸分子或其片段用于诊断SARS感染的用途，尤其是选自编码呼肠病毒σ1蛋白的L3或其片段，编码呼肠病毒λ1蛋白的S1或其片段，编码呼肠病毒σ3蛋白的S4或其片段，编码呼肠病毒σ2蛋白的S2或其片段，编码呼肠病毒λ2蛋白的L2或其片段，编码呼肠病毒λ3蛋白L1或其片段，编码呼肠病毒σNS蛋白的S3或其片段，编码呼肠病毒μ1的M2或其片段用于制备诊断SARS感染的药剂的用途。
本发明的又一方面涉及一种获自本发明所述新呼肠病毒的特征性DNA片段SEQ ID NO5和SEQ ID NO6。本发明的另一方面还涉及所述DNA片段编码的蛋白质。
本发明的再一方面还涉及所述新呼肠病毒DNA片段用于诊断SARS的用途。本发明的又一方面还涉及所述DNA片段用于制备诊断SARS的试剂的用途。
本发明所述新呼肠病毒DNA片段SEQ ID NO5，其长度为268bp，与已知呼肠病毒核壳蛋白λ1编码序列L3具有较高的同源性(93％，详见实施例5)，因此，所述DNA片段或其片段能够用作核酸探针，用于检测样本中是否含有SARS相关的呼肠病毒。
本领域技术人员知晓，能用于检测目的的上述DNA片段并不局限于SEQ ID NO5自身，还包括其简并性片段，或与其同源性高于80％功能等同性核苷酸序列或其片段，或能够与其杂交的核苷酸序列。
本发明所述DNA片段SEQ ID NO6，其长度为483bp，与已知呼肠病毒核壳蛋白σ2编码序列S2具有较高的同源性(87％，详见实施例5)，因此，所述DNA片段或其片段能够用作核酸探针，用于检测样本中是否含有本发明所述新呼肠病毒。
本领域技术人员知晓，能用于检测目的的上述DNA片段并不局限于SEQ ID NO6自身，还包括其简并性片段，或与其同源性高于80％的功能等同性核苷酸序列或其片段，或能够与其杂交的核苷酸序列。
本发明再一方面涉及一种呼肠病毒基因组编码的蛋白质或其片段用于诊断和/或治疗SARS的用途，尤其是用于制备诊断和/或治疗SARS的药物的用途。具体的，本发明涉及选自呼肠病毒σ1蛋白或其片段，呼肠病毒λ1蛋白或其片段，呼肠病毒σ3蛋白或其片段，呼肠病毒σ2蛋白或其片段，呼肠病毒λ2蛋白或其片段，呼肠病毒λ3蛋白L1或其片段，呼肠病毒σNS蛋白或其片段，呼肠病毒μ1或其片段用于制备诊断和/或SARS感染的药剂的用途。
本发明又一方面涉及一种用于预防和/或治疗SARS药物组合物，其中含有预防和/或治疗有效量的呼肠病毒蛋白质，和任选的药学可接受的载体。
在本发明的一个实施方案中，所述药物组合物中含有预防和/或治疗有效量的选自呼肠病毒σ1蛋白或其片段，呼肠病毒λ1蛋白或其片段，呼肠病毒σ3蛋白或其片段，呼肠病毒σ2蛋白或其片段，呼肠病毒λ2蛋白或其片段，呼肠病毒λ3蛋白或其片段，呼肠病毒σNS蛋白或其片段，呼肠病毒μ1蛋白或其片段中的任一项或其组合，以及药学可接受的载体。
本发明所述预防和/或治疗SARS的药物组合物还包括，但不限于，由所述呼肠病毒蛋白质或其片段制备的基因工程疫苗，或亚单位疫苗。在所述疫苗中，包括药学可接受的载体，以及任选的，包括适当的佐剂。
在本发明的一个实施方案中，采用PCR方法，钓取呼肠病毒基因组中S1蛋白的全基因或胞外区结构域的基因，将其插入真核表达载体pBLCFA质粒后，转染CHO细胞并进行分离纯化。对纯化后的病毒蛋白通过诸如免疫动物等方法进行抗原性测定，并利用所述病毒抗原制备亚单位疫苗。
因此，本发明的再一方面还涉及所述特征性DNA片段SEQ IDNO5和SEQ ID NO6编码的蛋白质的用途。
本发明的再一方面还涉及所述DNA片段SEQ ID NO5和SEQ IDNO6编码的蛋白质用于诊断和/或治疗SARS的用途。
本发明的再一方面还涉及呼肠病毒基因组DNA或片段编码的蛋白质用于诊断和/或治疗SARS的用途。
