Cd23拮抗剂用于治疗肿瘤性疾病的用途的利记博彩app

专利名称：Cd23拮抗剂用于治疗肿瘤性疾病的用途的利记博彩app
技术领域：
在较宽的方面，本发明涉及CD23拮抗剂用于治疗肿瘤性疾病的用途。在优选的实施方案中，本发明提供了抗CD23抗体用于对恶性肿瘤包括B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)的免疫治疗的用途。
背景技术：
相当多种恶性肿瘤的患者已获益于在过去数十年间癌症治疗的进展。但不幸的是，尽管现代的疗法大大增加了消退率并延长了存活时间，大多数患者最终仍死于其疾病。对获得更好结果的障碍包括肿瘤细胞耐药和现有治疗不可接受的毒性(例如骨髓毒性)，其限制了最佳的细胞毒性剂量，并经常使得现有治疗不能用于无免疫应答的、衰弱的或年长的患者。当试图顾及先前接受过治疗或复发的患者时，这些限制尤为明显。因此，开发毒性更低但更为有效的靶向治疗仍是一个挑战。
增加这种治疗的有效性的一种尝试包括使用治疗性抗体，以降低不希望的交叉反应性并增加一种或多种细胞毒性剂在肿瘤细胞的局部定位。募集抗体以用于治疗肿瘤性疾病的想法可追溯到至少1953年，当时显示抗体可用于特异性瞄准肿瘤细胞。然而，正是Kohler和Milstein在杂交瘤技术上的开拓性工作使得可以持续供应特异性靶向于确定抗原的单克隆抗体。至1979年，单克隆抗体(MAb)已被用于在人类患者中治疗恶性疾病。近来，两种非缀合的单克隆抗体Rituxan和Herceptin已被批准分别用于治疗非霍奇金淋巴瘤和乳腺癌。目前，有多种与细胞毒性剂(例如放射性同位素或蛋白毒素)缀合的单克隆抗体处于临床试验之中，涉及治疗多种恶性疾病。在过去的十年内，已开发了多种肿瘤特异性抗体和抗体片段，以及将抗体与药物、毒素、放射性核素或其它物质缀合并将缀合物施用于患者的方法。这些努力已获得了很大的进展，但多种很大程度上未预料到的问题限制了至今为止开发的试剂中某些的诊断和治疗应用。
例如，最为棘手的问题之一是由人免疫系统本身引起的。在许多情况下，患者的免疫系统对作为外来抗原的靶向缀合物或治疗抗体起反应。这一点可以由以下事实证明用与小鼠单克隆抗体(这已成为最常用于人的靶向抗体)复合的药物或放射性核素治疗的患者会产生循环的人抗小鼠抗体(HAMA)和针对缀合物的抗体部分的全身性速发III型超敏反应。而且，即使不良副作用极小(例如在单一给药时)，循环的HAMA会降低靶向药剂在患者体内的有效浓度，由此限制诊断剂或治疗剂到达靶部位。
定向免疫治疗的一组特别有吸引力的靶标是血液系统恶性肿瘤。血液系统恶性肿瘤包括淋巴瘤和白血病，比起其它类型的肿瘤，其在许多情况下更易受血液中携带的化疗剂如单克隆抗体的影响。尽管Rituxan已显示出在治疗一部分这些类型恶性肿瘤(特别是非霍奇金淋巴瘤)中有效，仍有多种血液系统恶性肿瘤并无普遍接受的有效治疗。在这些恶性肿瘤中就有慢性淋巴细胞白血病。
慢性淋巴细胞白血病(CLL或B-CLL)主要是较年长人的疾病，在50岁后其发病率开始增加，至接近70岁时达到峰值。该疾病通常包括肿瘤性外周血淋巴细胞的增殖。在美国，据估计在1998年，有7300新CLL病例被诊断出来，4900名患者死于该疾病，占西方国家中白血病的30％(Young和Percy等，1981 NIH Monograph 57，Cancer Factsand Figures，1988，American Cancer Society Publication，Atlanta GA)。对CLL的临床发现包括淋巴细胞增多、淋巴结病、脾大、贫血和血小板减少。CLL的一个特征是单克隆B细胞增殖和停滞在分化中间状态的B淋巴细胞的积聚(Dighiero和Travade等，1991，Blood，781901Gale和Foon.1985.Ann.Intern.Med.103101)。这种B细胞表达表面IgM(sIgM)或sIgM和sIgD两者，和单一轻链，其密度低于正常B细胞上的密度。CLL B细胞还展示出几种人白细胞抗原，包括CD5，CD19，CD20，CD21，CD23，CD38和CD64(Foon和Todd.1986.Blood 11)。尽管抗CD20抗体Rituxan的使用已获得了某些成功，对CLL患者的分析显示CD20抗原在CLL B细胞上的密度高度可变，某些患者的B细胞表达非常低水平的CD20抗原。相反地，发现CD23表达在B-CLL中始终以较高水平存在。
CD23白细胞分化抗原是一种在几种造血系细胞上表达的45kD的II型跨膜糖蛋白，其功能为IgE的低亲和性受体(FcγRII)(Spiegelberg，1984.Adv.Immunol.3561；Kikutahi和Suemura等1986.J.Exp.Med 1641455；Delespesse和Suter等1991.Adv.Immunol.49149；Delespesse和Sarfati等1992.Immunol.Rev.12577)。它是C型凝集素家族的成员，在胞外凝集素结合区与跨膜区之间含有α螺旋卷曲螺旋茎。该茎结构据信有助于膜结合的CD23在与其配体(例如IgE)结合期间寡聚为三聚体。经蛋白水解，膜结合的CD23产生几个可溶性CD23(sCD23)分子量种类(37kD，29kD和16kD)。已在一系列临床病症中发现低血清浓度(≤5ng/ml)的循环sCD23，包括CLL、类风湿性关节炎和过敏。在CLL中，sCD23的血清水平与肿瘤负荷相关联，并因而与疾病的临床阶段相关(Sarfati和Bron等1988.Blood 7194)。sCD23，特别是25kD种类，已显示a)在某些Epstein-Barr病毒转化的成熟B细胞系中作为自分泌因子，b)作为前胸腺细胞的分化因子，以及c)防止生发中心B细胞的凋亡(编程性细胞死亡)，可能通过诱导bcl-2表达。
除了Rituxan之外，对B细胞恶性肿瘤的典型治疗为施用放疗和化疗剂。对于CLL，常规的外照射治疗将用于破坏恶性细胞。但是，副作用是该治疗中的限制因素。另一种广泛使用的对血液系统恶性肿瘤的治疗是化疗。联合化疗在实现部分或完全缓解中取得了一些成功。不幸的是，这些通过化疗获得的缓解通常并不持久。
因此，本发明的一个目的是提供可用于靶向肿瘤细胞的低毒性化合物和方法。
本发明的另一个目的是提供可有效用于在有需要的患者中治疗肿瘤性疾病特别是慢性淋巴细胞白血病的化合物和方法。
发明概述本发明实现了这些目的和其它目的，其在广义上涉及可用于肿瘤性疾病的治疗之中的方法、产品、化合物和组合物。为此，本发明提供了可用于治疗患有多种癌症的患者的CD23拮抗剂。由此本发明一方面提供了在有需要的哺乳动物中治疗肿瘤性疾病的方法，包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的CD23拮抗剂。如以下将要更详细讨论的，CD23拮抗剂可包括任何配体、多肽、肽、抗体或小分子，其与在B细胞上表达的CD23抗原相互作用、结合或缔合，并且消除、减少、抑制或控制肿瘤细胞的生长。在优选的实施方案中，本发明的CD23拮抗剂将包括抗CD23抗体，如IDEC-152。在这方面，已意外地发现这种拮抗剂可用于在肿瘤细胞中诱导凋亡。因此，本发明的另一方面包括在恶性细胞中诱导凋亡的方法，包括使所述恶性细胞与凋亡诱导量的CD23拮抗剂相接触。此外，如以下具体讨论的，CD23拮抗剂可以以非缀合状态或与细胞毒性剂如放射性同位素缀合的形式使用。
尽管CD23拮抗剂本身是有效的抗肿瘤剂，它们还可以与多种化疗剂相结合协同使用。由此，本发明的另一方面包括治疗哺乳动物的肿瘤性疾病的方法，包括以下步骤向所述哺乳动物施用治疗有效量的至少一种化疗剂；和向所述患者施用治疗有效量的至少一种CD23拮抗剂，其中所述化疗剂和所述CD23拮抗剂可以以任何次序或同时施用。
虽然，CD23拮抗剂可以与多种化疗剂相结合使用，本发明优选的实施方案包括使用所选择的CD23拮抗剂与抗CD20抗体Rituxan。对此，本发明的另一方面包括治疗哺乳动物中的肿瘤性疾病的方法，其包括以下步骤
向所述哺乳动物施用治疗有效量的Rituxan；和向所述哺乳动物施用治疗有效量的IDEC-152，其中所述Rituxan和所述IDEC-152可以以任何次序或同时施用。
更通常地，本发明的拮抗剂可以有利地与抗体联合使用用于治疗肿瘤性疾病，所述抗体与恶性肿瘤相关抗原发生反应或结合。这些包括但不限于CD19，CD20，CD22，CD40，CD40L，CD52和B7抗原。
本领域技术人员将理解本发明可用于治疗多种CD23+恶性肿瘤中的任何一种。本文所用的CD23+恶性肿瘤是其中肿瘤细胞表达CD23抗原或与其相关的任何肿瘤。可依据本发明治疗的CD23+肿瘤的实例包括复发性霍奇金病；耐药的霍奇金病；高分级、低分级和中间级的非霍奇金淋巴瘤；B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)；浆细胞样淋巴细胞性(lymhoplasmacytoid)淋巴瘤(LPL)；套细胞淋巴瘤(MCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)；弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)；伯基特淋巴瘤(BL)；AIDS相关性淋巴瘤；单核细胞性B细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞淋巴结病；小淋巴细胞、滤泡性弥漫性大细胞、弥漫性小分裂细胞、大细胞免疫母细胞成淋巴细胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、滤泡性大细胞为主、滤泡性小分裂细胞为主和滤泡性小分裂细胞和大细胞混合的淋巴瘤。其它可用本发明的组合物治疗的肿瘤包括T细胞淋巴瘤、急性T细胞白血病和肥大细胞瘤。
尽管本发明的方法可用于治疗多种CD23+恶性肿瘤，已意外发现它们在治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)中特别有效。由此，本发明的一个重要方面包括在有需要的哺乳动物中治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)的方法，包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的CD23拮抗剂。
本发明的另一显著方面包括产品如药盒，其中装有所公开的CD23拮抗剂。在此方面，本发明包括可用于治疗患有或易患肿瘤性疾病的哺乳动物的药盒，包含至少一个容器，其中存放有CD23拮抗剂，和标签或插页，指示所述CD23拮抗剂可用于治疗所述肿瘤性疾病。
考虑以下对本发明优选示例性实施方案的详细描述，本发明的其它目的、特征和优点对于本领域技术人员而言将显而易见。


图1图示Rituxan和CD23拮抗剂与淋巴细胞以浓度依赖性方式的特异性结合。
图2图示CD23拮抗剂和Rituxan对淋巴瘤细胞的抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)活性。
