粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏菌)抗原的利记博彩app

专利名称：粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏菌)抗原的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及可能用来预防、诊断和/或治疗粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏菌属)感染的多肽，特别是粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏菌属)的多肽。
背景技术：
粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏菌属)(Moraxella(Branhamella)catarrhalis)是引起人呼吸道感染的革兰氏阴性双球菌。如今认为粘膜炎莫拉氏菌是继肺炎链球菌(Streptococcuspneumoniae)和流感嗜血杆菌(Haemophilusinfluenzae)之后，引起婴幼儿中耳炎的第三个最常见病因。粘膜炎莫拉氏菌也与几种其它类型的感染有关，包括窦炎、持续性咳嗽、成人急性喉炎、化脓性角膜炎、新生儿结膜炎、以及无免疫应答宿主中的侵袭性疾病。
大约90％的粘膜炎莫拉氏菌菌株耐受抗生素(β-内酰胺酶阳性)，而且复发性中耳炎发病率高，因此有必要开发保护宿主防止粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗。粘膜炎莫拉氏菌感染诱导针对细菌细胞表面上抗原的免疫应答。但尚未鉴定其中许多表面蛋白质，也未确定防止不同菌株感染的免疫应答。
为开发保护宿主防止粘膜炎莫拉氏菌感染的疫苗，主要致力于外膜蛋白质，例如称为泛在的表面蛋白质A(UspA)的高分子量蛋白质。该蛋白质被认为是有希望的候选疫苗，因其单克隆抗体和多克隆抗体在小鼠肺清除模型中均显示杀菌和保护作用。然而，该蛋白质在不同粘膜炎莫拉氏菌菌株间的变异较强。除该蛋白质以外，注意到其它的粘膜炎莫拉氏菌蛋白质可作为可能的候选疫苗。具有保守性表位的转铁蛋白结合蛋白暴露于细菌表面。然而，不同菌株之间蛋白质的抗体交叉反应性程度存在差异。其它研究者还关注45-kDa蛋白质CD(OMP CD)。该蛋白质在粘膜炎莫拉氏菌菌株间高度保守，但慢性阻塞性肺病的成年人对OMP CD的免疫应答具有变异性。
因此，仍亟需可用于预防、诊断和/或治疗粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏菌属)感染的粘膜炎莫拉氏菌多肽。
发明概述本发明一方面提供了编码与第二种多肽具有至少70％同一性的多肽的分离的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID Nos2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列。
本发明一方面涉及包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列的多肽。
其它方面提供了由本发明多核苷酸编码的多肽、药物组合物、包含有效连接表达控制区的本发明多核苷酸的载体、利用所述载体转染的宿主细胞以及包含在适于表达的条件下培养所述宿主细胞的多肽产生方法。
附图简述

图1代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC2基因的DNA序列；SEQ ID NO1。下划线部分序列代表前导肽编码区。
图2代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC2多肽的氨基酸序列；SEQ ID NO2。下划线序列代表30个氨基酸残基的前导肽。
图3代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU 658的BVH-MC2基因的部分DNA序列；SEQ ID NO3。
图4代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU 658的BVH-MC2多肽的部分氨基酸序列；SEQ ID NO4。
图5代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU T-25的BVH-MC2基因的部分DNA序列；SEQ ID NO5。
图6代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU T-25的BVH-MC2多肽的部分氨基酸序列；SEQ ID NO6。
图7代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株M-12的BVH-MC2基因的部分DNA序列；SEQ ID NO7。
图8代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株M-12的BVH-MC2多肽的部分氨基酸序列；SEQ ID NO8。
图9代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC3基因的DNA序列；SEQ ID NO9。下划线部分序列代表前导肽编码区。
图10代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC3基因的氨基酸序列；SEQ ID NO10。下划线序列代表46个氨基酸残基的前导肽。
图11代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC4基因的DNA序列；SEQ ID NO11。下划线部分序列代表前导肽编码区。
图12代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC4多肽的氨基酸序列；SEQ ID NO12。下划线序列代表42个氨基酸残基的前导肽。
图13代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC5基因的DNA序列；SEQ ID NO13。下划线部分序列代表前导肽编码区。图14代表来自粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的BVH-MC5多肽的氨基酸序列；SEQ ID NO14。下划线序列代表60个氨基酸残基的前导肽。
图15描述使用MacVector序列分析软体的Clustal W程序(6.5版)对粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2、ETSU 658、ETSU T-25和M-12的BVH-MC2基因的部分核苷酸序列进行的比较。共有序列一行位于比对下方，其中*和空格分别代表序列间相同的核苷酸以及差异。
图16描述使用MacVector序列分析软体的Clustal W程序(6.5版)对粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2、ETSU 658、ETSU T-25和M-12的BVH-MC2部分开放阅读框架的预测的氨基酸序列进行的比较。共有序列性一行位于比对下方，其中*代表相同的氨基酸残基。
发明详述本发明提供纯化和分离的多核苷酸，其编码可用于预防、诊断和/或治疗莫拉氏菌感染的莫拉氏菌多肽。
本发明一方面提供了编码与第二种多肽具有至少70％同一性的多肽的分离的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列。
本发明一方面提供了编码与第二种多肽具有至少80％同一性的多肽的分离的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列。
本发明一方面提供了编码与第二种多肽具至少95％同一性的多肽的分离的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列。
本发明一方面提供了编码与第二种多肽具有至少70％同一性的多肽的分离的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本发明一方面提供了编码与第二种多肽具有至少80％同一性的多肽的分离的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本发明一方面提供了编码与第二种多肽具至少95％同一性的多肽的分离的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本发明一方面涉及包含选自SEQ ID Nos2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列的多肽。
本发明一方面涉及以包含SEQ ID NO2、4、6、8、10、12或14的氨基酸序列为特征的多肽。
本发明一方面提供了编码多肽带有表位的部分的多核苷酸，该多肽包含选自SEQ ID Nos2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列。
本发明一方面提供了编码多肽带有表位的部分的多核苷酸，该多肽包含选自SEQ ID Nos2、4、6、8、10、12或14的序列。
本发明一方面涉及编码多肽带有表位的部分，该多肽包含选自SEQ ID Nos2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列。
本发明一方面涉及编码多肽带有表位的部分，该多肽包含选自SEQ ID Nos2、4、6、8、10、12或14的序列。
本发明一方面提供了编码与第二种多肽具至少70％同一性的多肽的分离的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本发明一方面提供了编码与第二种多肽具有至少80％同一性的多肽的分离的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本发明一方面提供了编码与第二种多肽具至少90％同一性的多肽的分离的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本发明一方面提供了编码与第二种多肽具至少95％同一性的多肽的分离的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
本发明一方面涉及包含选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽。
本发明一方面提供了包含选自下列多核苷酸的分离的多核苷酸