由所述核苷酸序列编码的蛋白质，可以用来制备相应的抗体，用于制备检测样本中是否含有本发明所述病毒。由已知抗原制备相应抗体的技术为本领域技术人员知晓。采用不同的检测方法测定样本中是否含有特定的抗原或抗体，也在本领域技术人员知识范围之内。
此外，由于在已知呼肠病毒中L3所编码的核壳蛋白λ与核酸的结合活性密切相关，因此，所述编码蛋白质能够用于体外筛选抗本发明所述病毒复制的药物靶点。
本发明再一方面还涉及一种药物组合物，其中含有治疗和/或诊断有效量的本发明所述的DNA片段SEQ ID NO5和SEQ ID NO6，或其编码的蛋白质，以及药学上可接受的载体。
本发明又一方面涉及针对选自呼肠病毒σ1蛋白，λ1蛋白，σ3蛋白，σ2蛋白，λ2蛋白，λ3蛋白，σNS蛋白，μ1蛋白中任一项的蛋白质或其片段所制备的单克隆抗体或多克隆抗体，以及所述抗体用于制备诊断SARS感染的试剂盒的用途。
本发明又一方面涉及一种用于诊断SARS感染的试剂盒，其中含有诊断有效量的针对选自呼肠病毒σ1蛋白，λ1蛋白，σ3蛋白，σ2蛋白，λ2蛋白，λ3蛋白，σNS蛋白，μ1蛋白中任一项的蛋白质或其片段所制备的单克隆抗体，或多克隆抗体，或其组合，以及任选的显色试剂。
本发明还涉及在动物中检测呼肠病毒感染或诊断SARS的方法，包括将本发明的抗体或本发明的呼肠病毒与来自所述动物的生物样品接触，并检测或观察抗原-抗体复合物的存在。该动物优选是哺乳动物，例如人。
图1A-E本发明所述呼肠病毒在Hep-2细胞的胞质中聚集的情况。F为冠状病毒接种感染的细胞胞浆中可见呼肠病毒(Re)和冠状病毒的(Co)混合感染。右上角为呼肠病毒，左下角为冠状病毒。
图2对38位患者血清学检验结果。
图3呼肠病毒腹腔接种Balb/C小鼠21天后肺组织切片(A和B)，和对照小鼠肺组织切片(C和D)在光镜下的观察。
实施例实施例1本发明所述新呼肠病毒的分离和形态学表征本发明所述标本来源于2003年3月13日收到301医院呼吸科送检的SARS患者痰漱液和咽拭子标本。分离用的细胞为Hep-G2和McCoy细胞，其中Hep-2和McCoy为传代细胞，由本室保存((来源于美国组织采集中心(ATCC))。用于细胞培养的培养基RPIM 1640为Gibco/BRL公司产品；青霉素、链霉素为华北制药厂产品；2％小牛血清为美国HyClone公司产品。
采用如下方法分离本发明的新病毒。
细胞培养法将处理好的标本接种于长成单层细胞的10mL细胞培养瓶中，每份标本接种两瓶，37℃吸附1h，然后吸出标本液、加含有2％小牛血清的细胞维持液，置37℃CO2培养箱培养。每天观察细胞变化，连续观察10天。若不出现CPE进行盲传，连续盲传3代。
对于本发明的新病毒的形态学观察和表征如下进行取痰漱液和咽拭子标本，浸于无血清1640培养基，经孔径为0.22μm无菌滤膜过滤和青、链霉素处理后，分别接种于Hep-2和McCoy细胞，37℃，5％CO2培养箱孵育，24小时后通过电镜观察细胞病变。结果见图1超薄切片的电镜观察刮取感染病毒24h后的细胞，800-1000rpm离心3min；组织样品为濒死小鼠的肺组织，大小约1mm3。3％戊二醛固定2h，磷酸缓冲液漂洗，1％OsO4后固定2h，经逐级酒精、丙酮脱水，Epon812树脂包埋，组织样品半薄切片定位，超薄切片，醋酸双氧铀、柠檬酸铅双重染色后，用Philips CM120透射电镜观察。对照样品同步处理、观察。
具体的，如图1A-E所述病毒在Hep-2细胞的胞质中聚集的情况表明，感染所述细胞的病毒具有不同成熟阶段以及两种类型的病毒粒子有致密核心的成熟粒子和有透明核心的不完全装配的病毒粒子，这两种类型的病毒粒子都有一个大约14nm厚的衣壳。大多数病毒颗粒都是成群分布的，呈晶格状排列(图1C-E)。电子显微镜(EM)证实该病毒为直径60-80纳米。