图3A和3B分别显示低浓度拮抗剂和高浓度拮抗剂条件下，CD23拮抗剂与Rituxan的组合对ADCC介导的对肿瘤细胞的体外杀伤的作用。
图4A和4B分别显示CD23拮抗剂，单独和与Rituxan一起，在淋巴瘤细胞中诱导凋亡。
图5例示CD23拮抗剂和Rituxan与抗人IgG特异性二抗交联在淋巴瘤细胞中诱导凋亡。
图6A和图6B分别例示在与抗人IgG特异性抗体交联之后，CD23拮抗剂和Rituxan及其组合在SKW淋巴瘤细胞中诱导凋亡。
图7显示不同浓度的CD23拮抗剂和Rituxan及其组合在淋巴瘤细胞中诱导凋亡。
图8图示CD23拮抗剂与阿霉素的组合在淋巴瘤细胞中协同诱导凋亡。
图9显示CD23拮抗剂与氟达拉滨的组合在淋巴瘤细胞中协同诱导凋亡。
图10A和图1 0B分别例示CD23拮抗剂单独在CLL细胞中诱导凋亡，以及不同浓度的CD23拮抗剂和Rituxan及其组合在CLL细胞中诱导凋亡。
图11显示CD23拮抗剂与氟达拉滨的组合在CLL细胞中诱导凋亡。
图12显示CD23拮抗剂作为单一药剂在淋巴瘤/SCID小鼠模型中的抗肿瘤活性。
图13图示CD23拮抗剂与Rituxan相组合在淋巴瘤/SCID小鼠模型中的抗肿瘤活性。
发明详述尽管本发明可以以许多不同的形式实施，本文公开的是其具体的示例性实施方案，其例示本发明的原理。应该强调本发明并不限于所例举的具体实施方案。
如上所述，本发明涉及CD23拮抗剂用于治疗和或预防多种CD23+恶性肿瘤中的任何一种的用途。所公开的拮抗剂可单独使用或与多种化疗剂联合使用。在此方面，已意外地发现本发明的拮抗剂当与Rituxan联合使用时特别有效。还已意外发现本发明的CD23拮抗剂在治疗慢性淋巴细胞白血病中特别有效。此外，尽管不旨在以任何方式限制本发明的范围，还已发现在此所公开的CD23拮抗剂可在肿瘤细胞中有效诱导凋亡。CD23拮抗剂这一在此之前未知的特性可根据本文的教导进行开发以提供治疗有效组合物。
根据本发明，CD23拮抗剂可包括任何与在B细胞上表达的CD23抗原反应、互相作用、结合或缔合并消除、减少、抑制或控制肿瘤细胞生长的配体、多肽、肽、抗体或小分子。如本领域中已知的，CD23指由B细胞和其它细胞表达的IgE的低亲和性受体。更具体地说，CD23拮抗剂是这样一种分子，其与CD23细胞表面标记结合后破坏或耗尽哺乳动物中的CD23+细胞和/或干扰一种或多种细胞功能，例如通过降低或阻止由该细胞引发的体液应答。
所述拮抗剂优选能耗尽其所治疗的哺乳动物中的B细胞(即降低循环B细胞水平)。这种耗尽可以通过多种机制来实现，如抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)、凋亡和/或补体依赖性细胞毒性(CDC)、抑制B细胞增殖和/或诱导B细胞死亡(例如通过凋亡)。包括在本发明范围之内的拮抗剂包括抗体、合成或天然序列肽和多肽、配体和小分子拮抗剂，其结合CD23细胞标记，任选地与细胞毒性剂缀合或融合。
在本发明范围内，特别优选的CD23拮抗剂是IDEC-152(IDECPharmaceuticals，San Diego，California)。IDEC-152是一种针对CD23抗原的灵长类动物源化单克隆抗CD23抗体(本文也称为p5E8)，其已被开发用于多种不同的适应症(Nakumura和Kloetzer等.2000.22131)。单克隆抗体p5E8源自5E8(来自猕猴的分泌抗人CD23抗体的灵长类动物杂交瘤)，并使用专利载体技术在CHO细胞中被分子克隆及表达为10kDa IgG单体。单克隆p5E8保持了5E8灵长类动物可变区，与人γ1重链和人K轻链恒定区偶联。其还保留了C1q结合。IDEC-152的序列和由来以及其它潜在的拮抗剂公开于共有的U.S.P.N.6,011,138中，该专利以其整体引入本文作为参考。
本领域技术人员将理解，本发明的化合物、组合物和方法可用于治疗任何呈现CD23的肿瘤性疾病、肿瘤或恶性肿瘤(CD23+恶性肿瘤)。如以上所讨论的，本发明的拮抗剂具有与CD23的免疫反应性。在拮抗剂为抗体的优选实施方案中，可以使用通常的基因工程技术得到它们，其中一个或多个恒定区结构域的至少一部分被缺失、替换或改变，以提供所需要的生物化学特性，如免疫原性降低。还将理解拮抗性抗体或其免疫反应性片段可以使用确立的方案以临床或商业规模表达和制备。
对于某些实施方案，可能希望仅使用拮抗性抗体的抗原结合区(例如可变区或互补决定区)并将其与经修饰的恒定区相结合以产生所需的特性。可以以类似的方式生成相容的单链构建体。在任何情况下，将理解本发明的抗体还可被改造以提高亲和性或降低免疫原性，这在本领域中是普遍的常规做法。例如，适合本发明的CD23抗体可以衍生自或构造自经人源化或嵌合的抗体。由此，符合本发明的抗体可以衍生自和/或包含天然存在的小鼠、灵长类动物(包括人)或其它哺乳动物单克隆抗体、嵌合抗体、人源化抗体、灵长类动物源化抗体、双特异性抗体或单链抗体构建体以及每种类型的免疫反应性片段。
在此术语“抗体”使用其最广义，并具体包括完整的单克隆抗体、多克隆抗体、从至少两种完整的抗体形成的多特异性抗体(例如双特异性抗体)和抗体片段，只要它们表现出所需要的生物学活性即可。
“抗体片段”包括完整抗体的一部分，优选包括其抗原结合区或可变区。抗体片段的实例包括Fab、Fab’、F(ab’)2和Fv片段；diabodies；线状抗体；单链抗体分子；和从抗体片段形成的多特异性抗体。结构域缺失的抗体包括其中一个或多个恒定区的至少部分被改变或缺失以提供改进的生理特性(例如缩短的血清半衰期)的免疫球蛋白，也可被考虑为用于本文公开内容目的的抗体片段。在优选的实施方案中，结构域缺失的抗体将包含缺乏CH2结构域的恒定区。
“诱导凋亡”的拮抗剂诱导例如B细胞的编程性细胞死亡，如由膜联蛋白V结合、DNA断裂、细胞皱缩、内质网扩张、细胞破碎和/或形成膜囊泡(称为凋亡小体)所确定。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”指一种细胞介导的反应，其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如天然杀伤(NK)细胞、中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上结合的抗体，随后引起靶细胞溶解。介导ADCC的主要细胞-NK细胞仅表达FcyRIII，而单核细胞表达FcyRI、FcyRII和FcyRIII。在造血细胞上的FcR表达总结于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol.9457-92(1991)第464页的表3。为了评价感兴趣分子的ADCC活性，可以进行体外ADCC测定，如在美国专利No.5,500,362或5,821,337中描述的测定。对这种测定有用的效应细胞包括外周血单核的细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。可供选择地，或额外地，可以在体内评价感兴趣分子的ADCC活性，例如在动物模型中，如在Clynes等，PNAS(USA)95652-656(1998)中公开的动物模型。
如先前所述，本发明特别优选的实施方案采用CD23拮抗剂，其包含抗CD23的抗体如IDEC-152。尽管现存的抗体可用于本发明，可以开发适合所公开方法的新抗体。使用本领域认可的方案，优选在哺乳动物中产生抗体，通过多次皮下或腹膜内注射相关抗原(例如纯化的肿瘤相关抗原或包含这种抗原的细胞或细胞提取物)和佐剂。这种免疫通常引发免疫应答，其包括从活化的脾细胞或淋巴细胞产生抗原反应性抗体。尽管所得的抗体可以从动物的血清中收获以提供多克隆制剂，通常希望从脾、淋巴结或外周血分离单个的淋巴细胞，以提供单克隆抗体(MAb)的均一制备物。优选从脾得到淋巴细胞。
在该广为人知的方法(Kohler等，Nature，256495(1975))中，来自已注射抗原的哺乳动物的相对短命或会死的淋巴细胞与永生的肿瘤细胞系(例如骨髓瘤细胞系)融合，从而产生杂交细胞或“杂交瘤”，所述杂交细胞或“杂交瘤”可无限增殖并且能产生B细胞遗传编码的抗体。将所得的杂交体通过选择、稀释和重生长分离为单一的遗传品系，各品系包含用于形成单一抗体的特定基因。它们因而可产生同质针对目的抗原的抗体，并鉴于其纯遗传家系而被称为“单克隆”。
将如此制备的杂交瘤细胞接种并生长于合适的培养基中，所述培养基优选含有一种或多种抑制未融合的亲本骨髓瘤细胞生长或存活的物质。本领域技术人员将理解用于形成、选择和培养杂交瘤的试剂、细胞系和培养基可从多种商业来源购得，并且标准化的方案已很好确立。通常测定杂交瘤细胞生长于其中的培养基中针对目的抗原的单克隆抗体的产生情况。优选由杂交瘤细胞产生的单克隆抗体的结合特异性通过免疫沉淀印迹或通过体外测定如放射免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA)来确定。在鉴定了产生具有所需特异性、亲和性和/或活性的抗体的杂交瘤细胞之后，所述克隆可以通过有限稀释操作进行亚克隆并通过标准方法培养(Goding，Monoclonal AntibodiesPrinciples and Practice，pp.59-103(Academic Press，1986))。还将理解可通过常规的纯化操作例如蛋白-A、羟磷灰石层析、凝胶电泳、透析或亲和层析，从培养基、腹水或血清中分离由亚克隆所分泌的单克隆抗体。
在其它合适的实施方案中，可使用常规操作容易地分离编码所需单克隆抗体的DNA并对其进行测序(例如，通过使用能特异性结合编码小鼠抗体重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)。分离的和亚克隆的杂交瘤细胞作为这种DNA的优选来源。一旦被分离之后，可以将DNA置入表达载体中，然后将其转染入原核或真核宿主细胞如大肠杆菌细胞、猿猴COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞或骨髓瘤细胞，其原本不产生免疫球蛋白。更具体地说，分离的DNA(其可如本文所述进行修饰)可用于克隆恒定区和可变区序列，以制备抗体，如以下文献所述Newman等，美国顺序号No.379,072(1995年1月25日提交，引入本文作为参考)。基本上，这必需包括从所选择的细胞中提取RNA，转化为cDNA，并使用Ig特异性引物通过PCR对其进行扩增。合适的引物在美国专利No.5,658,570(也引入本文作为参考)中有所记载。如以下将要更详细讨论的，表达所需抗体的转化细胞可以以相对大量进行培养，以提供临床和商业供应的免疫球蛋白。