(a)编码与第二种多肽具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、1 2、14或其片段或类似物的序列；(b)编码与第二种多肽具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列；(c)编码与第二种多肽具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列；(d)编码包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物序列的多肽的多核苷酸；(e)编码能够产生对包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物序列的多肽具有结合特异性的抗体的多肽的多核苷酸；(f)编码多肽带有表位的部分的多核苷酸，该多肽包含选自SEQID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列；(g)包含选自SEQ ID No1、3、5、7、9、11、13或其片段或类似物的序列的多核苷酸；(h)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
本发明一方面提供了包含选自下列多核苷酸的分离的多核苷酸(a)编码与第二种多肽具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、1 2或14的序列；(b)编码与第二种多肽具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(c)编码与第二种多肽具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(d)编码包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽的多核苷酸；(e)编码能够产生对包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽具有结合特异性的抗体的多肽的多核苷酸；(f)编码多肽带有表位的部分的多核苷酸，该多肽包含选自SEQID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(g)包含选自SEQ ID No1、3、5、7、9、11和13的序列的多核苷酸；(h)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
本发明一方面提供了包含选自下列多肽的分离的多肽(a)与第二种多肽具有至少70％同一性的多肽，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列；(b)与第二种多肽具有至少80％同一性的多肽，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列；(c)与第二种多肽具有至少95％同一性的多肽，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列；(d)包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列的多肽；(e)能够产生对包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物序列的多肽具有结合特异性的抗体的多肽；(f)多肽带有表位的部分，该多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列；(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除N端甲硫氨酸残基；(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除分泌氨基酸序列。
本发明一方面提供了包含选自下列多肽的分离的多肽(a)与第二种多肽具有至少70％同一性的多肽，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(b)与第二种多肽具有至少80％同一性的多肽，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(c)与第二种多肽具有至少95％同一性的多肽，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(d)包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽；(e)能够产生对包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽具有结合特异性的抗体的多肽；(f)多肽带有表位的部分，该多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列；(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除N端甲硫氨酸残基；(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除分泌氨基酸序列。
本领域技术人员应当理解，本发明包括编码本专利申请此处所述多肽的类似物例如突变体、变体、同源物和衍生物的DNA分子，即多核苷酸及其互补序列。本发明也包括本发明的DNA分子对应的RNA分子。除DNA和RNA分子以外，本发明包括相应的多肽以及特异性结合该多肽的单克隆抗体。
在另一实施方案中，本发明的多肽是抗原性的。
在另一实施方案中，本发明的多肽是免疫原性的。
在另一实施方案中，本发明的多肽可以激发宿主的免疫应答。
在另一实施方案中，本发明也涉及能够产生与上述本发明多肽具有结合特异性的抗体的多肽。
“具有结合特异性”的抗体是识别并结合所选多肽、而基本上不识别并结合样品中(例如，天然包括所选肽的生物样品)其它分子的抗体。以所选多肽为抗原，利用ELISA分析可以测定其特异性结合。
根据本发明，生物学研究中的″保护″定义为显著提高存活曲线、存活率或存活时间。分别使用对数秩和检验比较存活曲线，以及Fisher精确检验比较存活率和至死天数的统计分析，可用来计算P值并确定两组之间的差异是否在统计上有显著意义。P值0.05被认为不显著。
本发明另一方面提供了本发明多肽的抗原性/免疫原性片段、或其类似物。
本发明的片段应该包括一种或多种这样的表位性区域，或与这样的区域基本类似，以保留其抗原性/免疫原性性质。因此，对于本发明的片段，同一性程度也许没有关系，因为它们可能与此处所述多肽或其类似物的特定部分具有100％的同一性。本发明进一步提供了具有本发明多肽序列的至少10个连续氨基酸残基的片段。在一个实施方案中，至少15个连续的氨基酸残基。在一个实施方案中，至少20个连续的氨基酸残基。
技术人员应当理解，本发明多肽的类似物也在本发明范围内得到应用，即作为抗原性/免疫原性物质。因此，举例来说，本发明包括包含一种或多种添加、缺失、置换等的蛋白质或多肽。
此处所用本发明多肽的″片段″、″类似物″或″衍生物″包括其中一个或多个氨基酸残基被替换为保守性或非保守性氨基酸残基(优选保守性)的、可能天然或非天然存在的多肽。在一个实施方案中，本发明多肽的衍生物和类似物应与图示序列或其片段具有大约80％同一性。也就是说，80％的残基相同。在另一实施方案中，多肽具有大于80％的同一性。在另一实施方案中，多肽具有大于85％的同一性。在另一实施方案中，多肽具有大于90％的同一性。在另一实施方案中，多肽具有大于95％的同一性。在另一实施方案中，多肽具有大于99％的同一性。在另一实施方案中，本发明多肽的类似物具有少于约20个氨基酸残基的置换、修饰或缺失，更优选少于10个。
这些置换对该多肽的二级结构和亲水性质影响极小。优选本领域已知的保守性置换，即所置换的残基共有物理或化学性质，例如疏水性、大小、电荷或功能基团。其中包括例如Dayhoff，M.在Atlas ofProtein Sequence and Structure 5，1978中以及Argos，P.在EMBO J.8，779-785，1989中所述的置换。例如，属于下列各组之一的天然或非天然氨基酸代表保守性变化ala，pro，gly，gln，asn，ser，thr，val；cys，ser，tyr，thr；val，ile，leu，met，ala，phe；lys，arg，orn，his；以及phe，tyr，trp，his。
优选的置换还包括相应L-氨基酸的D-对映异构体的置换。
在另一方法中，该类似物可以是融合多肽，例如通过有效标识目的多肽，引入使纯化更为容易的部分。可能需要去除″标签″，或可能融合多肽自身保有充分可用的抗原性。
同源性百分比定义为同一性百分比加上相似性或氨基酸类型保守性百分比的总和。
在一个实施方案中，本发明多肽的类似物与图示序列或其片段具有大约70％同一性。也就是说，70％的残基相同。在另一实施方案中，多肽具有大于80％的同一性。在另一实施方案中，多肽具有大于85％的同一性。在另一实施方案中，多肽具有大于90％的同一性。在另一实施方案中，多肽具有大于95％的同一性。在另一实施方案中，多肽具有大于99％的同一性。在另一实施方案中，本发明多肽的类似物具有少于约20个氨基酸残基的置换、修饰或缺失，更优选少于10个。
在一个实施方案中，本发明多肽的类似物与图示序列或其片段具有大约70％同源性。在另一实施方案中，多肽具有大于80％的同源性。在另一实施方案中，多肽具有大于85％的同源性。在另一实施方案中，多肽具有大于90％的同源性。在另一实施方案中，多肽具有大于95％的同源性。在另一实施方案中，多肽具有大于99％的同源性。在另一实施方案中，本发明多肽的类似物具有少于约20个氨基酸残基的置换、修饰或缺失，更优选少于10个。
人们可以利用诸如CLUSTAL程序比较氨基酸序列。该程序对氨基酸序列进行比较，通过在视情况而定的任一序列中插空而找到最佳比对。有可能计算氨基酸同一性或同源性，进行最佳比对。类似BLASTx的程序可比对最长一段的相似序列，为该匹配赋值。因此有可能实现比对，其中找到各具有不同得分的若干相似性区域。
两种同一性分析均包含于本发明之内。
在另一方法中，该类似物或衍生物可以是融合多肽，例如通过有效标识目的蛋白质或多肽，引入使纯化更为容易的部分，可能需要去除″标签″，或可能融合多肽自身保有充分可用的抗原性。
众所周知，有可能筛选抗原性多肽，以鉴定表位区，即决定该多肽抗原性或免疫原性的区域。进行这种筛选的方法为本领域所公知。因此，本发明的片段应该包括一种或多种这样的表位区，或与这种区域基本类似，以保留其抗原性/免疫原性性质。
因此，对于本发明的片段，同一性程度也许没有关系，因为它们可能与此处所述多肽、类似物的特定部分具有100％的同一性。
因此，对于类似物、衍生物和片段而言，重要的是它们具有至少所来源蛋白质或多肽的一定程度的抗原性/免疫原性。