镜下观察到的病毒大小，双层衣壳以及晶格状排列等均符合呼肠病毒科病毒典型的形态特征。因此可以鉴定该株病毒属于呼肠病毒。
用同样的方法从该患者的母亲身上也分离出上述病毒，但是从这2例患者的咽拭子中未能分离出SARS相关的冠状病毒(SCV)。这可能是因为从咽拭子中分离SCV的几率比痰中要少得多，因此不适合于SCV的分离。
令人感兴趣的是，在感染SCV BJ01株的Vero-E6细胞中发现的典型冠状病毒粒子其粒子直径为80-120nm，具有一个黑的中心核衣壳和包膜(图1F)。更重要的是，BJ01感染的Vero-E6细胞中同时观察到位于内质网内的冠状病毒和分布在胞质中的呼肠病毒，而在作为对照的Vero-E6细胞中两种病毒均未被发现。
由上述病毒形态学表征显示，所分离的病毒是一种呼肠病毒科病毒。
实施例2本发明所述病毒的血清学检验对38例SARS患者的血清样本和随机获得的35例健康人对照样本，采用标准ELISA技术检测对呼肠病毒的反应。38例患者都经过临床症状诊断，而且经标准ELISA和免疫荧光方法检测对SCV的血清学反应呈阳性。来自北京市健康捐献者的对照组血清样品中，全部对呼肠病毒呈阴性反应。阴性对照组平均OD值为0.037±0.023，阈值设定为0.098，OD超过阈值或者Positive/Negative＞2.65的样品为阳性。北京市首例SARS患者及其母亲身上分离的呼肠病毒用来检测血清学反应，这两株呼肠病毒用RT-PCR和其它方法检测未发现SCV。
血清学检测结果(图2)表明，来自SARS患者的38例血清样品中，有24例，即63％的对呼肠病毒为阳性反应。表明本发明所述病毒与SARS患者由较高的相关性，提示其也是参与SARS病程的一种致病微生物。
具体方法培养的病毒上清冻融三次，56℃60min灭活，10,000rpm 30min，上清用PEG6000 4℃沉淀过夜，12,000rpm 30min，沉淀用病毒裂解液(2％SDS PBS 0.01M Ph7.2)裂解，测定蛋白含量。
用250μug/mL病毒纯化液包被酶联板，100μL/孔包被酶联板。37℃60min，PBS 0.01M pH7.2(2％BSA) 封闭30min，血清1∶10稀释37℃水浴40min，加抗人酶标抗体(中国人民解放军微生物检验研究中心制备)后按常规ELISA方法检测。
实施例3动物实验
Balb/c鼠接种法选择健康的4周BALB/c鼠，在无菌条件下，用0.5mL的微量注射器腹腔内接种，余和李样品分别接种5只，Balb/c鼠腹腔内接种0.5mL/只，10天后同样剂量追加接种一针。
每日观测小鼠的发病情况，体温变化情况，一般观察一个月左右。若观察到小鼠发病，将濒死解剖取肺组织，若观察期内若未出现鼠发病，将鼠解剖取肺组织，分别进行固定染色后进行光镜组织病理学观察和电镜超微结构观察。
感染呼肠病毒的肺组织切片中，肺泡中隔显著增厚，肺泡腔内有大量单核细胞和少数多形核白细胞浸入(图3)。在感染肺组织的电镜切片中，发现纤维组织明显增生。正常Balb/C小鼠肺组织切片观察显示肺泡结构基本正常。由上述实验结果表明，获自SARS患者样本的本发明所述新呼肠病毒能够在动物体内引发与临床SARS患者相类似的症状，表明所述病毒确实参与SARS相关病程，能够作为一个诊断和治疗SARS感染患者的新靶标。