本领域技术人员还将理解，还可以从例如在EP 368 684 B1和U.S.P.N.5,969,108(各引入本文作为参考)中所述的抗体噬菌体文库得到编码抗体或抗体片段的DNA。几种公开出版物(例如Marks等.Bio/Technology 10779-783(1992))已描述了高亲和性人抗体的制备，通过链改组，以及组合感染和体内重组作为策略构建大的噬菌体文库。这类操作提供了传统杂交瘤技术的可行备选方案，用于分离及随后克隆单克隆抗体，并同样清楚地落在本发明范围内。
本发明的其它实施方案包括在不能内源性产生免疫球蛋白的转基因动物(例如小鼠)中生成实质上地人抗体(参见例如美国专利No.6,075,181、5,939,598、5,591,669和5,589,369，各引入本文作为参考)。例如，已描述了在嵌合和种系突变小鼠中纯合缺失抗体重链连接区导致完全抑制内源性抗体产生。在这种种系突变小鼠中转入人免疫球蛋白基因阵列会导致经抗原攻击而产生人抗体。使用SCID小鼠生成人抗体的另一种优选方式公开于共有的同时待审的美国专利No.5,811,524，其引入本文作为参考。将理解与这些人抗体相关的遗传物质也可如本文所述进行分离和操作。
另一种高效生成重组抗体的方式由Newman，Biotechnology，101455-1460(1992)公开。具体地说，该技术导致生成包含猴可变区和人恒定序列的灵长类动物源化抗体。该参考文献以其整体引入本文作为参考。此外，该技术还记载于以下文献普通转让的美国专利No.5,658,570、5,693,780和5,756,096，各引入本文作为参考。本发明的一个优选实施方案IDEC-152是使用基本上如以上文献中所述的技术生成的。
由本说明书可知，用于产生本发明CD23拮抗剂的抗体衍生物的基因序列可以获自多种不同的来源。例如，如以上深入讨论的，可得到多种人抗体基因，为公众可以得到的保藏物形式。已经公开了许多抗体序列和抗体编码基因，合适的抗体基因可以从这些序列合成，如先前所述。或者，可以使用本领域技术人员熟知的技术选择并培养产生抗体的细胞系。这些技术记载于多种实验室手册和主要出版物中。在这方面，适用于如下所述本发明中的技术记载于Current Protocolsin Immunology，Coligan等.Eds.Green Publishing Associates andWiley-Interscience，John Wiley and Sons.New York(1991)，其整体引入本文作为参考，包括增补。
还将理解本发明的范围还包括本文所述DNA序列的所有等位基因、变异体和突变。
正如广为人知的，可以通过标准技术从原始的杂交瘤细胞或从其它转化细胞中分离RNA，如异硫氰酸胍提取和沉淀，然后离心或层析。如果需要，可通过标准技术从总RNA分离mRNA，如在寡脱氧胸苷酸纤维素上层析。适用于这些目的的技术在本领域中是人们所熟悉的，并在前述参考文献中描述。
可以同时或分别制备编码抗体的轻链和重链的cDNA，按照熟知的方法使用逆转录酶和DNA聚合酶。其可通过共有恒定区引物或通过更为特异性的引物来启动，所述引物基于已公开的重链和轻链DNA及氨基酸序列。如上所讨论的，PCR也可用于分离编码抗体轻链和重链的DNA克隆。在此情况下，可用共有引物或更大的同源探针筛选文库，如小鼠恒定区探针。
DNA，通常是质粒DNA，可以分离自如在此所述的细胞，作限制酶切图谱并测序，按照在前述有关重组DNA技术的参考文献中详细描述的标准熟知技术。当然，可以根据本发明在分离过程或随后分析过程中的任何一点对DNA进行修饰。
优选的抗体序列公开于此。适于本发明此方面的寡核苷酸合成技术是本领域技术人员所熟知的，并可以利用几种可购得的自动化合成仪中的任何一种来进行。此外，可以通过商业DNA合成商的服务获得编码在此所述的几种类型重链和轻链的DNA序列。使用任何前述方法获得的遗传物质可以随后进行改变或修饰，以提供合适本发明的抗体。
尽管根据本发明可以获得并修饰多种不同类型的抗体，本发明的经修饰抗体将具有多种共性。为此，术语“抗体”应理解为指一种四聚体或其聚集物，无论其是否具有任何相关的特异性免疫反应性。“抗体”指这样的装配体，其具有显著的已知的对抗原(例如肿瘤相关抗原)的特异性免疫反应活性，包含轻链和重链，它们之间有或无共价键合。抗体可以经修饰以提供有益的生理学特性。根据本发明术语“经修饰的抗体”要理解为指抗体或其免疫反应性片段或重组体，其中一个或多个恒定区结构域的至少一部分缺失或被改变，以提供所需的生化特征，如与具有大约相同免疫原性的完整的未改变的抗体相比，其肿瘤局部定位增加或血清半衰期缩短。对于本申请的目的而言，可以将具有改变的或省略的恒定区结构域的免疫反应性单链抗体构建体认为是经修饰的抗体。
脊椎动物系统中的基本免疫球蛋白结构已相对清楚了解。如将要在以下更详细讨论的，总称“免疫球蛋白”包括5个不同类别抗体，其可在生化上区别开来。尽管所有5类均明显在本发明范围之内，以下讨论将通常针对IgG分子类别。对于IgG，免疫球蛋白包含2条相同的分子量约23,000道尔顿的轻多肽链，和2条相同的分子量53,000-70,000的重链。4条链通过二硫键以“Y”构型连接在一起，其中在“Y”口处开始轻链将重链括在内，并持续通过可变区。
更具体地说，轻链和重链均可分为结构和功能同源性区域。术语“恒定”和“可变”是功能性用语。在这方面，将理解轻链(VL)和重链(VH)的可变区均决定抗原识别和特异性。相反地，轻链(CL)和重链(CH1，CH2或CH3)的恒定区则赋予重要的生物学属性，如分泌、跨胎盘移动性、Fc受体结合、补体结合等。根据约定，恒定区结构域的编号随着它们远离抗体的抗原结合部位或氨基末端而增加。由此，CH3和CL结构域实际上分别构成重链和轻链的羧基末端。
轻链分为kappa或lambda(κ，λ)。每个重链类别可与κ或λ轻链相结合。一般来说，当由杂交瘤、B细胞或基因工程宿主细胞生成免疫球蛋白时，轻链和重链彼此共价键合，而两条重链的“尾”部分通过共价二硫键彼此键合。但是，如果链的非共价结合可以以正确的几何构型实现，则非二硫键连接的链的聚集物仍能与抗原反应。在重链中，氨基酸序列从Y构型叉状端的N末端到在每条链底部的C末端。在N末端为可变区，而在C末端是恒定区。本领域技术人员将理解重链分为gamma，mu，alpha，delta或epsilon(γ，μ，α，δ和ε)，它们之中有某些亚类。正是该链的性质决定了抗体的类别为IgA、IgD、IgE、IgG或IgM。免疫球蛋白亚类(同种型)例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1等已很好表征，并已知其赋予功能特化。这些类别和同种型中每一种的经修饰形式对于本领域技术人员而言依据本发明公开内容是容易辨别的，并相应地属于本发明范围内。
如上所述，可变区使得抗体选择性识别并特异性结合免疫反应性抗原上的表位。即，抗体的VL区和VH区联合形成可变区，其确定了三维的抗原结合部位。该四级抗体结构提供了存在于Y每条臂末端的抗原结合部位。更具体地说，抗原结合部位由每条VH和VL链上的3个互补决定区(CDR)来确定。
所述6个CDR是短的、非邻接的氨基酸序列，当抗体在含水环境种呈现其三维构型时，CDR特定的位置使得形成抗原结合部位。重链和轻链可变区的其余部分在氨基酸序列方面显示出较低的分子间可变性，并被称为构架区。构架区大部分采取β折叠构象，而CDR形成连接β折叠结构的袢，在某些情况下形成β-折叠结构的组成部分。由此，这些构架区作用于形成支架，其使6个CDR通过链间非共价相互作用以正确方向放置。在任何情况下，由放置的CDR形成的抗原结合部位定义与免疫反应性抗原上的表位的表面互补性。该互补性表面促进抗体与免疫反应性抗原表位的非共价结合。
对于本发明的目的而言，应理解所公开的抗CD23抗体可包含任何类型的可变区，其提供抗体与CD23标记的结合。在此方面，可变区可包括或来自于任何类型的哺乳动物，所述哺乳动物可被诱导发生体液应答并生成针对CD23的免疫球蛋白。这样，拮抗性抗体的可变区可以是例如人、小鼠、非人灵长类动物(例如猕猴，恒河猴等)或狼来源的。在优选的实施方案中，免疫球蛋白的可变区和恒定区均来自于人。在其它所选择的实施方案中，合适抗体的可变区(通常得自非人来源)可以被改造或特别制作以改善分子的结合特性或降低免疫原性。在此方面，用于本发明中的可变区可以人源化或通过包含输入的氨基酸序列而进行改变。
“人源化抗体”是指从非人抗体通常是小鼠抗体衍生的抗体，其保留了或基本上保留了亲本抗体的抗原结合特性，但在人类中免疫原性较低。这可以通过多种方法实现，包括(a)将整个非人可变区移植到人恒定区上以生成嵌合抗体；(b)将一个或多个非人互补决定区(CDR)的至少一部分移植入人构架区和恒定区，保留或不保留关键的构架残基；或(c)移植整个非人可变区，但通过替换表面残基而用人样部分“遮掩”它们。这种方法公开在以下文献中Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.816851-5(1984)；Morrison等，Adv.Immunol.4465-92(1988)；Verhoeyen等，Science 2391534-1536(1988)；Padlan，Molec.Immun.28489-498(1991)；和Padlan，Molec.Immun.31169-217(1994)，和美国专利No.5,585,089；5,693,761和5,693,762，上述文献均以其整体引入本文作为参考。
本领域技术人员将理解在以上选项(a)中所述的技术将产生“经典的”嵌合抗体。在本申请的上下文中，术语“嵌合抗体”将理解为是指任何抗体，其中免疫反应性区域或部位获自或衍生自第一物种，而恒定区(其可能是完整的，部分的或根据本发明经修饰的)获自第二物种。在优选的实施方案中，抗原结合区或部位将来自非人来源(例如灵长类动物或小鼠)，而恒定区为人。尽管可变区的免疫原特异性通常不受其来源影响，人恒定区比起来自非人来源的恒定区引发人类对象的免疫应答的可能性较小。
优选地，对重链和轻链的可变区均作改变，至少部分替换一个或多个CDR，如果需要，部分替换构架区和改变序列。虽然CDR可以得自与构架区所得自的抗体相同类别或甚至亚类的抗体，可以想到CDR将来自于不同类别的抗体，优选来自于不同物种的抗体。必须强调可能不必用来自供体可变区的完整CDR替换所有的CDR以将一个可变区的抗原结合能力转移到另一个，而可能仅必需转移那些对维持抗原结合部位的活性所必需的残基。给出在美国专利No.5,585,089；5,693,761和5,693,762中的解释，本领域的技术人员完全能够通过进行常规试验或通过反复尝试法来获得免疫原性降低的有功能抗体。
虽然对可变区进行改变，本领域技术人员将理解在优选的实施方案中，本发明的抗CD23抗体可包括抗体或其免疫反应性片段，其中一个或多个恒定区结构域的至少一部分缺失或被改变以提供所需的生化特性，如与包含天然或未改变的恒定区的具有大约相同免疫原性的抗体相比，其肿瘤局部定位增加或血清半衰期缩短。在所选择的实施方案中，这些类型抗CD23抗体的恒定区将包括人恒定区。适合本发明的恒定区的修饰包括一个或多个结构域中的一个或多个残基的添加、缺失或替换。即本文公开的抗CD23抗体可包含对3个重链恒定区(CH1，CH2或CH3)中的一个或多个和/或对轻链恒定区(CL)的改变或修饰。在特别优选的实施方案中，经修饰的抗体将包括结构域缺失的构建体或变异体，其中去除了整个CH2结构域(ΔCH2构建体)。