本发明还包括与可改变该多肽生物学或药理学性质的其它化合物融合的多肽，即提高半衰期的聚乙二醇(PEG)；便于纯化的前导或分泌氨基酸序列；前原-和原-序列；以及(多)糖。
另外，当发现氨基酸区域具有多态性时，可能需要改变一种或多种特定氨基酸，以更有效摹拟不同莫拉氏菌株的不同表位。
此外，可以通过末端-NH2的酰化作用(例如乙酰化、或巯基乙酸酰胺化、末端羧基酰胺化，例如利用氨或甲胺)修饰本发明的多肽，以提供稳定性、提高疏水性，用于连接或结合支持物或其它分子。
本发明还包括该多肽片段和类似物的异型和同型多肽多聚体。这些多聚体形式包括，例如利用交联剂例如亲和素/生物素、戊二醛(gluteraldehyde)或二甲基superimidate交联的一种或多种多肽。这种多聚体形式还包括通过重组DNA技术产生的多顺反子mRNA制备的包含两个或多个串联或颠倒的连续序列的多肽。
在另一实施方案中，本发明还涉及包含一种或多种本申请附图中定义的多肽、或其片段或类似物的嵌合多肽。
在另一实施方案中，本发明还涉及包含两种或多种具有选自SEQID NO2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列的多肽的嵌合多肽；只要该多肽被连接成嵌合多肽。
在另一实施方案中，本发明还涉及包含两种或多种具有选自SEQID NO2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽的嵌合多肽，只要该多肽被连接成嵌合多肽。
本发明多肽的片段、类似物或衍生物优选包含至少一个抗原性区域，即至少一个表位。
为了形成抗原性聚合物(即合成的多聚体)，可以使用具有双卤代乙酰基(bishaloacetyl)、硝基芳卤(nitroarylhalides)等的多肽，这些试剂对硫基具有特异性。因此，不同多肽的两个巯基之间的连接可能是单键或可能由至少2个、一般至少4个、不多于16个、但通常不多于约14个碳原子的连接基团组成。
在特定实施方案中，本发明的多肽片段和类似物不包含起始残基，例如甲硫氨酸(Met)或缬氨酸(Val)。优选多肽不引入前导或分泌序列(信号序列)。可根据已建立的分子生物学技术确定本发明多肽的信号部分。一般而言，可能从莫拉氏菌培养物分离目的多肽，随后测序，以确定成熟蛋白质的起始残基，从而确定成熟多肽的序列。
应当理解，可以制备和/或使用无起始密码子(甲硫氨酸或缬氨酸)和/或无前导肽的多肽，以利于制备和纯化重组多肽。众所周知，克隆无编码前导肽序列的基因将使该多肽限于大肠杆菌细胞质中，便于回收(Glick，B.R.和Pasternak，J.J.(1998)Manipulation of geneexpression in prokaryotes.″Molecular biotechnologyPrinciples andapplications of recombinant DNA″，第二版，ASM Press，WashingtonDC，109-143页)。
本发明另一方面提供了(i)包含本发明多肽连同载体、稀释剂或佐剂物质的组合物；(ii)包含本发明多肽和载体、稀释剂或佐剂的药物组合物；(iii)包含本发明多肽和载体、稀释剂或佐剂的疫苗；(iv)通过给予宿主致免疫有效量的本发明多肽，激发免疫应答，例如对莫拉氏菌的保护性免疫应答，从而诱导宿主中针对莫拉氏菌的免疫应答的方法；特别是(v)通过给予所需宿主预防性或治疗性剂量的本发明多肽，而预防和/或治疗莫拉氏菌感染的方法。
本发明另一方面提供了(i)包含本发明多核苷酸连同载体、稀释剂或佐剂物质的组合物；(ii)包含本发明多核苷酸和载体、稀释剂或佐剂的药物组合物；(iii)通过给予宿主致免疫有效量的本发明多核苷酸，激发免疫应答，例如对莫拉氏菌的保护性免疫应答，从而诱导宿主中针对莫拉氏菌的免疫应答的方法；特别是(iv)通过给予所需宿主预防性或治疗性剂量的本发明多核苷酸，而预防和/或治疗莫拉氏菌感染的方法。
本发明多肽也可以在免疫之前耦联或缀合载体蛋白质，例如破伤风毒素、白喉毒素、乙型肝炎病毒表面抗原、脊髓灰质炎病毒VP1抗原或任何其它病毒性或细菌性毒素或抗原、或任何合适蛋白质以刺激形成更强免疫应答。可以通过化学或遗传方法进行耦联或缀合。有关肽-载体缀合的更详细说明参见Van Regenmortel，M.H.V.，Briand J.P.，Muller S.，PlauéS.，《Synthetic Polypeptides as antigens》inLaboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biolog，19卷(ed.)Burdou，R.H.&Van Knippenberg P.H.(1988)，Elsevier NewYork。
本发明另一方面提供了包含一种或多种本发明莫拉氏菌多肽与药物可接受佐剂的混合的药物组合物。合适的佐剂包括(1)水包油型乳剂，例如MF59TM、SAFTM、RibiTM；(2)弗氏完全或不完全佐剂；(3)盐，即AlK(SO4)2、AlNa(SO4)2、AlNH4(SO4)2、Al(OH)3、AlPO4，硅土、高岭土；(4)皂甙衍生物例如StimulonTM，或其形成的颗粒例如ISCOMs(免疫刺激复合物)；(5)细胞因子例如白细胞介素、干扰素、巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)、肿瘤坏死因子(TNF)；(6)诱导粘膜免疫的其它物质，例如碳多核苷酸，即多聚IC和多聚AU，去毒霍乱菌毒素(CTB)以及大肠杆菌热不稳定性毒素。佐剂的更详细说明参见M.Z.I Khan等人综述Pharmaceutical Research，11卷，No.1(1994)2-11页，还参见Gupta等人综述Vaccine，卷13，No.14，1263-1276页(1995)以及WO99/24578。优选的佐剂包括QuilATM、QS21TM、AlhydrogelTM和AdjuphosTM。
可通过注射、快速输注、鼻咽吸收、皮肤吸收、或含服、或口服，经肠胃外给予本发明的药物组合物。
本发明的药物组合物可用于预防莫拉氏菌感染和/或由莫拉氏菌感染所致疾病和症状，所述于Manual of Clinical Microbiology，P.R.Murray(主编)，E.J.Baron，M.A.Pfalle r，F.C.Tenover和R.H.Yolken.ASM Press，Washington，D.C.第七版，1999，1773页。在一个实施方案中，本发明的药物组合物可用于治疗或预防中耳炎、窦炎、持续性咳嗽、急性喉炎、化脓性角膜炎、新生儿结膜炎。在一个实施方案中，本发明的疫苗组合物可用于治疗或预防莫拉氏菌感染和/或由莫拉氏菌感染所致疾病和症状。在另一实施方案中，该莫拉氏菌感染为粘膜炎莫拉氏菌。
在另一实施方案中，本发明提供了预防或治疗易受莫拉氏菌感染宿主的莫拉氏菌感染的方法，其包含给予所述宿主预防性或治疗性数量的本发明组合物。
本申请所用术语″宿主″包括哺乳动物。在另一实施方案中，该哺乳动物是人。
在特定实施方案中，将药物组合物给予处于莫拉氏菌感染危险中的宿主，例如新生儿、婴儿、儿童、老人以及无免疫应签的宿主。
在特定实施方案中，将药物组合物给予处于莫拉氏菌感染危险中的宿主，例如成人。
药物组合物的单位剂型优选约0.001-100μg/kg(抗原/体重)，更优选0.01-10μg/kg，最优选0.1-1μg/kg，1-3次，免疫之间间隔约1-6周。
药物组合物的单位剂型优选约0.1μg-10mg，更优选1μg-1mg，最优选10-100μg，1-3次，免疫之间间隔约1-6周。
本发明另一个方面提供了编码多肽的多核苷酸，该多肽的特征在于，氨基酸序列包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列。
在一个实施方案中，多核苷酸如SEQ ID No1、3、5、7、9、11、13所示，可能包括开放阅读框架(ORF)，其编码本发明的多肽。
应当理解，图示多核苷酸序列可以改变为简并密码子，但仍编码本发明多肽。因此，本发明进一步提供可与此处上述的多核苷酸序列(或其互补序列)杂交的多核苷酸，序列之间具有70％同一性。在一个实施方案中，序列之间具有至少80％同一性。在一个实施方案中，序列之间具有至少85％同一性。在一个实施方案中，序列之间具有至少90％同一性。在另一实施方案中，多核苷酸在严谨条件下杂交，即具有至少95％同一性。在另一实施方案中，具有多于97％的同一性。
本领域技术人员很容易确定合适的严谨杂交条件(例如参见Sambrook等人，(1989)Molecular cloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.；Current Protocols in MolecularBiology，(1999)Ausubel F.M.等人编著.，John Wiley&Sons，Inc.，N.Y.)。
在另一实施方案中，本发明提供可在严谨条件下与下列序列杂交的多核苷酸(a)编码多肽的DNA序列，或(b)编码多肽的DNA序列的互补序列；其中所述多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14、或其片段或类似物的序列。
在另一实施方案中，本发明提供可在严谨条件下与下列序列杂交的多核苷酸
(a)编码多肽的DNA序列，或(b)编码多肽的DNA序列的互补序列；其中所述多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列。
在另一实施方案中，本发明提供可在严谨条件下与下列序列杂交的多核苷酸(a)编码多肽的DNA序列，或(b)编码多肽的DNA序列的互补序列；其中所述多肽包含至少10个连续的氨基酸残基，其来自包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14、或其片段或类似物的序列的多肽。
在另一实施方案中，本发明提供可在严谨条件下与下列序列杂交的多核苷酸(a)编码多肽的DNA序列，或(b)编码多肽的DNA序列的互补序列；其中所述多肽包含至少10个连续的氨基酸残基，其来自包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽。
在另一实施方案中，多核苷酸如SEQ ID No1、3、5、7、9、11、13所示，或为其片段或类似物，编码本发明的多肽。
在另一实施方案中，多核苷酸如SEQ ID No1、3、5、7、9、11或13所示，编码本发明的多肽。
本领域技术人员容易理解，多核苷酸包括DNA和RNA。
本发明还包括与本申请所述多核苷酸互补的多核苷酸。
另一方面，编码本发明多肽的多核苷酸、或其片段、类似物或衍生物，可用于DNA免疫方法。也就是说，能够将它们引入可进行复制和表达的载体，通过注射从而在体内产生抗原性多肽。例如，可将多核苷酸引入质粒载体，位于在真核细胞中起作用的CMV启动子控制之下。优选肌内注射该载体。