实施例4新呼肠病毒部分基因的克隆及序列测定引物设计为进一步确证本发明所分离的病毒与呼肠病毒的关系，我们根据位于呼肠病毒基因组L3基因及S2基因区段内的保守区域设计两对引物1)483+正向引物5′-GTT GGA TTT GGT GGT CTG C-3′(SEQ ID NO1)；483-反向引物5′-CCA CTC CAC ATA TCC TCG-3′(SEQ ID NO；2)；2)268+正向引物5’-CAG TCG ACA TTG TGG TC-3’(SEQ ID NO3)268-反向引物5’-GCG TAC TGA CGT GGA TCA TA-3’(SEQ ID NO4)RT-PCR及PCR产物测序从细胞培养上清中按QIAamp Viral RNA Mini Kit说明书提取病毒RNA。首先进行反转录，在管中加入5μl总RNA，1μl SuperscriptII反转录酶(200u)，1μl随机引物，4μL 5×反应缓冲液，1μl RNA酶抑制剂和1μL 10mM dNTP以及2μL 0.1M DTT，最后用不含RNase的水补足体积至20μl。于42℃反应60min后，95℃灭活5min。然后进行PCR扩增，反应系统包括5μL 10×PCR反应缓冲液，1μL 10mMdNTP，2μL 25mM MgCl2，1μLTaqDNA聚合酶(2.5U)，上下游引物各1μL(10μM)，2μl反转录产物，用水补足至50μL。分别扩增40个循环。反应完毕，将产物经1％琼脂糖凝胶电泳观察结果。
PCR产物切胶回收纯化后由中国科学院北京基因组研究所及军事医学科学院生物工程研究所测序。
序列测定结果1、268bp PCR产物具体如下序列5′TTTATGCGGATTCGCAATTCTCCCCTCTTGATCACGCATCGAACTGTTGATTAAAGTATCGTGTGTTCATTTGCCAAAGTGCCAGTGGGAAAATCCAATTTCCTTCAAAAGGCACCATCATCCCAGTCTCATCTCTAATCATTGGCGCGGCGCCATTCATTCCAAACGATATACGGCAATCTCGTCCGAATATGTGAACGCCAGGAGTATCACGATCAAACACCAAGTCAGGTGGAGGAGCCAGAGGCGACCACAAATGTGTCGACTG 3′(SEQ ID NO5)2.483bp PCR产物具体如下序列5′CCACTCCACATATCCTCGTCCACCCGAACGTACGAAATTGGACCGAACCCCGTTAAGTTGAGTAAACGTTACGGCACTCAATTGCTGGTACACTCGGTGCTTAAATCTTGGATCACGTGCTAAGAATGGGTAATCGTCGCAATCATACACTCGATCTGCTTGCGCCTGCAAAGCGGGCTGTGCCAGAACTTGTGGTGGGGCTACAACTAAACCATCAAGCGTAGGAGCTGACCACACTAGGCGCAGGAACCTGATATCTCCCCATCGGTGGTTAGGCCGAAATGGTATCTGAAGAGTACCACTTAAAAGGCAACTCATTTGATAATATCTTGAACCAGCGGTTGGAACGAGAGCCGATGTAGCTAGACCTCGCCCTAGACTTATCCAATCCAGAAATTGAGTCAGCTGCCATGGTGAATTACCCGCTCGAAGAAGATGTGAAGACAACTCATCGTTAATTGGCACATTTTGCAGACCACCAAA 3′(SEQ ID NO6)BLAST结果表明268bp片段与呼肠病毒(Reovirus 3 Dearing)L3基因区段同源性高达93％，483bp片段与呼肠病毒(Reovirus sp.)S2基因同源性为87％。
以上分子生物学实验证实，该病毒为呼肠病毒科，正呼肠病毒属病毒。
实施例5利用呼肠病毒蛋白进行检测的ELISA方法。
包被抗原重组表达病毒蛋白用包被液稀释到0.5μg/μL。每孔50μL，4℃过夜。之后PBST洗三次。