除了其构型之外，本领域已知恒定区介导几种效应功能。例如，补体的C1成分与抗体的结合活化补体系统。补体的活化在细胞病原体的调理和溶解中是重要的。补体的活化还刺激炎症反应，并可能参与自身免疫超敏反应。此外，抗体通过Fc区与细胞结合，抗体Fc区上的Fc受体位点与细胞上的Fc受体(FcR)结合。有多种Fc受体，其对于不同类别的抗体是特异性的，包括IgG(γ受体)，IgE(eta受体)，IgA(α受体)和IgM(μ受体)。抗体与细胞表面上的Fc受体的结合触发多种重要的和各异的生物反应，包括吞入并破坏抗体包被的颗粒，凋亡，清除免疫复合体，由杀伤细胞溶解抗体包被的靶细胞(称为抗体依赖性细胞介导的细胞毒性，或ADCC)，释放炎症介质，胎盘转移和控制免疫球蛋白产生。
在如上所述操作分离的遗传物质以提供CD23拮抗剂如抗体和反应性多肽之后，通常将核酸插入表达载体用于引入宿主细胞，所述宿主细胞可用于产生所需量的CD23拮抗剂。
对于本说明书和权利要求书的目的而言在此所用术语“载体”或“表达载体”是指根据本发明用作将目的核酸序列引入细胞并在其中表达的媒介物的载体。如本领域技术人员所了解的，这种载体可容易地选自质粒、噬菌体、病毒和逆转录病毒。总地来说，适合本发明的载体将包含选择标记，适宜的限制酶切位点以有助于目的基因的克隆，以及进入和/或在真核或原核细胞中复制的能力。
对于本发明的目的，可采用多种表达载体系统。例如一类载体利用来自动物病毒的DNA元件，所述动物病毒如牛乳头瘤病毒、多瘤病毒、腺病毒、痘病毒、杆状病毒、逆转录病毒(RSV，MMTV或MOMLV)或SV40病毒。另外，有DNA整合入其染色体的细胞可通过引入一个或多个标记来进行选择，所述标记使得可选择转染的宿主细胞。标记可为营养缺陷型宿主提供原养，提供杀虫剂抗性(例如抗生素)或对重金属如铜的抗体。可以将可选择标记基因直接连接到有待表达的DNA序列，或通过共转化引入相同的细胞。为最理想地合成mRNA，可能还需要额外的元件。这些元件可包括剪接信号，以及转录启动子，增强子和终止信号。
在针对抗CD23抗体的特别优选的实施方案中，将克隆的可变区基因与如以上讨论的重链和轻链恒定区基因(优选人)一起插入表达载体中。优选地，使用IDEC Pharmaceuticals，Inc.(San Diego，Califormia)称为NEOSPLA的专利表达载体来实现这一步骤。该载体含有巨细胞病毒启动子/增强子，小鼠β球蛋白主要启动子，SV40复制起点，牛生长激素聚腺苷酸化序列，新霉素磷酸转移酶外显子1和外显子2，二氢叶酸还原酶基因和前导序列。如在以下实施例中可见，已发现该载体经引入可变区和恒定区基因、转染入CHO细胞、然后在含G418的培养基中选择及氨甲蝶呤扩增后，会非常高水平地表达抗体。该载体系统实质上公开于普通转让的美国专利No.5,736,137和5,658,570，所述专利各以其整体引入本文作为参考。这一系统提供高表达水平，即＞30pg/细胞/天。使用类似的载体可表达反应性多肽拮抗剂。
更通常地，一旦制备了含反应性多肽或抗体的载体或DNA序列之后，可将表达载体引入适宜的宿主细胞。即，可以转化宿主细胞。将质粒引入宿主细胞可通过多种本领域技术人员熟知的技术完成。这些技术包括但不限于转染(包括电离子透入法和电穿孔)，原生质体融合，磷酸钙沉淀，细胞与包封的DNA融合，微注射和用完整的病毒感染。参见，Ridgway，A.A.G.“Mammalian Expression Vectors”24.2章，470-472页，Vectors，Rodriguez和Denhardt，Eds.(Butterworths，Boston，Mass.1988)。最优选地，通过电穿孔将质粒引入宿主。转化细胞在适宜产生轻链和重链的条件下生长，并测定重链和/或轻链蛋白合成情况。示例性的测定技术包括酶联免疫吸附测定(ELISA)，放射免疫测定(RIA)，或荧光激活的细胞分选分析(FACS)，免疫组化等。
本文所用的术语“转化”应使用其广义，指任何将DNA引入受体宿主细胞的过程，其改变基因型并因而导致受体细胞的改变。
同样地，“宿主细胞”指用载体转化的细胞，所述载体使用DNA重组技术构建并含有至少一个异源基因。如本文所定义的，由宿主细胞产生的抗体或其修饰实质上是通过该转化。在对从重组宿主分离抗体的过程的描述中，术语“细胞”和“细胞培养物”互换使用以表示抗体的来源，除非清楚指明不是这样。换句话说，从“细胞”回收抗体可指从旋转沉降下来的整个细胞，或从含有培养基和悬浮的细胞的细胞培养物。
用于蛋白表达的宿主细胞系最优选来源于哺乳动物；相信本领域技术人员能优先确定特定的宿主细胞系，其最适于目的基因产物在其中表达。示例性的宿主细胞系包括但不限于DG44和DUXB11(中国仓鼠卵巢细胞系，DHFR-)，HELA(人宫颈癌)，CVI(猴肾细胞系)，COS(带有SV40 T抗原的CVI衍生物)，R1610(中国仓鼠成纤维细胞)BALBC/3T3(小鼠成纤维细胞)，HAK(仓鼠肾细胞系)，SP2/0(小鼠骨髓瘤)，P3.times.63-Ag3.653(小鼠骨髓瘤)，BFA-1c1BPT(牛内皮细胞)，RAJI(人淋巴细胞)和293(人肾)。特别优选CHO细胞。宿主细胞系通常可从商业服务、美国组织培养物保藏中心或公开的文献得到。
在体外制备可使得规模增大以得到大量所需的CD23拮抗剂。在组织培养条件下培养哺乳动物细胞的技术在本领域中是已知的，包括均匀悬浮培养，例如在气升式反应器中或在连续搅拌反应器中；或固定的或截留的细胞培养，例如在中空纤维、微囊中，在琼脂糖微珠或陶瓷cartridge上。为分离CD23拮抗剂，首先浓缩在培养上清中表达的多肽，例如通过用硫酸铵沉淀，用吸湿材料如PEG透析，通过选择性膜过滤或诸如此类。如果需要和/或希望，浓缩的多肽可通过常规层析方法纯化，例如凝胶过滤，离子交换层析，经DEAE-纤维素层析或(免疫-)亲和层析。
所述反应性多肽基因还可以在非哺乳动物细胞如细菌或酵母中表达。在此方面，将理解多种单细胞非哺乳动物微生物如细菌也可被转化；即那些能在培养或发酵中生长的微生物。细菌易受转化，包括肠杆菌科的成员，如大肠杆菌；沙门氏菌；芽孢杆菌如枯草芽孢杆菌；肺炎球菌；链球菌和流感嗜血杆菌菌株。还将理解当在细菌中表达时，抗CD23免疫球蛋白重链和轻链通常成为包含体的组成部分。所述链然后必需进行分离、纯化并装配成为有功能的免疫球蛋白分子。
除原核生物外，也可以使用真核微生物。在真核微生物中最为常用的是酿酒酵母或普通的面包酵母，尽管多种其它菌株通常也可得到。对于在糖酵母中表达，常用例如质粒YRp7(Stinchcomb等，Nature，28239(1979)；Kingsman等，Gene，7141(1979)；Tschemper等，Gene，10157(1980))。该质粒已含有trpl基因，其提供对缺乏在色氨酸中生长能力的酵母突变株的选择标记，所述突变菌株如ATCC No.44076或PEP4-1(Jones，Genetics，8512(1977))。存在trpl损害作为所述酵母宿主细胞基因组的特征会提供有效的环境用以通过在缺乏色氨酸条件下生长检测转化。
不考虑如何获得临床上有用的量，本发明的CD23拮抗剂可以以多种缀合的(即免疫缀合物)或非缀合形式中的任何一种形式使用。具体地说，本发明的抗体可以与细胞毒素缀合或结合，所述细胞毒素如放射性同位素、治疗剂、细胞增殖抑制剂、生物毒素或前药。或者，本发明的CD23拮抗剂可以以非缀合或“祼露”的形式使用以利用主体的天然防御机制，包括补体依赖性细胞毒性(CDC)，抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)或凋亡，以消除恶性细胞。在特别优选的实施方案中，CD23拮抗剂可以缀合至放射性同位素，如90Y，125I，131I，123I，111In，105Rh，153Sm，67Cu，67Ga，166Ho，177Lu，186Re和188Re，使用多种已知螯合剂中的任何一种或直接标记。在其它的实施方案中，所公开的组合物可包含CD23拮抗剂，其与药物、前药或生物反应修饰剂如氨甲蝶呤、阿霉素和淋巴因子如干扰素相结合。本发明其它实施方案包括使用缀合至特定生物毒素如蓖麻毒蛋白或白喉毒素的抗体。在其它的实施方案中，CD23拮抗剂可以与其它免疫活性配体(例如抗体或其片段)复合，其中所得的分子既结合肿瘤细胞又结合效应细胞如T细胞。选择使用何种缀合或非缀合的CD23拮抗剂将取决于癌症的类型和阶段，使用的辅助治疗(例如化疗或外照射)和患者情况。将理解本领域技术人员依据本文的教导能容易地作出这种选择。
在此所用的“细胞毒素或细胞毒性剂”指可以与所公开的CD23拮抗剂相结合，对细胞的生长和增殖有害的并可作用于减轻、抑制或破坏其所接触的恶性肿瘤的任何物质。示例性的细胞毒素包括但不限于放射性核素、生物毒素、抑制细胞增殖的或细胞毒性的治疗剂、前药、免疫活性配体和生物反应修饰剂如细胞因子。如以下将要更详细讨论的，特别优选放射性核素细胞毒素用于本发明。但是，任何作用于阻碍或减缓恶性细胞生长或消除恶性细胞并可与本文所公开的CD23拮抗剂相结合的细胞毒素均在本发明范围之内。
应理解，在先前的研究之中，用这些同位素标记的抗肿瘤抗体已在动物模型有时在人中成功地用于破坏实体瘤以及淋巴瘤/白血病中的细胞。放射性核素通过产生电离辐射而起作用，所述辐射引起核DNA中的多处链断裂，导致细胞死亡。用于制备治疗缀合物的同位素通常产生高能α-或β-粒子，其具有短的光程长度。这类放射性核素杀死其临近的细胞，例如所述缀合物附着或进入的肿瘤细胞。它们对非局部定位的细胞无作用或作用极小。放射性核素基本上是无免疫原性的。
至于在本发明中使用放射性标记的缀合物，可以直接标记(如通过碘化作用)或通过使用螯合剂间接标记CD23拮抗剂。在此所用的短语“间接标记”和“间接标记方法”均指将螯合剂共价连到抗体上，以及将至少一种放射性核素与螯合剂相结合。特别优选的螯合剂为双功能螯合剂，包括例如1-异硫氰酸根合苄基-3-甲基二亚乙基三胺五乙酸(“MX-DTPA”)和环己基二亚乙基三胺五乙酸(“CHX-DTPA”)衍生物。用于间接标记的特别优选的放射性核素包括111In和90Y。
本文所用的短语“直接标记”和“直接标记方法”均指将放射性核素直接共价连到CD23拮抗剂上(通常通过氨基酸残基)。更具体地说，这些连接技术包括随机标记和定点标记。在后一种情况中，标记定向于二聚体或四聚体上的特定位点，如仅存在于缀合物的Fc部分上的N-连接的糖残基。此外，多种直接标记技术和方案均适合于本发明。例如，锝-99m标记的抗体可以通过配体交换方法制备，通过用亚锡离子溶液还原高锝酸盐(TcO4-)，将还原的锝螯合到Sephadex柱上，并将抗体应用于该柱；或者通过分批标记技术，例如通过温育高锝酸盐、还原剂如SnCl2、缓冲溶液如邻苯二甲酸钠-钾溶液，和CD23拮抗剂。在任何情况下，优选的用于直接标记CD23拮抗剂的放射性核素是本领域熟知的，特别优选的用于直接标记的放射性核素是131I，通过酪氨酸残基共价相连。本发明的CD23拮抗剂可以与例如放射性碘化钠或碘化钾及以下物质一起衍生化学氧化剂如次氯酸钠、氯胺T等，或酶促氧化剂如乳过氧化物酶、葡萄糖氧化酶和葡萄糖。但是，对于本发明的目的而言，特别优选间接标记方法。