本发明另一方面提供了通过重组技术在宿主细胞中表达编码所述多肽的多核苷酸、并回收所表达的多肽产物、从而制备本发明多肽的方法。另外，可以根据已经建立的化学合成技术制备该多肽，即液相或固相合成寡肽，连接起来制备完整的多肽(区段连接)。
下列参考文献描述了获取并鉴定多核苷酸和多肽的一般方法Sambrook等人，Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold Spring Harbor，N.Y.，1989；Cu rrent Protocols in MolecularBiology，Ausubel F.M.等人编著，John Wiley and Sons，Inc.New York；PCR Cloning Protocols，from Molecular Cloning to GeneticEngineering，White B.A.编著，Humana Press，Totowa，New Jersey，1997，490页；Protein Purification，Principles and Practices，Scopes R.K.，Springer-Verlag，New York，第三版，1993，380页；CurrentProtocols in Immunology，Coligan J.E.等人编著，John Wiley&SonsInc.，New York。
本发明提供了产生多肽的方法，其包含在适于表达所述多肽的条件下培养本发明的宿主细胞。
为进行重组制备，利用编码本发明多肽的载体转染宿主细胞，然后在适当改变的培养基中培养，以活化启动子、选择转化子或扩增基因。合适的载体可在所选宿主中存活并复制，包括染色体、非染色体以及合成DNA序列，例如细菌质粒、噬菌体DNA、杆状病毒、酵母质粒、联合质粒和噬菌体DNA得到的载体。可以利用限制性内切酶将多肽序列引入载体适当位点，使其有效连接包含启动子、核糖体结合位点(共有序列区域或SD序列)以及任选操纵子(控制元件)的表达控制区。可以根据已确立的分子生物学原理，选择适于指定宿主和载体的各个表达控制区元件(Sambrook等人，Molecular CloningALaboratory Manual，2nd ed，Cold Spring Harbor，N. Y.，1989；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel F.M.等人编著，JohnWiley and Sons，Inc.New York)。合适的启动子包括但不限于LTR或SV40启动子、E.coli lac、tac或trp启动子以及噬菌体λPL启动子。载体优选引入复制起点以及选择标志，即氨苄青霉素抗性基因。合适的细菌性载体包括pET、pQE70、pQE60、pQE-9、pD10 phagescript、psiX174、pbluescript SK、pbsks、pNH8A、pNH16a、pNH18A、pNH46A、ptrc99a、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5以及真核载体pBlueBacIII、pWLNEO、pSV2CAT、pOG44、pXT1、pSG、pSVK3、pBPV、pMSG和pSVL。宿主细胞可能是细菌，即大肠杆菌(E.coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、链霉菌(Streptomyces)；真菌，即黑曲霉(Aspergillus niger)、构巢曲菌(Aspergillus nidulins)；酵母，即糖酵母属(Saccharomyces)或真核细胞，即CHO、COS。
在培养物中表达多肽后，一般离心收集细胞，然后利用物理或化学方法裂解(如果该表达多肽未分泌到培养基中)，保留得到的粗提物，以分离目的多肽。根据多肽性质，利用已建立的技术从培养基或裂解物中纯化多肽，即使用硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、羟基磷灰石层析以及凝集素层析。使用HPLC完成最终纯化。
该多肽可能在有或没有前导或分泌序列的情况下表达。在前一种情况下，可能利用翻译后加工去除前导序列(参见US 4,431,739；US4,425,437和US 4,338,397)，或在纯化所表达的多肽之后，通过化学去除。
另一方面，本发明的莫拉氏菌多肽可用于莫拉氏菌感染、特别是粘膜炎莫拉氏菌感染的诊断性检验。可能有若干诊断方法，例如，可以按照以下方法检测生物样品中的莫拉氏菌生物体(a)从宿主获得生物样品；(b)将与本发明的莫拉氏菌多肽具有反应性的抗体或其片段与该生物样品温育，以形成混合物；以及(c)在混合物中检测表示存在莫拉氏菌的特异性结合的抗体或片段。
另外，在包含或怀疑包含莫拉氏菌抗原的特异性抗体的生物样品中检测所述抗体的方法，可能如下进行a)从宿主获得生物样品；b)将本发明的一种或多种莫拉氏菌多肽或其片段与该生物样品温育，以形成混合物；以及c)在混合物中检测特异性结合的抗原或片段，其表示存在莫拉氏菌的特异性抗体。
本领域技术人员应当承认，该诊断性检验可能具有几种形式，包括免疫学检验，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定或乳胶凝集测定，可基本确定生物体中是否存在该蛋白质的特异性抗体。
编码本发明多肽的DNA序列也可能用来设计DNA探针，用于在怀疑包含莫拉氏菌的生物样品中检测这种细菌。本发明的检测方法包含(a)从宿主获得生物样品；(b)将具有编码本发明多肽的DNA序列的一种或多种DNA探针与该生物样品温育，以形成混合物；以及(c)在混合物中检测表示存在莫拉氏细菌的特异性结合的DNA探针。本发明的DNA探针还可用于检测循环中的莫拉氏菌，即样品中的莫拉氏菌核酸，例如使用聚合酶链式反应，作为诊断莫拉氏菌感染的方法。探针可能使用常规技术合成并可能固定于固相上，或者利用可检测标志进行标记。本申请优选的DNA探针是具有与本发明莫拉氏菌多肽的至少约6个连续核苷酸互补的序列的寡聚体。在另一实施方案中，优选的DNA探针是具有与本发明莫拉氏菌多肽的至少约15个连续核苷酸互补的序列的寡聚体。在另一实施方案中，优选的DNA探针是具有与本发明莫拉氏菌多肽的至少约30个连续核苷酸互补的序列的寡聚体。在另一实施方案中，优选的DNA探针是具有与本发明莫拉氏菌多肽的至少约50个连续核苷酸互补的序列的寡聚体。
检测宿主中莫拉氏菌的另一诊断方法包含(a)利用可检测标志标记与本发明多肽或其片段具有反应性的抗体；(b)将该标记抗体或标记片段给予宿主；以及(c)在宿主中检测表示存在莫拉氏菌的特异性结合的标记抗体或标记片段。
另外，在包含或怀疑包含莫拉氏菌抗原的特异性抗体的生物样品中检测所述抗体的方法，可能如下进行a)从宿主获得生物样品；b)将该生物样品与本发明的一种或多种莫拉氏菌多肽或其片段温育，以形成混合物；以及c)检测混合物中特异性结合的抗原或片段，其表示存在莫拉氏菌的特异性抗体。
本领域技术人员应当承认，该诊断性检验可能具有几种形式，包括免疫学检验，例如酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定或乳胶凝集测定，可基本确定生物体中是否存在该蛋白质的特异性抗体。
编码本发明多肽的DNA序列也可能用来设计DNA探针，用于在怀疑包含莫拉氏菌的生物样品中检测这种细菌。本发明的检测方法包含(a)从宿主获得生物样品；(b)将该生物样品与具有编码本发明多肽的DNA序列的一种或多种DNA探针温育，以形成混合物；以及(c)在混合物中检测表示存在莫拉氏菌的特异性结合的DNA探针。
本发明一方面提供抗体在治疗和/或预防莫拉氏菌感染中的用途。
本发明另一方面在于本发明莫拉氏菌多肽作为免疫原在制备特异性抗体中的用途，用于诊断特别是治疗莫拉氏菌感染。利用适当的筛选方法，例如通过在测试模型中测定特定抗体被动防止莫拉氏菌感染的能力，可以确定合适的抗体。动物模型的例子之一为此处实施例所述小鼠模型。该抗体可能是完整抗体或其抗原结合片段，并可能属于任何免疫球蛋白类型。该抗体或片段可能来源于动物，特别是哺乳动物，更特别是小鼠、大鼠或人。可能是天然抗体或其片段，或如果需要，可能是重组抗体或抗体片段。术语重组抗体或抗体片段是指利用分子生物学技术制备的抗体或抗体片段。可能是多克隆的、或优选单克隆的抗体或抗体片段。可能特异性针对与莫拉氏菌多肽有关的多种表位，但优选特异性针对一种。
本发明一方面提供抗体在预防和/或治疗莫拉氏菌感染中的用途。
本发明另一方面在于本发明的莫拉氏菌多肽作为免疫原在制备特异性抗体中的用途，用于诊断特别是治疗莫拉氏菌感染。利用适当的筛选方法，例如通过在测试模型中测定特定抗体被动防止莫拉氏菌感染的能力，可以确定合适的抗体。动物模型的例子之一为此处实施例所述小鼠模型。该抗体可能是完整抗体或其抗原结合片段，并可能属于任何免疫球蛋白类型。该抗体或片段可能来源于动物，特别是哺乳动物，更特别是小鼠、大鼠或人。可能是天然抗体或其片段，或如果需要，可能是重组抗体或抗体片段。术语重组抗体或抗体片段是指利用分子生物学技术制备的抗体或抗体片段。可能是多克隆的、或优选单克隆的抗体或抗体片段。可能特异性针对与莫拉氏菌多肽有关的多种表位，但优选特异性针对一种。
本发明另一方面在于针对本发明多肽的抗体在被动免疫中的用途。可以使用本申请所述抗体。
本发明另一方面在于通过给予宿主数量足以提供被动免疫的本发明多肽进行免疫、从而产生抗体的方法。
在另一实施方案中，本发明提供本发明的药物组合物在制备预防性或治疗性治疗莫拉氏菌感染的药物中的用途。
在另一实施方案中，本发明提供包含本发明多肽的试剂盒，用于检测或诊断莫拉氏菌感染。
除非另外定义，此处所用全部技术和科学术语具有本发明所属领域技术人员通常所理解的相同含义。此处提及的所有出版物、专利申请、专利及其它参考文献均全文引入以供参考。如有冲突，则按本说明书、包括定义为准。此外，材料、方法和实施例仅为说明目的，而非意在限制。