封闭10％FCS(PBS配制)。加满孔(约0.2mL/孔)4C过夜或室温2h或37C1.5h PBST洗三次。
患者血清1∶10稀释。
将患者血清加入包被好的96孔板中，50μL/孔，37℃ 1h或室温2h，PBST洗三次。
加入酶标二抗(如酶标羊抗人二抗)抗体用PBS按说明书稀释浓度配制。50μL/孔室温40min。
加入底物OPD(邻苯二胺)。4mg OPD+10mL底物缓冲液+15μLH2O2。避光反应。测OD490-492。
实施例6利用呼肠病毒相关蛋白及其制备的抗体进行间接免疫荧光染色的方法分离物感染细胞片的制备将培养成单层的Hep-2细胞用Hank’s液洗一次，然后接种分离物细胞培养悬液，放37℃孵箱中吸附1h，加入细胞维持液，1mL/瓶，放37℃继续培养。待细胞刚刚出现病变时，取感染细胞滴片，将滴好的玻片放37℃CO2孵箱中继续培养8h使细胞贴壁。取出玻片，放入0.005M pH7.2 PBS中漂洗，除去未贴壁的悬浮细胞，凉干。放入冷丙酮内，-30℃过夜固定，凉干，-20℃密封保存备用。
间接免疫荧光抗体染色方法将病人血清标本1∶10稀释后，56℃作用30min，然后再适当稀释后分别滴加到细胞抗原片上，置37℃湿盒中作用30min(若检测IgM抗体则作用90min)，冲洗，PBS振荡洗3次，凉干。然后加羊抗人FITC(Sigma公司产品)标记荧光抗体，置37℃湿盒中作用30min，冲洗同前，凉干，在荧光显微镜下观察染色结果。
序列表<110> 军事医学科学院微生物流行病研究所，军事医学科学院仪器检测分析中心<120> 呼肠病毒基因组及其编码蛋白质在SARS相关的研究中的用途<130>
<160> 6<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 19<212> DNA<213> 引物<400> 1gttggatttg gtggtctgc19<210> 2<211> 18<212> DNA<213> 引物
<400> 2ccactccaca tatcctcg18<210> 3<211> 17<212> DNA<213> 引物<400> 3cagtcgacat tgtggtc 17<210> 4<211> 20<212> DNA<213> 引物<400> 4gcgtactgac gtggatcata 20<210> 5<211> 268<212> DNA<213> 呼肠病毒<400> 5
tttatgcgga ttcgcaattc tcccctcttg atcacgcatc gaactgttga ttaaagtatc60gtgtgttcat ttgccaaagt gccagtggga aaatccaatt tccttcaaaa ggcaccatca120tcccagtctc atctctaatc attggcgcgg cgccattcat tccaaacgat atacggcaat180ctcgtccgaa tatgtgaacg ccaggagtat cacgatcaaa caccaagtca ggtggaggag240ccagaggcga ccacaaatgt gtcgactg 268<210> 6<211> 483<212> DNA<213> 呼肠病毒<400> 6ccactccaca tatcctcgtc cacccgaacg tacgaaattg gaccgaaccc cgttaagttg60agtaaacgtt acggcactca attgctggta cactcggtgc ttaaatcttg gatcacgtgc120taagaatggg taatcgtcgc aatcatacac tcgatctgct tgcgcctgca aagcgggctg180tgccagaact