涉及螯合剂和螯合缀合物的专利在本领域中是已知的。例如，Gansow的美国专利No.4,831,175针对多取代的二亚乙基三胺五乙酸螯合物和含有其的蛋白缀合物，以及其制备方法。Gansow的美国专利No.5,099,069；5,246,692；5,286,850；5,434,287和5,124,471也涉及多取代的DTPA螯合物。这些专利以其整体引入本文。适合的金属螯合剂的其他实例为乙二胺四乙酸(EDTA)，二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)，1，4，8，11-四氮杂十四烷，1，4，8，11-四氮杂十四烷-1，4，8，11-四乙酸，1-氧杂-4，7，12，15-四氮杂十七烷-4，7，12，15-四乙酸等。其他合适的螯合剂包括那些有待发现的螯合剂，可容易地由本领域技术人员进行辨别，并清楚地落入本发明范围之内。
优选选择合适的螯合剂，包括用于促进螯合的特定双功能螯合剂(在同时待审的申请顺序号08/475,813；08/475,815和08/478,967中)以提供对三价金属的高亲和性，表现出肿瘤对非肿瘤之比增加和骨摄取减少，以及放射性核素在靶部位(即B细胞淋巴瘤肿瘤部位)的体内停留延长。但是，可能具有或不具有所有这些特征的其他双功能螯合剂在本领域中是已知的并可能在肿瘤治疗中也有益。
还应理解，根据本文的教导，CD23拮抗剂可以缀合至不同的放射性标记用于诊断和治疗目的。为此，前述的同时待审的申请(在此以其整体引入本文作为参考)公开了用于在施用治疗性抗体之前进行肿瘤诊断性“显像”的放射性标记的治疗缀合物。特别优选111In作为诊断性放射性核素，因为可以安全地施用约1-约10mCi，而无可检测到的毒性；并且显像数据通常可预测随后的90Y标记的抗体分布。大多数显像研究利用5mCi111In标记的抗体，因为该剂量既安全又具有与较低剂量相比增加的显像效率，最佳显像在施用抗体之后3-6天发生。参见例如Murray，J.Nuc.Med.263328(1985)和Carraguillo等，J.Nuc.Med.2667(1985)。
如上所述，有多种放射性核素可应用于本发明，相信本领域技术人员应能容易地确定在不同的情况之下何种放射性核素是最适宜的。例如，131I是一种熟知的用于靶向免疫治疗的放射性核素。但是131I的临床有用性可受到几种因素的限制，包括8天的物理半衰期；碘化抗体在血液中和在肿瘤部位的脱卤化作用；和发射特征(例如大γ成分)，其对于在肿瘤中的局部化剂量沉积可能不最理想。随着优异的螯合剂的出现，将金属螯合基团连到蛋白质的机会增加了利用其它放射性核素，如111In和90Y的机会。对于在放射免疫治疗中的应用，90Y提供了几种益处90Y的半衰期为64小时，其长度足以使得肿瘤蓄积抗体，并且与例如131I不同，90Y是纯的高能β发射体，在其衰变中不伴有γ辐射，在组织中的范围为100-1000细胞直径。而且，最低量的穿透辐射使得可对门诊病人施用90Y标记的抗体。另外，对于细胞杀伤，不需要内化标记的CD23拮抗剂，并且电离辐射的局部发射对缺乏靶抗原的临近肿瘤细胞应是致死性的。
90Y标记的CD23拮抗剂的有效单一治疗剂量(即治疗有效量)为约5-约75mCi，更优选约10-约40mCi。131I标记的抗体的有效单一治疗非骨髓重度抑制剂量从约5-约70mCi，更优选约5-约40mCi。131I标记的抗体的有效单一治疗重度骨髓抑制剂量(即可能需要自体骨髓移植)为约30-约600mCi，更优选约50-小于约500mCi。与嵌合抗体相结合，碘-131标记的嵌合抗体因其相对于小鼠抗体更长的循环半衰期，其有效单一治疗非骨髓重度抑制剂量从约5-约40mCi，更优选小于约30mCi。对于例如111In标记，显像标准通常小于约5mCi。
尽管对于131I和90Y已取得了大量临床经验，其它放射性标记在本领域中也是已知的并已用于类似目的。有其它放射性同位素用于显像。例如，适合本发明范围的其它放射性同位素包括但不限于123I，125I，32P，57Co，64Cu，67Cu，77Br，81Rb，81Kr，87Sr，113In，127Cs，129Cs，132I，197Hg，203Pb，206Bi，177Lu，186Re，212Pb，212Bi，47Sc，105Rh，109Pd，153Sm，188Re，199Au，225Ac，211At，和213Bi。在这方面，α、γ和β发射体均适于本发明。此外，鉴于本发明所公开的内容，认为本领域技术人员可以容易地确定何种放射性核素适于所选择的疗程而无需过度试验。为此，已用于临床诊断的其它放射性核素包括125I，123I，99Tc，43K，52Fe，67Ga，68Ga以及111In。抗体也已用多种放射性核素进行标记，以潜在用于靶向免疫治疗Peirersz等，Immunl.Cell Biol.65111-125(1987)。这些放射性核素包括188Re和186Re以及199Au和67Cu(较低程度)。美国专利No.5,460,785提供了有关这些放射性同位素的额外数据，引入本文作为参考。
除了放射性核素之外，本发明的CD23拮抗剂可以缀合至或结合多种生物反应修饰剂、药剂、毒素或免疫活性配体中的任何一种。本领域技术人员将理解，取决于所选择的细胞毒素，可以使用多种技术装配这些非放射性缀合物。例如，与生物素的缀合物可以这样制备例如通过使CD23拮抗剂(即抗体)与生物素的活化酯如生物素N-羟基琥珀酰亚胺酯反应。类似地，与荧光标记的缀合物可以在有偶联剂如以上所列的那些偶联剂的存在下进行制备，或通过与异硫氰酸酯优选异硫氰酸荧光素反应而制备。本发明嵌合抗体(即IDEC-152)与抑制细胞增殖的/细胞毒性物质的缀合物和金属螯合物以类似的方式制备。
如前所述，合适的细胞毒素可包括前药。本文所用的术语“前药”指药学活性物质的前体或衍生物形式，与亲本药物相比其对肿瘤细胞的细胞毒性较低，并能被酶促活化或转化为活性更高的亲本形式。适合本发明的前药包括但不限于含磷酸的前药、含硫代磷酸的前药、含硫酸的前药、含肽的前药、含β-内酰胺的前药、含选择性取代的苯氧乙酰胺的前药或含选择性取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药，其可转换为更具活性的细胞毒性游离药物。可衍生为前药形式用于本发明的细胞毒性药物的其他实例包括以上所述的那些化疗剂。
无论所公开的CD23拮抗剂是以缀合或是以非缀合形式使用，将理解本发明的主要优点是可在骨髓抑制患者中使用这些抗体，特别是那些正在经受或已经受辅助治疗如放疗或化疗的患者。在此方面，CD23拮抗剂的独特递送特征使其对于将放射性标记的缀合物施用于骨髓抑制的癌症患者非常有效。由此，在先前经受过辅助治疗如外射线照射或化疗的患者中，缀合或非缀合形式的CD23拮抗剂是有用的。在其它优选的实施方案中，CD23拮抗剂(缀合或非缀合形式)可用于与化疗剂的联合治疗方案中。本领域技术人员将理解这种治疗方案可包括序贯、同时、并行或同时间施用所公开的CD23拮抗剂以及一种或多种化疗剂。
尽管CD23拮抗剂可以如上所述施用，必须强调在其它实施方案中，可以将缀合和非缀合的CD23拮抗剂施用于除此之外健康的癌症患者作为一线治疗剂。在这种实施方案中，CD23拮抗剂可以施用于具有正常或平均红骨髓储备的患者和/或没有经受过和没有正在经受辅助治疗如外射线照射或化疗的患者。
但是，如以上所讨论的，本发明所选择的实施方案包括将CD23拮抗剂与一种或多种辅助治疗如放疗或化疗相联合或组合施用于骨髓抑制患者(即联合治疗方案)。如本文所用的，施用CD23拮抗剂与辅助治疗相结合或联合意味着序贯、同时、同时间、并行、相伴或同时期施用或应用所述治疗和所公开的抗体。本领域技术人员将理解可以设定施用或应用所述联合治疗方案的各种组成成分的时间，以增加治疗的总有效性。例如，可以以标准的熟知的疗程施用化疗剂，然后在数周之内施用本发明的CD23拮抗剂。反过来，可以静脉内施用与细胞毒素结合的CD23拮抗剂，然后是局限定位于肿瘤局部的外射线照射。在另外的实施方案中，拮抗剂可以与一种或多种所选择的化疗剂在一次就诊中同时施用。技术人员(如有经验的肿瘤学家)基于所选择的辅助治疗和本申请说明书的教导，能容易地判断有效的联合治疗方案，而无需过多试验。
在这方面，应理解CD23拮抗剂(与或不与细胞毒素一起)与化疗剂的组合可以以任何次序并在对患者提供治疗裨益的任何时间框架内施用。即，化疗剂和CD23拮抗剂可以以任何次序或同时施用。在选择的实施方案中，本发明的CD23拮抗剂将施用于先前经历过化疗的患者。在其它的实施方案中，CD23拮抗剂和化疗剂治疗将基本上同时或相伴施用。例如，可以给予患者CD23拮抗剂，同时接受化疗疗程。在优选的实施方案中，CD23拮抗剂将在任何化疗剂或治疗1年之内施用。在其它优选的实施方案中，CD23拮抗剂将在任何化疗剂或治疗10、8、6、4或2个月内施用。在另外优选的实施方案中，CD23拮抗剂将在任何化疗剂或治疗4、3、2或1周内施用。在另外的实施方案中，CD23拮抗剂将在所选择的化疗剂或治疗5、4、3、2或1天内施用。还可以理解两种药剂或治疗可在事实上数小时或数分钟之内(即基本上同时)施用于患者。
此外，根据本发明，骨髓抑制患者应理解为任何表现出血液计数降低的患者。本领域技术人员将理解有几个血液计数参数常规用作骨髓抑制的临床指标，并可以容易地衡量患者发生骨髓抑制的程度。本领域所公认的骨髓抑制测定的实例为绝对中性粒细胞计数(ANC)或血小板计数。这种骨髓抑制或部分骨髓重度抑制可能是多种生化障碍或疾病的结果，或更有可能是先前化疗或放疗的结果。在此方面，本领域技术人员将理解经受过传统化疗的患者通常会表现出红骨髓储备减少。
更具体地说，本发明缀合或非缀合的CD23拮抗剂可用于有效治疗ANC低于约2000/mm3或血小板计数低于约150,000/mm3的患者。更优选本发明的CD23拮抗剂可用于治疗ANC低于约1500/mm3，低于约1000/mm3或甚至更优选低于约500/mm3的患者。类似地，本发明的CD23拮抗剂可用于治疗血小板计数低于约75,000/mm3，低于约50,000/mm3或甚至低于约10,000/mm3的患者。在更普遍的意义上，本领域技术人员使用政府实施的指南和操作将能容易地确定何时患者为骨髓抑制。
如上所述，许多骨髓抑制患者经历过包括化疗、植入放疗或外射线放疗在内的疗程。对于后一种情况，外照射源对恶性肿瘤进行局部辐射。对于放疗植入方法，放射性试剂通过外科手术置入恶性瘤内，从而选择性地辐射疾病部位。在任何情况下，所公开的拮抗剂可用于在表现出骨髓抑制的患者中治疗肿瘤性疾病，无论引起骨髓抑制的原因是什么。