实施例1本实施例阐明BVH-MC2基因及相应多肽的克隆和分子特征。从粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的基因组DNA中PCR(DNA热循环仪GeneAmp PCR系统2400，Perkin Elmer，San Jose，CA)扩增粘膜炎莫拉氏菌BVH-MC2(SEQ ID NO1)基因编码区，使用下列寡聚物，其中包含供加入限制性位点NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)的碱基突出端DMAR544(5′-CATCAGTGCATATGAATACGACACACCATCACACG-3′)；DMAR545(5′-GAGTTATTCTCGAGTTTGTCCAAATTTGGCTTAGTTTTAC-3′)。使用QIAgen的QIAquick凝胶提取试剂盒，按照厂家说明(Chatsworth，CA)，从琼脂糖凝胶中纯化PCR产物，并用NdeI和XhoI(Amersham Pharmacia Biotech，Inc，Baie d′Urfé，Canada)消化。pET21b(+)载体(Novagen，Madison，WI)经NdeI和XhoI消化，利用QIAgen(Chatsworth，CA)的QIAquick凝胶提取试剂盒，从琼脂糖凝胶中纯化。将NdeI-XhoI PCR产物连接到NdeI-XhoI pET21b(+)表达载体。按照Simanis方法(Hanahan，D.DNA Cloning，1985，D.M.Glover(ed)，109-135页)，将连接产物转化大肠杆菌株DH5α[Φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF) U169 endA1 recA1hsdR17(rK-mK+)deoR thi-1supE44λ-gyrA96 relA1](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。使用QIAgen试剂盒(Chatsworth，CA)纯化包含BVH-MC2基因的重组pET21b(+)质粒(rpET21b(+))，测序DNA插入序列(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing试剂盒，ABI，Foster City，CA)。
表1.用于PCR扩增粘膜炎莫拉氏菌基因的寡核苷酸引物。
已经确定，编码BVH-MC2多肽的开放阅读框架(ORF)包含1467bp，编码488个氨基酸残基的多肽，其预测的pI为6.08，预测的分子量为53754.35 Da。使用Spscan软件(Wisconsin Sequence AnalysisPackage；Genetics Computer Group)分析预测的氨基酸残基序列(SEQID NO2)，提示存在30个氨基酸残基的信号肽(MDTDMKHLTKHRLSAAIIGVLLFISPSVQA)，在丙氨酸和天门冬酰胺残基间的切割位点处结束。
为利用PCR扩增证实存在BVH-MC2(SEQ ID NO1)基因，使用以下4个不同的粘膜炎莫拉氏菌株粘膜炎莫拉氏菌ETSU C-2、ETSU T-25和ETSU 658临床分离物由East Tennessee StateUniversity提供；粘膜炎莫拉氏菌菌株M-12由centre de recherche eninfectiologie du centre hospitalier de l′universitéLaval提供。这些实验使用大肠杆菌XL1 Blue MRF′作为阴性对照。使用寡核苷酸引物DMAR544和DMAR545(表1)，从4株粘膜炎莫拉氏菌菌株和对照大肠杆菌菌株的基因组DNA中PCR(DNA热循环仪GeneAmp PCR系统2400，Perkin Elmer，San Jose，CA)扩增BVH-MC2(SEQ ID NO1)基因。在94℃30秒、51℃30秒、72℃1分20秒进行30个循环，最后72℃延伸7分钟，进行PCR。在1％琼脂糖凝胶中分离PCR产物，通过溴化乙锭染色观察。PCR扩增结果如表2所示。分析扩增产物表明，BVH-MC2(SEQ ID NO1)基因存在于所检测的所有4个粘膜炎莫拉氏菌菌株的基因组中。同样利用这些寡核苷酸引物PCR扩增对照的大肠杆菌DNA，未检测到产物。
测序其它菌株的BVH-MC2基因，证实该基因在粘膜炎莫拉氏菌菌株间具有高水平的分子保守性。使用上述寡核苷酸引物DMAR544和DMAR545，PCR扩增来自菌株ETSU 658(SEQ ID NO3)、ETSUT-25(SEQ ID NO5)以及M-12(SEQ ID NO7)的粘膜炎莫拉氏菌BVH-MC2基因的各自编码区。使用QIAgen的QIAquick凝胶提取试剂盒，按厂家说明书(Chatsworth，CA)从琼脂糖凝胶中纯化PCR产物，测序DNA插入序列(Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing试剂盒，ABI，Foster City，CA)。按实施例1的相同方法获得全序列。预测的菌株ETSU C-2(SEQ ID NO2)、ETSU 658(SEQ ID NO4)、ETSU T-25(SEQ ID NO6)以及M-12(SEQ ID NO8)的氨基酸序列分别如图2、4、6和8所示。图15和16分别描述粘膜炎莫拉氏菌BVH-MC2的共有序列核苷酸和预测的氨基酸序列。逐对比较BVH-MC2预测的多肽序列，显示100％同一性。后一结果清楚表明BVH-MC2多肽在粘膜炎莫拉氏菌分离物之间高水平的分子保守性。
表2.PCR扩增鉴定粘膜炎莫拉氏菌基因。
实施例2本实施例阐明BVH-MC3基因及相应多肽的克隆和分子特征。从粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的基因组DNA中PCR(DNA热循环仪GeneAmp PCR系统2400，Perkin Elmer.San Jose，CA)扩增粘膜炎莫拉氏菌BVH-MC3(SEQ ID NO9)基因编码区，使用下列寡聚物，其中包含供加入限制性位点NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)的碱基突出端表1所示的DMAR592和DMAR593。用来将BVH-MC3克隆到表达载体并测序的方法与实施例1类似。已经确定，编码BVH-MC3的开放阅读框架(ORF)包含1656bp，编码551个氨基酸残基的多肽，其预测的pI为4.68，预测的分子量为58910.13 Da。使用Spscan软件(Wisconsin Sequence Analysis Package；Genetics Computer Group)分析预测的氨基酸残基序列(SEQ ID NO10)，提示存在46个氨基酸残基的信号肽(MSLINKLNERITPHVLTSIKNQDGDNADKSNLLTAFYTIFAGRLSN)，在天门冬酰胺和谷氨酸残基间的切割位点处结束。
使用寡核苷酸引物DMAR592和DMAR593进行PCR扩增以后，显示在所检测的4个粘膜炎莫拉氏菌菌株中存在BVH-MC3基因(表2)。用来PCR扩增BVH-MC3基因的方法与实施例1类似。同样利用这些寡核苷酸引物PCR扩增对照的大肠杆菌DNA，未检测到该产物。
实施例3本实施例阐明BVH-MC4基因及相应多肽的克隆和分子特征。
从粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的基因组DNA中PCR(DNA热循环仪GeneAmp PCR系统2400，Perkin Elmer，San Jose，CA)扩增粘膜炎莫拉氏菌BVH-MC4(SEQ ID NO11)基因编码区，使用下列寡聚物，其中包含供加入限制性位点NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)的碱基突出端表1所示的RIOS71和RIOS72。用来将BVH-MC4克隆到表达载体并测序的方法与实施例1类似。
已经确定，编码BVH-MC4的开放阅读框架(ORF)包含1251bp，编码416个氨基酸残基的多肽，其预测的pI为4.84，预测的分子量为46125.11 Da。使用Spscan软件(Wisconsin Sequence Analysis Package；Genetics Computer Group)分析预测的氨基酸残基序列(SEQ ID NO12)，提示存在42个氨基酸残基的信号肽(MDTKHIQQNWLLPDGVADVLFTDAQKQESLRDALLFVLTAHG)，在甘氨酸和酪氨酸残基间的切割位点处结束。
使用寡核苷酸引物RIOS71和RIOS72进行PCR扩增以后，显示在所检测的4个粘膜炎莫拉氏菌菌株中存在BVH-MC4基因(表2)。用来PCR扩增BVH-MC4基因的方法与实施例1类似。同样利用这些寡核苷酸引物PCR扩增对照的大肠杆菌DNA，未检测到该产物。
实施例4本实施例阐明BVH-MC5基因及相应多肽的克隆和分子特征。
从粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的基因组DNA中PCR(DNA热循环仪GeneAmp PCR系统2400，Perkin Elmer，San Jose，CA)扩增粘膜炎莫拉氏菌BVH-MC5(SEQ ID NO13)基因编码区，使用表1所示的RIOS59和RIOS60寡聚物，其中包含供加入限制性位点NdeI(CATATG)和XhoI(CTCGAG)的碱基突出端。用来将BVH-MC5克隆到表达载体并测序的方法与实施例1类似。
已经确定，编码BVH-MC5的开放阅读框架(ORF)包含639 bp，编码212个氨基酸残基的多肽，其预测的pI为7.45，预测的分子量为24020.08 Da。使用Spscan软件(Wisconsin Sequence Analysis Package；Genetics Computer Group)分析预测的氨基酸残基序列(SEQ ID NO14)，提示存在60个氨基酸残基的信号肽(MNNFVYQLQSFWYELNQVNRHTIAQSPKYIQLTVLGLIVMIIGIFGWLLAIL PTIQKLNA)，在两个丙氨酸之间的切割位点处结束。
使用寡核苷酸引物RIOS59和RIOS60进行PCR扩增以后，显示在所检测的4个粘膜炎莫拉氏菌菌株中存在BVH-MC5基因(表2)。用来PCR扩增BVH-MC5基因的方法与实施例1类似。同样利用这些寡核苷酸引物PCR扩增对照的大肠杆菌DNA，未检测到该产物。
实施例5本实施例阐明在CMV质粒pCMV-GH中克隆粘膜炎莫拉氏菌基因。
将粘膜炎莫拉氏菌多肽DNA编码区插入质粒载体pCMV-GH(Tang等人，Nature，1992，356152)中，位于巨细胞病毒(CMV)启动子转录控制下的人生长激素(hGH)基因下游。该CMV启动子在大肠杆菌细胞中是无功能质粒，但在将该质粒给予真核细胞后活化。该载体还引入了氨苄青霉素抗性基因。
从粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU C-2的基因组DNA中PCR(DNA热循环仪GeneAmp PCR系统2400，Perkin Elmer，San Jose，CA)扩增BVH-MC2(SEQ ID NO1)、BVH-MC3(SEQ ID NO9)、BVH-MC4(SEQ ID NO11)和BVH-MC5(SEQ ID NO13)基因不带有其前导肽区的编码区，使用表1所示的寡核苷酸引物，其中包含供加入限制性位点BamHI(GGATCC)、BglII(AGATCT)、SalI(GTCGAC)或HindIII(AAGCTT)的碱基突出端。使用QIAgen的QIAquick凝胶提取试剂盒(Chatsworth，CA)，从琼脂糖凝胶中纯化PCR产物，并用限制性内切酶(Amersham Pharmacia Biotech，Inc，Baie d′Urfe，Canada)消化。利用BamHI、BglII、SalI或HindIII消化pCMV-GH载体(Laboratory of Dr.Stephen A.Johnston，Department of Biochemistry，The University of Texas，Dallas，Texas)，并使用QIAgen的QIAquick凝胶提取试剂盒(Chatsworth，CA)从琼脂糖凝胶中纯化。将消化的DNA片段连接到消化的pCMV-GH载体，产生位于CMV启动子控制下的 hGH-BVH-MC2、hGH-BVH-MC3、hGH-BVH-MC4和hGH-BVH-MC5融合多肽。按照Simanis方法(Hanahan，D.DNACloning，1985，D.M.Glover(ed)，109-135页)，将连接产物转化大肠杆菌菌株DH5α[Φ80dlacZΔM15Δ(lacZYA-argF)U169 endA1 recA1hsdR17(rK-mK+)deoR thi-1 supE44λ-gyrA96 relA1](Gibco BRL，Gaithersburg，MD)。使用QIAgen试剂盒(Chatsworth，CA)纯化重组pCMV质粒，通过DNA测序证实DNA插入片段的核苷酸序列。
实施例6本实施例阐明DNA在激发对粘膜炎莫拉氏菌多肽抗原的免疫应答中的用途。
在50μg表达粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)的质粒pCMV-GH-GM-CSF(Laboratory of Dr.Stephen A.Johnston，Department of Biochemistry，The University of Texas，Dallas，Texas)的存在下，肌内注射100μl编码BVH-MC2(SEQ ID NO1)、BVH-MC3(SEQ ID NO9)、BVH-MC4(SEQ ID NO11)和BVH-MC5(SEQ ID NO13)基因的50μg重组pCMV-GH，注射3次，间隔2或3周，免疫每组8只雌性BALB/c小鼠(Charles River，St-Constant，Québec，Canada)。在50μg pCMV-GH-GM-CSF存在下，给一组小鼠注射50μg pCMV-GH，作为对照。每次免疫之前以及第三次注射后七天，从眼窝采集血样，使用相应的His-Tag标记的粘膜炎莫拉氏菌重组多肽作为包被抗原，利用ELISA测定血清抗体反应。如实施例7所示制备并纯化这些His标签标记的粘膜炎莫拉氏菌重组多肽。
实施例7本实施例阐明粘膜炎莫拉氏菌重组多肽的制备和纯化。
使用带有BVH-MC2(SEQ ID NO1)、BVH-MC3(SEQ ID NO9)、BVH-MC4(SEQ ID NO11)和BVH-MC5(SEQ ID NO13)基因的重组pET21b(+)质粒电穿孔(Gene Pulser II仪器，BIO-RAD Labs，Mississauga，Canada)转化大肠杆菌菌株AD494(DE3)[Δara-leu 7697ΔlacX74 ΔphoA PvuII phoR ΔmalF3 F′[lac+(lacIq)prol trxB∷Kan(DE3)](Novagen，Madison，WI)。在该大膜杆菌菌株中，控制重组多肽表达的T7启动子由T7 RNA聚合酶(存在于λDE3原噬菌体)特异性识别，T7 RNA聚合酶基因位于可由异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导的lac启动子控制之下。将AD494(DE3)/rpET21b(+)转化子在包含100μg/ml羧苄青霉素(Sigma-Aldrich，Canada Ltd.，Oakville，Canada)的LB培养基中(蛋白胨10g/L、酵母抽提物5g/L、NaCl10g/L)、于37℃、250转/分振荡培养，直至A600达到0.5。为诱导His标签的粘膜炎莫拉氏菌重组多肽生成，将细胞在终浓度1mM IPTG存在下再培养3小时。离心沉淀500ml培养物的诱导细胞，冻于-70℃。
根据His·Tag序列(6个连续组氨酸残基)可结合固定于His·Bind金属螯合树脂的二价阳离子(Ni2+)的特性，利用亲和层析从IPTG诱导AD494(DE3)/rpET21b(+)的可溶性细胞质组分中纯化该重组多肽。简言之，从IPTG诱导的500mL培养物中获得的沉淀细胞重悬于包含1mM PMSF的裂解缓冲液(20mM Tris，500mM NaCl，10mM咪唑，pH 7.9)，超声处理，12,000Xg离心20分钟，去除碎片。将上清置于Ni-NTA琼脂糖柱(Qiagen，Mississauga，Ontario，Canada)。利用250 mM咪唑-500mM NaCl-20 mM Tris pH7.9洗脱His标签标记的粘膜炎莫拉氏菌重组多肽。通过对PBS 4℃透析，从样品中去除盐和咪唑。利用MicroBCA(Pierce，Rockford，Illinois)测定从大肠杆菌可溶组分中获得的重组多肽数量。
实施例8本实施例阐明该His标签的粘膜炎莫拉氏菌重组多肽与人腭扁桃体以及利用粘膜炎莫拉氏菌抗原性制剂免疫小鼠后收集的血清的反应性。
如表3所示，在免疫印迹中，人腭扁桃体中存在的抗体可识别BVH-MC2、BVH-MC3和BVH-MC4His标签的重组多肽。表明与粘膜炎莫拉氏菌一般接触的人形成特异性针对这些多肽的抗体。这些特别的人类抗体可能与防止粘膜炎莫拉氏菌感染有关。此外，免疫印迹还显示，利用富含可在小鼠模型中诱导显著肺清除的膜多肽的粘膜炎莫拉氏菌抗原性制剂免疫小鼠后收集的血清，还形成可识别BVH-MC2His标签的重组多肽的抗体。这些结果表明，在保护小鼠抗感染的粘膜炎莫拉氏菌抗原性制剂中存在该多肽，可诱导与相应BVH-MC2His标签的重组多肽反应的抗体。
表3.人腭扁桃体以及利用粘膜炎莫拉氏菌抗原性制剂免疫后的小鼠血清与粘膜炎莫拉氏菌His标签的融合重组多肽在免疫印迹中的反应性。
1使用如实施例7所述制备并纯化的His标签的重组多肽进行免疫印迹。
2SDS-PAGE之后测定His标签的重组多肽的分子量。
3人腭扁桃体不经稀释，进行免疫印迹。
4利用富含膜多肽的粘膜炎莫拉氏菌抗原性制剂免疫后收集的小鼠血清合并，稀释1/500，进行免疫印迹。这些小鼠可防止粘膜炎莫拉氏菌的攻击。
实施例9本实施例阐明BVH-MC2、BVH-MC3、BVH-MC4和BVH-MC5多肽的抗体可接近粘膜炎莫拉氏菌菌株表面。
细菌在包含0.25％葡萄糖的脑心浸液(BHI)培养基中，于37℃、8％CO2环境中生长至OD490nm为0.650(～108CFU/ml)。然后加入抗BVH-MC2、抗BVH-MC3、抗BVH-MC4、抗BVH-MC5或对照血清，4℃温育振摇2小时，使之与细胞结合。样品在封闭缓冲液[包含2％牛血清白蛋白(BSA)的磷酸缓冲盐溶液(PBS)]中洗涤4次，然后加入1ml利用封闭缓冲液特定稀释的缀合荧光素(FITC)的山羊抗小鼠IgGFc(γ)片段。暗处振摇室温再培养60分钟后，样品在封闭缓冲液中洗涤4次，利用0.25％甲醛的PBS缓冲液4℃固定18小时。细胞在PBS缓冲液中洗涤2次，重悬于0.5ml PBS缓冲液中。细胞于4℃暗处保存，直至流式细胞术分析(EpicsXL；Beckman Coulter，Inc.)。流式细胞术分析表明，BVH-MC2、BVH-MC3、BVH-MC4和BVH-MC5的特异性抗体可有效识别所检测的同源(ETSU C-2)粘膜炎莫拉氏菌菌株表面暴露的相应表位(表4)。已经确定，在所分析的10,000个莫拉氏菌细胞中，超过70％标记有特异性血清中的抗体。这些观察清楚表明，这些多肽可到达细胞表面，而易于被抗体识别。表明抗粘膜炎莫拉氏菌抗体在防护粘膜炎莫拉氏菌感染中具有重要作用。
表4.测定BVH-MC2、BVH-MC3、BVH-MC4和BVH-MC5的特异性抗体于粘膜炎莫拉氏菌ETSU-C2完整细胞的表面的附着。
1小鼠皮下注射混合10μg QuilA佐剂(Cedarlane Laboratories，Hornby，Canada)的20μg纯化的重组多肽，注射5次，间隔2周。血清按1/50稀释。
2将利用免疫血清标记细胞后获得的荧光中间值除以利用对照小鼠血清获得的荧光值，计算荧光指数。荧光值为1表示在完整莫拉氏菌细胞表面未结合抗体。
3标记细胞占10,000个分析细胞的％。
4合并从未免疫或伪免疫(sham-immunized)小鼠收集的血清，稀释1/50，作为该分析的阴性对照。
5将利用20μg纯化的外膜多肽免疫小鼠获得的血清稀释1/1000，用作该分析的阳性对照。
实施例10本实施例阐明抗BVH-MC2小鼠血清的杀菌活性。
将细菌接种于巧克力琼脂平板，在37℃、8％CO2环境中培养18小时。细菌细胞然后重悬于溶菌缓冲液[10％Hanks’平衡盐溶液(HBSS)和1％水解酪蛋白，pH 7.3]，至OD490nm为0.25，稀释为8×104CFU/ml。混合25μl细菌悬液、50μl稀释的热灭活待检血清和15μl HBSS，37℃、8％CO2下振荡(200转/分)温育15分钟，进行杀菌分析。然后加入终浓度10％的含补体的兔血清，混合物于37℃、8％CO2下再振荡(200转/分)温育60分钟。温育结束时将10μl分析混合物接种巧克力琼脂平板，测定活细菌数。将平板于37℃、8％CO2环境下温育18-24小时。利用热灭活的、免疫前收集的小鼠血清和兔补体温育细菌，作为对照。
按下列数学式确定裂解％100-[AB×100]]]>A＝细菌与免疫血清温育时得到的CFUB＝由放血前的血清得到的CFU使用粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU 658评价血清的杀菌活性。确定利用纯化的重组BVH-MC2多肽(SEQ ID NO2)免疫后收集的小鼠血清的裂解百分比为71.3(表5)。
表5.评价抗BVH-MC2小鼠血清的杀菌活性。
1小鼠皮下注射混合10μg QuilA佐剂(Cedarlane Laboratories，Hornby，Canada)的20μg纯化的重组多肽，注射5次，间隔2周。
2将利用20μg纯化的外膜多肽免疫小鼠获得的血清稀释1/35，用作该分析的阳性对照。
实施例11本实施例阐明抗BVH-MC3小鼠血清的杀菌活性。