tgtggtgggg ctacaactaa accatcaagc gtaggagctg accacactag240gcgcaggaac ctgatatctc cccatcggtg gttaggccga aatggtatct gaagagtacc300acttaaaagg caactcattt gataatatct tgaaccagcg gttggaacga gagccgatgt360agctagacct cgccctagac ttatccaatc cagaaattga gtcagctgcc atggtgaatt420acccgctcga agaagatgtg aagacaactc atcgttaatt ggcacatttt gcagaccacc480aaa 48权利要求
1.呼肠病毒在治疗SARS，特别是制备用于治疗SARS的药物组合物中的用途。
2.呼肠病毒在制备SARS相关疫苗，特别是减毒疫苗、灭活疫苗、亚单位疫苗中的用途。
3.一种SARS疫苗，其中含有免疫有效量的减毒和/或灭活呼肠病毒或呼肠病毒亚单位，优选为减毒和/或灭活的BYD1(CGMCC0950)和/或BLD1(CGMCC 0951)或其蛋白质片段，和以及药学上可接受的载体，任选的其中还含有用于制备疫苗的常用佐剂。
4.呼肠病毒基因组或其编码特定蛋白质的核苷酸分子或其片段用于诊断SARS感染的用途，尤其是选自编码呼肠病毒σ1蛋白的L3或其片段，编码呼肠病毒λ1蛋白的S1或其片段，编码呼肠病毒σ3蛋白的S4或其片段，编码呼肠病毒σ2蛋白的S2或其片段，编码呼肠病毒λ2蛋白的L2或其片段，编码呼肠病毒λ3蛋白L1或其片段，编码呼肠病毒σNS蛋白的S3或其片段，编码呼肠病毒μ1的M2或其片段用于制备诊断SARS感染的药剂的用途。
5.一种获自新呼肠病毒BYD1(0950)或BLD1(0951)的DNA片段，其选自SEQ ID NO5或SEQ ID NO6，或其简并性片段，或与其同源性高于80％功能等同性核苷酸序列或其片段，或能够与其杂交的核苷酸序列。
6.权利要求5所述DNA片段用于诊断SARS的用途，尤其是制备诊断SARS的试剂的用途。
7.权利要求5所述DNA片段编码的蛋白质用于诊断和/或治疗SARS的用途。
8.一种用于预防和/或治疗SARSD药物组合物，含有预防和/或治疗有效量的选自呼肠病毒σ1蛋白或其片段，呼肠病毒λ1蛋白或其片段，呼肠病毒σ3蛋白或其片段，呼肠病毒σ2蛋白或其片段，呼肠病毒λ2蛋白或其片段，呼肠病毒λ3蛋白或其片段，呼肠病毒σNS蛋白或其片段，呼肠病毒μ1蛋白或其片段中的任一项或其组合，以及药学可接受的载体。
9.针对选自呼肠病毒σ1蛋白，λ1蛋白，σ3蛋白，σ2蛋白，λ2蛋白，λ3蛋白，σNS蛋白，μ1蛋白中任一项的蛋白质或其片段所制备的单克隆抗体或多克隆抗体，
10.一种用于诊断SARS感染的试剂盒，其中含有诊断有效量的针对选自呼肠病毒σ1蛋白，λ1蛋白，σ3蛋白，σ2蛋白，λ2蛋白，λ3蛋白，σNS蛋白，μ1蛋白中任一项的蛋白质或其片段所制备的单克隆抗体，或多克隆抗体，或其组合，以及任选的显色试剂。
全文摘要
本发明涉及呼肠病毒与SARS相关性，以及呼肠病毒全基因组、全部蛋白质及其在SARS诊断，治疗，药物和疫苗等中的应用。
文档编号A61P11/00GK1565628SQ03146589
公开日2005年1月19日 申请日期2003年7月8日 优先权日2003年7月8日
发明者端青, 张学敏, 朱虹, 周育森, 杨怡, 李卫华, 何君, 何昆, 张浩杰, 周涛, 宋立华, 靳宝峰, 檀华, 李慧艳, 左庭婷, 陈德蕙 申请人:中国人民解放军军事医学科学院仪器测试分析中心, 中国人民解放军军事医学科学院微生物流行病研究所