将进一步理解本发明的CD23拮抗剂可与任何消除、减少、抑制或控制肿瘤细胞在体内生长的化疗剂相结合或联合施用(例如以提供联合治疗方案)。本文所用的术语“化疗剂”或“化学治疗剂”应理解为指任何治疗化合物，其施用于治疗或预防肿瘤细胞在体内的生长。具体地说，适合本发明的化疗剂包括“传统的”化疗剂，如小分子和近来开发的生物制品如抗体、细胞因子、反义分子等，其用于减少或延缓恶性细胞的生长。特别优选的适于与所公开的CD23拮抗剂一起使用的化疗剂包括可购得的针对肿瘤相关抗原的抗体，如Rituxan、ZevalinTM、Herceptin、Lymphocide、Campath等。在另外的优选实施方案中，正处于临床试验的抗肿瘤抗体可与CD23拮抗剂联合使用。例如，IDEC-114和IDEC-131(IDEC Pharmaceuticals，San DiegoCA)分别针对B7抗原和CD40L抗原，可与所公开的拮抗剂一起用于治疗所选择的肿瘤。在此方面，Lym-1(Peregrin Pharmaceuti cals，Tustin CA)和ErbituxTM(Imclone Pharmaceuticals，Cambridge MA)也适于本发明。其它适合的生物化疗剂包括细胞因子，如淋巴因子、白介素、肿瘤坏死因子和生长因子。CD23拮抗剂也可与免疫抑制剂、前药或细胞毒性剂相结合使用以治疗所选择的恶性肿瘤。
与CD23拮抗剂相结合特别有用的化疗抗体包括Y2B8和C2B8(ZevalinTM& Rituxan)IDEC-114和IDEC-131(IDECPharmaceuticals Corp.，San Diego)，Lym1和Lym2，LL2(Immunomedics Corp.，New Jersey)，HER2(Herceptin，GenentechInc.South San Francisco)，B1(Bexxar，Coulter Pharm.，SanFrancisco)，MB1，BH3，B4，B72.3(Cytogen Corp.)，CC49(NationalCancer Institute)和5E10(University of Iowa)。Rituxan是第一个FDA批准的单克隆抗体，用于治疗人B细胞淋巴瘤(参见美国专利No.5,843,439；5,776,456和5,736,137，各引入本文作为参考)。Y2B8是C2B8的小鼠亲本。Rituxan是一种嵌合的抗CD20单克隆抗体(MAb)，其是生长抑制性的，并且据报道在体外可敏化某些淋巴瘤细胞系发生化疗剂诱发的细胞凋亡。该抗体有效地结合人补体，具有强FcR结合，并能在体外有效地杀死人淋巴细胞，通过补体依赖性(CDC)和抗体依赖性(ADCC)机制(Reff等，Blood 83435-445(1994))。本领域技术人员将理解，任何针对常见的肿瘤相关抗原或免疫调节抗原如CD20，CD22，B7或CD40L的抗体均适于本发明并可与所公开的拮抗剂相结合使用。
可用于本发明的更“传统”的化疗剂包括烷化剂如噻替哌和环磷酰胺(CYTOXANTM)；烷基磺酸盐(酯)类如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖啶类如苯并多巴、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派；氮丙啶类和甲基蜜胺类包括六甲基蜜胺、曲他胺、三乙撑磷酰胺、三乙撑硫代磷酰胺和三羟甲蜜胺；氮芥类如苯丁酸氮芥、萘氮芥、氯环磷酰胺(cholophosphamide)、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆固醇、泼尼莫司汀、曲磷胺、尿嘧啶氮芥；亚硝基脲类如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素如阿克拉霉素、放线菌素、安曲霉素、重氮乙酰丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、加利车霉素、卡柔比星、洋红霉素、嗜癌素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮基-5-氧代-L-正亮氨酸、阿霉素、表柔比星、依索比星、伊达比星、麻西罗霉素、丝裂霉素、霉酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、泊非霉素、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑菌素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星；抗代谢药如氨甲蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物如二甲叶酸、氨甲蝶呤、蝶酰蝶呤、三甲曲沙；嘌呤类似物如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素类如卡鲁睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄氨、睾内酯；抗肾上腺药如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂如frolinic aGid；醋葡醛内酯；aldophosphamide glycoside；氨基乙酰丙酸；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙；defofamine；地美可辛；地吖醌；依氟鸟氨酸；依利醋铵；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶；喷司他丁；蛋氨氮芥；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2’，2”-三氯三乙胺；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；噻替哌；紫杉烷类，例如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，NJ)和多西他赛(泰索帝，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；氨甲蝶呤；铂类似物如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊甙(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞宾；navelbine；二羟基蒽酮；替尼泊甙；柔红霉素；氨基蝶呤；xeloda；伊拜膦酸盐；CPT11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；capecitabine；和以上任何物质的可药用盐、酸或衍生物。还包括在此定义之内的是抗激素剂，其作用于调节或抑制激素对肿瘤的作用，如抗雌激素类，包括例如他莫昔芬、雷洛昔芬，抑制芳香酶的4(5)-咪唑类、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、keoxifene、LY117018、奥那司酮，和托瑞米芬(Fareston)；和抗雄激素类如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙瑞林和戈舍瑞林；和任何上述物质的可药用盐、酸或衍生物。
合适的化疗方案包括药物组合。四种药物的组合MOPP(mechlethamine(氮芥)，长春新碱(Oncovin)，丙卡巴肼和强的松)对治疗多种类型的淋巴瘤非常有效，并构成本发明一个优选实施方案。在对MOPP耐药的患者中，可以使用ABVD(例如阿霉素，博来霉素，长春碱和达卡巴嗪)，ChlVPP(苯丁酸氮芥，长春碱，丙卡巴肼和强的松)，CABS(洛莫司汀，阿霉素，博来霉素和链脲霉素)，MOPP加ABVD，MOPP加ABV(阿霉素，博来霉素和长春碱)或BCVPP(卡莫司汀，环磷酰胺，长春碱，丙卡巴肼和强的松)组合。Arnold S.Freedman和Lee M.Nadler.Malignant Lymphoma，HARRISON’SPRINCIPLE OF INTERNAL MEDICINE 1774-1778(Kurt J.Isselbacher等编著，第13版，1994)和V.T.DeVita等(1997)以及其中引用的参考文献描述了标准给药和方案。这些疗法可不作改变地使用，或根据特定患者的需要作变动，与本文所述的CD23拮抗剂相结合。
可用于本发明的其它方案包括使用单一烷化剂如环磷酰胺或苯丁酸氮芥，或组合如CVP(环磷酰胺，长春新碱和强的松)，CHOP(CVP和阿霉素)，C-MOPP(环磷酰胺，长春新碱，强的松和丙卡巴肼)，CAP-BOP(CHOP加丙卡巴肼和博来霉素)，m-BACOD(CHOP加氨甲蝶呤，博来霉素和甲酰四氢叶酸)，ProMACE-MOPP(强的松，氨甲蝶呤，阿霉素，环磷酰胺，依托泊甙和甲酰四氢叶酸加标准MOPP)，ProMACE-CytaBOM(强的松，阿霉素，环磷酰胺，依托泊甙，阿糖胞苷，博来霉素，长春新碱，氨甲蝶呤和甲酰四氢叶酸)和MACOP-B(氨甲蝶呤，阿霉素，环磷酰胺，长春新碱，固定剂量强的松，博来霉素和甲酰四氢叶酸)。本领域技术人员将能容易地确定这些方案中每一种的标准剂量和方案。CHOP也已与博来霉素，氨甲蝶呤，丙卡巴肼，氮芥，阿糖胞苷和依托泊甙相联合。其它合适的化疗剂包括但不限于2-氯脱氧腺苷(2-CDA)，2’-脱氧助间型霉素和氟达拉滨。
对于未获得缓解或复发的中间和高分级NHL患者，使用抢救治疗。抢救治疗采用药物如阿糖胞苷，顺铂，依托泊甙和异环磷酰胺，单独或联合给予。在复发或侵袭形式的某些肿瘤性疾病中，经常使用以下方案IMVP-16(异环磷酰胺，氨甲蝶呤和依托泊甙)，MIME(甲基-gag，异环磷酰胺，氨甲蝶呤和依托泊甙)，DHAP(地塞米松，高剂量阿糖胞苷和顺铂)，ESHAP(依托泊甙，甲基强的松龙，HD阿糖胞苷，顺铂)，CEPP(B)(环磷酰胺，依托泊甙，丙卡巴肼，强的松和博来霉素)和CAMP(洛莫司汀，米托蒽醌，阿糖胞苷和强的松)，各自有其熟知的给药速率和方案。有待与本发明的CD23拮抗剂相结合使用的化疗剂的量可随治疗对象而不同，或可以根据本领域的知识施用。参见例如，Bruce A Chabner等，Antineoplastic Agents，GOODMAN &GILMAN’S THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS1233-1287((Joel G.Hardman等编著，第9版，1996)。