将细菌接种于巧克力琼脂平板，在37℃、8％CO2环境中培养18小时。细菌细胞然后重悬于溶菌缓冲液[10％Hanks’平衡盐溶液(HBSS)和1％水解酪蛋白，pH7.3]，至OD490nm为0.25，稀释到8×104CFU/ml。混合25μl细菌悬液、50μl稀释的热灭活待检血清和15μl HBSS，37℃、8％CO2下振荡(200转/分)温育15分钟，进行杀菌分析。然后加入终浓度10％的含补体的兔血清，混合物于37℃、8％CO2下再振荡(200转/分)温育60分钟。温育结束时将10μl分析混合物接种巧克力琼脂平板，测定活细菌数。将平板于37℃、8％CO2环境下温育18-24小时。利用热灭活的、免疫前收集的小鼠血清和兔补体温育细菌，作为对照。使用粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU 658评价血清的杀菌活性。
按下列数学式确定裂解％100-[AB×100]]]>A＝细菌与免疫血清温育时得到的CFUB＝由放血前的血清得到的CFU在利用纯化的重组BVH-MC3多肽免疫的7只小鼠的血清中发现杀菌性抗体(表6)。对照小鼠的血清没有记录到杀菌活性(数据略)。
表6.评价抗BVH-MC3小鼠血清的杀菌活性。
1小鼠S1-S7皮下注射混合10μg QuilA佐剂(CedarlaneLaboratories，Hornby，Canada)的20μg纯化的重组多肽，注射5次，间隔2周。
2从BVH-MC3免疫小鼠收集的每份小鼠血清按1/50稀释。
3将利用20μg纯化的外膜多肽免疫小鼠获得的血清按1/50稀释，用作该分析的阳性对照。
实施例12本实施例阐明通过用纯化的重组BVH-MC3多肽免疫诱导的对小鼠抗粘膜炎莫拉氏菌感染的保护作用。
在10％QuilA佐剂(Cedarlane Laboratories Ltd，Hornby，Canada)存在下利用20μg亲和纯化的His标签的粘膜炎莫拉氏菌重组BVH-MC3多肽、或单独QuilA佐剂的PBS溶液作为对照，皮下免疫每组雌性BALB/c小鼠(Charles River)，免疫5次，间隔2周。在每次免疫前的第0、14、28、42和56天、以及第5次注射后的14天(第70天)，从眼窝采集血样。一周以后，利用大约1×106CFU的粘膜炎莫拉氏菌菌株ETSU 658肺内攻击小鼠。将粘膜炎莫拉氏菌攻击接种物接种于巧克力琼脂板块，以测定CFU，确证攻击剂量。感染5小时以后，通过腹膜内注射戊巴比妥钠(EuthanylTM)处死小鼠。切下完整的肺，在组织匀浆器中匀浆。通过接种系列稀释的肺匀浆液，测定CFU，评价细菌清除作用。按下列数学式确定清除％100-[AB×100]]]>A＝利用BVH-MC3多肽免疫的小鼠得到的CFUB＝由对照小鼠得到的CFU如表7所示，利用BVH-MC3多肽免疫的小鼠与对照组小鼠相比，测定其活细菌数量减少54％。因此，利用重组BVH-MC3多肽免疫可促进从小鼠肺中快速清除异种粘膜炎莫拉氏菌菌株。
表7.通过用纯化的重组BVH-MC3多肽免疫小鼠的肺部清除莫拉氏菌
a6只小鼠的平均值±标准差。
b7只小鼠的平均值土标准差。
c利用1×106CFU的细菌肺内攻击小鼠，攻击5小时后从肺中回收存活细菌。利用上述数学式计算清除％。
序列表<110>Shire Biochem Inc.
<120>粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏球菌属)抗原<130>74872-83<150>US 60/290,653<151>2001-05-15<160>30<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1467<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌(Moraxella catarrhalis)<400>1atggacactg acatgaaaca tttaacaaaa catcgcctat cagctgccat cattggcgtt60ttattattca ttagcccatc agtgcaagca aatacgacac accatcacac gctaaccagt 120agcgagctta aacttgctga tgatagtatt attgatagta tcaatcaatt gggtgagctg 180accgtcaata ttccaaatac acaatatttt caaaccaaca acggtgtgag cgttgctttt 240acgccattac atgagctgcc tattgtcgat atcagcttgt attttaatgc agggtcagcg 300tatgaccatc aggttggcaa atcaggcacg gctaacatgg ttgcaaccat gctcacccaa 360ggaactgaca gcctttctga agatgagttt gttgctgcca aagagcgtct tggcattgat 420tttaccagta cagcaaataa ggataactta actttatcat taagaagctt gtctgatcaa 480tcattattaa atcaagccgc cgatttaatg gtcgatgctg tcactcaacc tgcttttgat 540gataagactc tacaacgcaa caaaaatcag ctcatcacca gtttaaaaca aaaaaagcaa 600aacccttatc atgtagcttc tgttgcttat catcaagccg tatatgaaaa tcatccttat 660gcacacgcaa ccacaggcga tgaagatagt attgccaaaattgatcgtga tgagctgctt720aatttttggc atacttttat taatgcaaat aatgcgacac tggtgattac aggtgatatg 780accgccgagc aagccaaatc acttgccaac catctgaccg ccaaattacc gacaggcaag 840tcgtataaaa atacgctgga tttgacaaaa ccagttaagg ctcgtcatat ccatattcct 900cacaacagta gtcaaaccca aatcatcatc ggtcatccca ccagtaaagt acgcacggac 960aaagcaggtc gtcaagagtt cagcgatttt tcattaggta atgaaatttt ggcaggtggt 1020gattttaatg ccagattgat gaaaaccatt cgagagcaaa aaggctacac ttatggcatt 1080tatggcggta tggaacgcct cagagcaggt ggtaattatg tggttgaatt ttcaaccgat 1140ggcgataaag cagccgatgc cattttagag acgctacaca tcattaatga gtcgctgaat 1200gaaggcataa cccaagaaga gcttgagttg gtgcgtttgg gcaataaaaa tggttttgcc 1260
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<212>DNA<213>粘膜炎莫拉氏菌<400>5gagcttaaac ttgctgatga tagtattatt gatagtatca atcaattggg tgagctgacc60gtcaatattc caaatacaca atattttcaa accaacaacg gtgtgagcgt tgcttttacg 120ccattacatg agctgcctat tgtcgatatc agcttgtatt ttaatgcagg gtcagcgtat 180gaccatcagg ttggcaaatc aggcacggct aacatggttg caaccatgct cacccaagga 240actgacagcc tttctgaaga tgagtttgtt gctgccaaag agcgtcttgg cattgatttt 300accagtacag caaataagga taacttaact ttatcattaa gaagcttgtc tgatcaatca 360ttattaaatc aagccgccga tttaatggtc gatgctgtca ctcaacctgc ttttgatgat 420aagactctac aacgcaacaa aaatcagctc atcaccagtt taaaacaaaa aaagcaaaac 480ccttatcatg tagcttctgt tgcttatcat caagccgtat atgaaaatca tccttatgca 540cacgcaacca caggcgatga agatagtatt gccaaaattg atcgtgatga gctgcttaat 600ttttggcata cttttattaa tgcaaataat gcgacactgg tgattacagg tgatatgacc 660gccgagcaag ccaaatcact tgccaaccat ctgaccgcca aattaccgac aggcaagtct 720tataaaaata cgctggattt gacaaaacca gttaaggctc gccatatcca tattcctcac 780aacagtagtc aaacccaaat catcatcggt caccccacca gtaaagtacg cacggacaaa 840gcaggtcgtc aagagttcag cgatttttca ttaggtaatg aaattttggc aggtggtgat 900tttaatgcca gattgatgaa aaccattcga gagcaaaaag gctacactta tggcatttat 960ggcggtatgg aacgcctcag agcaggtggt aattatgtgg ttgaattttc aaccgatggc 1020gataaagcag ccgatgccat tttagagacg ctacacatca ttaatgagtc gctgaatgaa 1080ggcataaccc aagaagagct tgagttggtg cgtttgggca ataaaaatgg ttttgccaat 1140attttttcaa gcaatgccag tattcatcgt gtcattggtg ctttatttgt tgccgattat 1200ccaaaagatc atcttaacca tacgctcaat cgcttggata atgccacgat aaatagtgtt 1260aataccgcac tgaacttgcg tatcaagcct gatgaattt 1299<210>6<211>433<212>PRT<213>粘膜炎莫拉氏菌<400> 6Glu Leu Lys Leu Ala Asp Asp Ser Ile Ile Asp Ser Ile Asn Gln Leu1 5 10 15Gly Glu Leu Thr Val Asn Ile Pro Asn Thr Gln Tyr Phe Gln Thr Asn20 25 30Asn Gly Val Ser Val Ala Phe Thr Pro Leu His Glu Leu Pro Ile Val35 40 45