此处用于辅助治疗所用的术语“免疫抑制剂”指作用于抑制或掩蔽在此接受治疗的哺乳动物的免疫系统的物质。这会包括抑制细胞因子产生、下调或抑制自身抗原表达或掩蔽MHC抗原的物质。这种药剂的实例包括2-氨基-6-芳基-5-取代的嘧啶类(参见美国专利No.4,665,077，其内容在此引作参考)、硫唑嘌呤；环磷酰胺；溴隐亭；达那唑；氨苯砜；戊二醛(其掩蔽MHC抗原，如美国专利No.4,120,649中所述)；针对MHC抗原和MHC片段的抗独特型抗体；环孢菌素A；类固醇如糖皮质激素，例如强的松、甲基强的松龙和地塞米松；细胞因子或细胞因子受体拮抗剂包括抗-干扰素-α、β-或δ-抗体，抗-肿瘤坏死因子-α抗体，抗-肿瘤坏死因子-β抗体，抗-白介素-2抗体和抗-IL-2受体抗体；抗-LFA-1抗体，包括抗-CD11a和抗-CD18抗体；抗-L3T4抗体；异种抗-淋巴细胞球蛋白；泛-T抗体，优选抗CD3或抗CD4/CD4a抗体；含有LFA-3结合域的可溶性肽(公开于7/26/90的WO 90/08187)，streptolanase；TGF-β；链道酶；来自宿主的RNA或DNA；FK506；RS-61443；脱氧精胍菌素；雷怕霉素；T细胞受体(Cohen等，美国专利No.5,114,721)；T细胞受体片段(Offner等，Science，251430-432(1991)；WO 90/11294；laneway，Nature，341482(1989)；和WO 91/01133)；和T细胞受体抗体(EP 340,109)如TiOB9。
在此所用的术语“细胞毒性剂”指抑制或阻止细胞功能和/或引起细胞破坏的物质。该术语旨在包括放射性同位素、化疗剂和毒素如来源于细菌、真菌、植物或动物的小分子毒素或酶活性毒素，或其片段。
术语“细胞因子”是对由一个细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一个细胞的蛋白质的总称。这种细胞因子的实例是淋巴因子、单核因子和传统的多肽激素。细胞因子中包括有生长激素如人生长激素、N-甲硫氨酰人生长激素，和牛生长激素；甲状旁腺激素；甲状腺素；胰岛素；胰岛素原；松弛素；松弛素原；糖蛋白激素如卵泡刺激激素(FSH)、甲状腺刺激激素(TSH)和促黄体生成激素(LH)；肝生长因子；成纤维细胞生长因子；催乳素；胎盘催乳激素；肿瘤坏死因子-α和-β；米勒管-抑制物质；小鼠促性腺激素-相关肽；抑制素；激活素；血管内皮生长因子；整联蛋白；血小板生成素(TPO)；神经生长因子如NGF-13；血小板生长因子；转化生长因子(TGF)如TGF-α和TGF-β；胰岛素样生长因子-I和-II；红细胞生成素(EPO)；骨诱导因子；干扰素如干扰素-α、-β和-γ；集落刺激因子(CSF)如巨噬细胞-CSF(M-CSF)；粒-巨噬细胞-CSF(GM-CSF)；和粒细胞-CSF(G-CSF)；白介素(IL)如IL-1、IL-1a、IL-2、IL-g、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-11、IL-12、IL-15；肿瘤坏死因子如TNF-α或TNF-β；和其它多肽因子包括LIF和试剂盒配体(KL)。在此所用的术语细胞因子包括来自天然来源或重组细胞培养物的蛋白质以及天然序列细胞因子的生物学活性等同物。
本申请中所用的术语“前药”指药学活性物质的前体或衍生物形式，与亲本药物相比其对肿瘤细胞的细胞毒性较低，并能被酶促活化或转变为活性更高的亲本形式。参见例如Wilman，“Prodrugs inCancer Chemotherapy，”Biochemical Society Transactions，14，pp.375-382，615thMeeting Belfast(1986)和Stella等，“ProdrugsAChemical Approach to Targeted Drug Delivery，”Directed DrugDelievery，Borchardt等，(ed.)，pp.247-267，Humana Press(1985)。本发明的前药包括但不限于含磷酸的前药、含硫代磷酸的前药、含硫酸的前药、含肽的前药、D-氨基酸-修饰的前药、糖基化的前药、含β-内酰胺的前药、含选择性取代的苯氧乙酰胺的前药或含选择性取代的苯基乙酰胺的前药、5-氟胞嘧啶和其它5-氟尿苷前药，其可转换为更具活性的细胞毒性游离药物。可衍生为前药形式用于本发明的细胞毒性药物的实例包括但不限于以上所述的那些化疗剂。
“脂质体”是一种由多种类型脂质、磷脂和/或表面活性剂组成的小囊泡，其可用于将药物(如在此所公开的拮抗剂，以及选择性地化疗剂)递送至哺乳动物。脂质体的成分通常排列成双层结构，类似于生物膜的脂质排列方式。
如先前所讨论的，本发明的拮抗剂、其免疫反应性片段或重组体可以以药学有效量施用以在体内治疗哺乳动物恶性肿瘤。在此方面，应理解所公开的拮抗剂将配制为易化给药和增加活性剂的稳定性。优选本发明的药物组合物包括可药用无毒无菌载体，如生理盐水，无毒缓冲剂、防腐剂等。对于本申请的目的而言，药学有效量的CD23拮抗剂、其免疫反应性片段或重组体应被认为意味着足以实现与肿瘤细胞上的CD23抗原有效结合并使那些细胞死亡增加的量。当然，本发明的药物组合物可以以单剂或多剂施用以提供药学有效量的CD23拮抗剂。
更具体地说，所公开的拮抗剂和方法应可用于减小肿瘤体积，抑制肿瘤生长和/或延长携带肿瘤的动物的存活时间。因此，本发明还涉及治疗人类或其它动物中的肿瘤的方法，通过向所述人或动物施用有效无毒量的CD23拮抗剂。本领域技术人员能通过常规试验确定对于治疗恶性肿瘤目的的拮抗剂的有效无毒量。例如，拮抗剂的治疗活性量可根据多种因素而变化，诸如治疗对象的疾病阶段(例如I期相对于IV期)、年龄、性别、医学并发症(例如免疫抑制病症或疾病)和体重，以及所述拮抗剂在该对象中引发所需应答的能力。可以调整剂量方案，以提供最理想的治疗反应。例如，每天可施用几个分开的剂量，或者根据治疗情况的紧急事件可成比例地减少剂量。然而一般来说，预计有效剂量在约0.05-100毫克/公斤体重/天的范围之内，更优选0.5-10毫克/公斤体重/天。
依据本文公开内容的范围，本发明的拮抗剂可按照上述治疗方法以足以产生治疗或预防程度的作用的量施用于人或其它动物。本发明的拮抗剂可以以常规剂型施用于所述人或其它动物，该剂型是按照已知技术通过将本发明的拮抗剂与常规可药用载体或稀释剂相结合而制备的。本领域技术人员将认识到，可药用载体或稀释剂的形式和性质取决于其有待与之结合的活性成分的量，给药途径和其它已知的变量。本领域技术人员还将理解，包含一种或多种本发明的拮抗剂的混合剂可能证实特别有效。
制备和施用CD23拮抗剂的方法对于本领域技术人员而言是熟知的或可以容易确定。本发明拮抗剂的给药途径可以是口服、胃肠外、吸入或局部用药。本文所用的术语胃肠外包括静脉内、动脉内、腹膜内、肌内、皮下、直肠或阴道给药。通常优选静脉内、动脉内、皮下和肌内形式的胃肠外给药。尽管所有这些形式的给药很明显均在本发明范围之内，优选的给药形式为注射溶液，特别是用于静脉内或动脉内注射或滴注的溶液。通常，适于注射的药物组合物可包含缓冲剂(例如乙酸盐、磷酸盐或柠檬酸盐缓冲剂)、表面活性剂(例如聚山梨酯)，任选存在的稳定剂(例如人白蛋白)等。但是，在其它符合本文教导的方法中，拮抗剂可以被直接递送至恶性肿瘤部位，从而增加肿瘤组织与治疗剂的接触。
用于胃肠外给药的制剂包括无菌水溶液或非水溶液、悬液和乳液。非水溶剂的实例为丙二醇、聚乙二醇、植物油如橄榄油，和可注射有机酯如油酸乙酯。含水载体包括水，醇/水溶液、乳液或悬液，包括盐水和缓冲介质。在本发明中，可药用载体包括但不限于，0.01-0.1M优选0.05M磷酸缓冲液或0.8％盐水。其它常用的胃肠外载体包括磷酸钠溶液、林格氏葡萄糖、葡萄糖和氯化钠、乳酸化林格氏液或不挥发油。静脉内载体包括液体和营养补充剂、电解质补充剂如基于林格氏葡萄糖的那些，和诸如此类。防腐剂和其它添加剂也可能存在，例如抗微生物剂、抗氧化剂、螯合剂和惰性气体等。
本领域技术人员将理解，适于注射应用的药物组合物包括无菌水溶液(水溶性)或分散体，和无菌粉末用于临时制备无菌注射溶液或分散体。在这种情况下，组合物必须是无菌的，并且其流动程度应易于注射。该组合物在制备和贮存条件下应该是稳定的，并优选贮存时不受微生物如细菌和真菌的污染。载体可以是溶剂或分散介质，含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液态聚乙二醇等)及其合适的混合物。通过例如使用包衣如卵磷脂，通过维持所需的粒径(对于分散体)和通过使用表面活性剂，可以保持适当的流动性。
更具体地说，包含本发明所使用的拮抗剂的治疗制剂是这样制备用于贮存的将具有所需纯度的拮抗剂与选择性的可药用载体、赋形剂或稳定剂相混合(Remington’s Pharmaceutical Sciences 16thedition，Osol，A.Ed.(1980))，制成冻干制剂或水溶液的形式。可接受的载体、赋形剂或稳定剂以所采用的剂量和浓度对接受者是无毒性的，包括缓冲剂如磷酸、柠檬酸和其它有机酸；抗氧化剂包括抗坏血酸和甲硫氨酸；防腐剂(如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯己双铵；苯扎氯铵，氯化苄乙氧铵；苯酚，丁醇或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)；低分子量(少于约10个残基)多肽；蛋白质如血清白蛋白，明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸；单糖、双糖和其它糖类包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合剂如EDTA；糖类如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨醇；成盐平衡离子如钠；金属络合物(例如Zn-蛋白络合物)；和/或非离子型表面活性剂如TWEENTM，PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)。
适于皮下给药的冻干制剂如WO97/04801中所述。这种冻干制剂可以用合适的稀释剂重新配制至高蛋白浓度，并可将重新配制的制剂对在此待治疗的哺乳动物进行皮下给药。
在此所述制剂还可以包含超过一种对所治疗的特定适应症所必需的活性化合物，优选具有互补活性彼此不产生不利影响的那些。例如，可能想要进一步提供一种化疗剂、细胞因子或免疫抑制剂(例如作用于T细胞的物质，如环孢菌素，或结合T细胞的抗体，例如结合LFA-1的抗体)。这种其它物质的有效量取决于制剂中存在的拮抗剂的量、疾病或障碍或治疗的类型，以及以上讨论的其它因素。这些物质通常以与上文所用相同的剂量和给药途径使用，或迄今所采用剂量的约1-99％。
活性成分还可以包入例如通过30凝聚技术或通过界面聚合制备的微胶囊中，例如羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊，分别在胶态药物递送体系中(例如脂质体、白蛋白微球体、微乳状液、纳米颗粒和纳米胶囊)或处于粗滴乳状液中。这种技术公开于Remington’s Pharmaceutical Sciences 16thedition，Osol，A.Ed.(1980)。