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<223>引物<400>29accattcaaa agagatcttg gcccaaagtc aagaatctg 39<210>30<211>33<212>DNA<213>人工<220>
<223>引物<400>30gttagaccga gtcgactcat tgaacatcag gca3权利要求
1.包含选自下列多核苷酸的分离的多核苷酸(a)编码与第二种多肽具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列；(b)编码与第二种多肽具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列；(c)编码与第二种多肽具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列；(d)编码包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物序列的多肽的多核苷酸；(e)编码能够产生对包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物序列的多肽具有结合特异性的抗体的多肽的多核苷酸；(f)编码多肽带有表位的部分的多核苷酸，该多肽包含选自SEQID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列；(g)包含选自SEQ ID No1、3、5、7、9、11、13或其片段或类似物的序列的多核苷酸；(h)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
2.包含选自下列多核苷酸的分离的多核苷酸(a)编码与第二种多肽具有至少70％同一性的多肽的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列；(b)编码与第二种多肽具有至少80％同一性的多肽的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列；(c)编码与第二种多肽具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸，该第二种多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列；(d)编码包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的多肽的多核苷酸；(e)编码能够产生对包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的多肽具有结合特异性的抗体的多肽的多核苷酸；(f)编码多肽带有表位的部分的多核苷酸，该多肽包含选自SEQID No2、4、6、8、10、12、14的序列；(g)包含选自SEQ ID No1、3、5、7、9、11、13的序列的多核苷酸；(h)与(a)、(b)、(c)、(d)、(e)、(f)或(g)中的多核苷酸互补的多核苷酸。
3.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。
4.权利要求2的多核苷酸，其中所述多核苷酸是DNA。
5.权利要求1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。
6.权利要求2的多核苷酸，其中所述多核苷酸是RNA。
7.分离的多核苷酸，其在严谨条件下与(a)编码多肽的DNA序列或(b)编码多肽的DNA序列的互补序列杂交；其中所述多肽包含选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列。
8.权利要求1的多核苷酸，其在严谨条件下与(a)编码多肽的DNA序列或(b)编码多肽的DNA序列的互补序列杂交；其中所述多肽包含选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列。
9.权利要求2的多核苷酸，其在严谨条件下与(a)编码多肽的DNA序列或(b)编码多肽的DNA序列的互补序列杂交；其中所述多肽包含选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14的序列。
10.权利要求1的多核苷酸，其在严谨条件下与(a)编码多肽的DNA序列或(b)编码多肽的DNA序列的互补序列杂交；其中所述多肽包含来自包含选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列的多肽的至少10个连续氨基酸残基。
11.权利要求2的多核苷酸，其在严谨条件下与(a)编码多肽的DNA序列或(b)编码多肽的DNA序列的互补序列杂交；其中所述多肽包含来自包含选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14的序列的多肽的至少10个连续氨基酸残基。
12.包含权利要求1的多核苷酸的载体，其中所述DNA与表达控制区有效连接。
13.包含权利要求2的多核苷酸的载体，其中所述DNA与表达控制区有效连接。
14.利用权利要求12的载体转染的宿主细胞。
15.利用权利要求13的载体转染的宿主细胞。
16.产生多肽的方法，其包含在适于表达所述多肽的条件下培养权利要求14的宿主细胞。
17.产生多肽的方法，其包含在适于表达所述多肽的条件下培养权利要求15的宿主细胞。
18.包含选自下列多肽的分离的多肽(a)与第二种多肽具有至少70％同一性的多肽，该第二种多肽具有包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列的氨基酸序列；(b)与第二种多肽具有至少80％同一性的多肽，该第二种多肽具有包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列的氨基酸序列；(c)与第二种多肽具有至少95％同一性的多肽，该第二种多肽具有包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列的氨基酸序列；(d)包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列的多肽；(e)能够产生对包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物序列的多肽具有结合特异性的抗体的多肽；(f)多肽带有表位的部分，该多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列；(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除N端甲硫氨酸残基；(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除分泌氨基酸序列。
19.包含选自下列多肽的分离的多肽(a)与第二种多肽具有至少70％同一性的多肽，该第二种多肽具有包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的氨基酸序列；(b)与第二种多肽具有至少80％同一性的多肽，该第二种多肽具有包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的氨基酸序列；(c)与第二种多肽具有至少95％同一性的多肽，该第二种多肽具有包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的氨基酸序列；(d)包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的多肽；(e)能够产生对包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列的多肽具有结合特异性的抗体的多肽；(f)多肽带有表位的部分，该多肽包含选自SEQ ID No2、4、6、8、10、12、14的序列；(g)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除N端甲硫氨酸残基；(h)(a)、(b)、(c)、(d)、(e)或(f)中的多肽，其中去除分泌氨基酸序列。
20.包含两种或多种具有选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12、14或其片段或类似物的序列的多肽的嵌合多肽；只要将所述多肽连接成嵌合多肽。
21.包含两种或多种具有选自SEQ ID NO2、4、6、8、10、12或14的序列的多肽的嵌合多肽；只要将所述多肽连接成嵌合多肽。
22.药物组合物，其包含权利要求18-21任一项的多肽以及药物可接受载体、稀释剂或佐剂。
23.预防性或治疗性治疗易受莫拉氏菌感染宿主的莫拉氏菌感染的方法，其包含给予所述宿主预防或治疗量的权利要求22的组合物。
24.权利要求23的方法，其中所述宿主是新生儿、婴儿或儿童。
25.权利要求23的方法，其中所述宿主是无免疫应答的宿主。
26.权利要求23的方法，其中所述宿主是成年人。
27.治疗性或预防性治疗中耳炎、窦炎、持续性咳嗽、急性喉炎、化脓性角膜炎、新生儿结膜炎和侵袭性疾病的方法，其包含给予所述宿主治疗或预防量的权利要求22的组合物。
28.诊断易受莫拉氏菌感染宿主的莫拉氏菌感染的方法，其包含(a)从宿主获得生物样品；(b)将该生物样品与对权利要求18-21任一项的多肽具有反应性的抗体或其片段温育，以形成混合物；(c)在混合物中检测表明存在莫拉氏菌的特异性结合的抗体或片段。
29.在包含或怀疑包含莫拉氏菌抗原的特异性抗体的生物样品中检测所述抗体的方法，其包含(a)从宿主获得生物样品；(b)将该生物样品与权利要求18-21任一项的一种或多种多肽或其片段温育，以形成混合物；(c)在混合物中检测表明存在莫拉氏菌的特异性抗体的特异性结合的抗原或片段。
30.权利要求22的药物组合物用于制备预防性或治疗性治疗莫拉氏菌感染的药物中的用途。
31.试剂盒，其包含权利要求18-21任一项的多肽，用于检测或诊断莫拉氏菌感染。
全文摘要
本发明涉及可用于预防、诊断和/或治疗目的的粘膜炎莫拉氏菌(布兰汉氏菌属)多肽。
文档编号A61K39/00GK1514879SQ02811689
公开日2004年7月21日 申请日期2002年5月15日 优先权日2001年5月15日
发明者D·马丁, J·哈迈尔, B·R·布罗德尔, S·里奥克斯, J·库图里, D 马丁, 布罗德尔, 祭, 醵, 驴怂 申请人:希雷生物化学有限公司