还可以制备缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有拮抗剂的固体疏水性聚合物的半透基质，所述基质为成形产品的形式，例如薄膜或微胶囊。缓释基质的实例包括聚酯、水凝胶(例如聚(2-羟乙基-甲基丙烯酸酯)或聚(乙烯醇))、聚交酯(美国专利No.3,773,919)、L-谷氨酸与γ乙基-L-谷氨酸酯的共聚物、不可降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-乙醇酸共聚物如LUPRON DEPOTTM(由乳酸-乙醇酸共聚物与醋酸亮丙瑞林组成的可注射微球体)，和聚-D-(-)-3-羟基丁酸。用于体内给药的制剂必须是无菌的。通过经无菌过滤膜滤过可以容易地实现这一要求。
通过利用多种抗菌剂和抗真菌剂可进一步预防微生物的作用，例如对羟基苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、多元醇如甘露醇、山梨醇，或氯化钠。通过在组合物中包含延迟吸收的物质例如单硬脂酸铝和明胶，可延长注射组合物的吸收。
在任何情况下，可以这样制备无菌注射溶液将活性化合物(例如拮抗剂本身或与其它活性剂相结合)以所需量，根据需要与一种在此列举的成分或其组合一起，在适宜的溶剂中混合，然后过滤除菌。通常，分散体是这样制备的将活性化合物掺入无菌载体中，所述载体含有基础分散介质和所需的选自以上所列的其它成分。对于用于制备无菌注射溶液的无菌粉末，优选的制备方法为真空干燥和冻干，产生来自其先前无菌滤过溶液的活性成分加上任何额外的所需成分的粉末。
对注射制剂进行加工处理，注入容器内，所述容器如安瓿、袋、瓶、注射器或小瓶，并在无菌条件下按照本领域已知的方法进行密封。容器可以由多种材料如玻璃或塑料形成，并装有、含有或在其中分散有有效治疗所选疾病或障碍的组合物。另外，所述容器可以有一个无菌的取药口(例如容器可以为静脉内溶液袋或小瓶，具有可用皮下注射针头刺穿的塞子)。这些制剂可以进行包装并以药盒形式出售，如在同时待审的U.S.S.N.09/259,337和U.S.S.N.09/259,338(各引入本文作为参考)中描述的那些。这种产品将优选带有标签或包装插页，指示所述组合物可用于治疗患有或倾向于患癌症、恶性肿瘤或肿瘤性疾病(例如慢性淋巴细胞白血病)的对象。术语“包装插页”用于指常规包括在治疗产品的商业包装中的使用说明，其包含有关使用这种治疗产品的适应症、用法、剂量、给药、禁忌症和/或警告的信息。该产品还可包括第二容器，含有可药用缓冲剂，如抑菌的注射用水(BWFI)，磷酸缓冲盐水，林格氏液和葡萄糖溶液。其还可包括从商业和使用者角度所需要的其它材料，包括其它缓冲剂、稀释剂、滤器、针头和注射器。
如以上详细讨论的，本发明提供了用于在需要治疗的哺乳动物对象中治疗肿瘤性疾病的化合物、组合物、药盒和方法。优选所述对象是人。尽管本发明在治疗包括慢性淋巴细胞白血病在内的CD23+血液系统恶性肿瘤中特别有效，所公开的拮抗剂和方法可用于治疗任何CD23+肿瘤。在此方面，CD23+肿瘤性疾病(例如癌症和恶性肿瘤)可包括实体瘤，如黑素瘤、神经胶质瘤、肉瘤和癌以及髓细胞样或血液系统恶性肿瘤如淋巴瘤和白血病。本文所公开的发明可用于预防性或治疗性治疗任何肿瘤，所述肿瘤包含CD23抗原性标记，从而拮抗剂可以靶向针对癌细胞。可治疗的癌症实例包括但不限于前列腺、结肠、皮肤、乳腺、卵巢、肺和胰腺癌。在优选的实施方案中，拮抗剂可用于治疗更具体地，本发明的抗体可用于治疗卡波西肉瘤、CNS肿瘤(毛细血管母细胞瘤、脑膜瘤和脑转移)、肥大细胞瘤、黑素瘤、胃肠和肾肉瘤、横纹肌肉瘤、胶质母细胞瘤(优选多形性胶质母细胞瘤)、平滑肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、卵巢的乳头状囊腺癌、Wilm’s肿瘤和小细胞肺癌。应理解，鉴于本发明所公开的内容，可根据在每种前述肿瘤上表达的CD23得到适宜的拮抗剂，而无需过多试验。
为明确说明，“哺乳动物”指任何分类为哺乳动物的动物，包括人、家畜和农场动物以及动物园、运动或宠物动物，如狗、马、猫、牛等。优选所述哺乳动物是人。
“治疗”指治疗性治疗和预防性措施。那些需要治疗的包括已患有疾病或障碍的以及有待预防疾病或障碍的那些。因此，所述哺乳动物可能已经被诊断为患有疾病或障碍或可能倾向于或易患该疾病。
如先前所讨论的，本发明的方法、组合物和产品可特别用于治疗慢性淋巴细胞白血病。但是也可以使用所公开的方法治疗其它CD23+血液系统恶性肿瘤，这也明显在本发明范围之内。在此方面，可用本发明治疗的血液系统恶性肿瘤的实例包括小T细胞淋巴瘤、淋巴细胞淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、霍奇金和非霍奇金淋巴瘤以及白血病，包括ALL-L3(伯基特型白血病)、急性T细胞白血病、慢性髓细胞白血病和单核细胞白血病。
还将理解本发明的化合物和方法在治疗多种B细胞淋巴瘤中特别有效，包括低分级/NHL滤泡细胞淋巴瘤(FCC)，套细胞淋巴瘤(MCL)，弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)，小淋巴细胞(SL)NHL，中间分级/滤泡性NHL，中间分级弥漫性NHL，高分级免疫母细胞NHL，高分级淋巴母细胞NHL，高分级小未分裂细胞NHL，bulky disease NHL，Waldenstrom’s巨球蛋白血症，浆细胞样淋巴细胞性淋巴瘤(LPL)，套细胞淋巴瘤(MCL)，滤泡性淋巴瘤(FL)，弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)，伯基特淋巴瘤(BL)，AIDS相关性淋巴瘤，单核细胞性B细胞淋巴瘤，血管免疫母细胞淋巴结病，小淋巴细胞性、滤泡性、弥漫性大细胞性、弥漫性小分裂细胞性、大细胞免疫母细胞成淋巴细胞瘤，小未分裂细胞性、伯基特和非伯基特、滤泡性大细胞为主、滤泡性小分裂细胞为主和滤泡性小分裂细胞和大细胞混合的淋巴瘤。参见，Gaidono等，“Lymphoma”，CANCERPRINCIPLES & PRACTICE OF ONCOLOGY，Vol.22131-2145(De Vita等编著，第5版，1997)。本领域技术人员应很清楚，由于不断改变的分类系统，这些淋巴瘤通常会有不同的命名，患有分类为不同名称的淋巴瘤的患者也可受益于本发明的联合治疗方案。除了前述肿瘤性疾病之外，应理解本发明可有利地用于治疗其他表达CD23抗原的恶性肿瘤。
参照以下实施例将更充分理解前述说明。然而这些实施例为示范实施本发明的优选方法，而并非限定本发明或所附权利要求书的范围。
使用了几种抗体来进行在以下实施例中所述的试验。如前所述，IDEC-152(p5E8)是Primatized抗人CD23 MAb，其含有人γ1重链(Lot#ZC152-02)，Rituxan(rituximab)是抗人CD20特异性小鼠-人γ1嵌合抗体(Lot E9107A1；Lot D9097A1)。所用的其它抗体包括用PE标记的小鼠抗人CD23 MAb(Cat # 33615X，BD Pharmingen，San Diego，CA)和灵长类动物源化抗人CD4 MAb CE9.1，其具有人γ1链(LotM2CD4156)。特异性针对RSV融合蛋白的完全人抗体RF-2用作同种型(IgG1)匹配的抗体对照。
实施例1CD23在B淋巴瘤和B-CLL细胞中的表达通过流式细胞仪测定CD23在几种淋巴瘤细胞系中的表达。更具体地说，使用抗CD23 PE标记抗体(BD Biosciences，Cat.No33615X)通过流式细胞仪评价CD23表达。通过比较与细胞结合的抗CD23-PE抗体的平均荧光强度和PE标记的校准珠(QuantiBrite)的平均荧光强度，确定抗体结合的相对荧光强度(RFI)。CD23相对表达计算为RFI(样本)÷SKW细胞的RFI。
在完全培养基中培养表达CD20和B7的B淋巴瘤细胞系(SKW，SB，Daudi，Raji，Ramos和DHL-4细胞)。完全培养基为RPMI 1640培养基(Irvine Scientific，Santa Ana，CA)，补充10％热灭活的FBS(Hyclone)，2mM 1-谷氨酰胺，100单位/ml青霉素，和100ug/ml链霉素。SKW细胞系为Epstein-Barr病毒(EBV)阳性，并可被诱导分泌IgM(SKW 6.4，ATCC)。SB细胞系源于一名急性淋巴母细胞白血病患者，并呈EBV阳性(CCL-120，ATCC)。Daudi细胞系分离自一名伯基特淋巴瘤患者(CCL-213，ATCC)。Raji和Ramos细胞系也分离自伯基特淋巴瘤患者(CCL-86，CRL-1596，ATCC)。DHL-4分离自一名被诊断为弥漫性组织细胞淋巴瘤的患者(Epstein等，Cancer，1978，422379)。
在测试的细胞系中，6种细胞系中有3种呈现CD23表达。如在下表1中所示，SKW和SB细胞中的CD23表达大致相当，而Raji细胞显示出仅微弱水平的抗原表达，相当于在SKW细胞中表达的CD23水平的10％。
除了测定CD23表达水平外，还测定相同的细胞系以确立其对抗CD23抗体诱导的凋亡的易感性水平。具体地说，使用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3试验测定在6种细胞系的每一种中的凋亡诱导。
本领域技术人员将理解天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3试验测量天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3酶的活化，这是凋亡诱导性死亡的关键早期事件。在本实施例中，将SKW细胞以0.5×106细胞/ml的密度在培养基(RPMI-2％FBS)中与10ug/ml的IDEC-152一起在细胞培养管中置于冰上于4℃培养。培养1小时后，通过离心去除培养基中未结合的抗体。将细胞重悬于适宜体积的生长培养基中，并加入24孔组织培养板(1.5×106细胞/孔)，添加或不添加山羊抗人Ig-Fcγ特异性二抗(15μg/ml)作为交联剂。培养18小时后，收获细胞并通过流式细胞仪分析凋亡。具体地说，清洗细胞并使用Cytofix(Cytofix/CytopermTM试剂盒，Pharmingen Cat # 2075KK)于4℃固定。固定20分钟后，清洗细胞并加入15μl亲和纯化的PE缀合的多克隆兔抗天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3抗体(PharmingenCat.#67345)和50μl Cytoperm。将细胞置于冰上在暗处培养30分钟。培养之后，将细胞洗一次并重悬于Cytoperm wash中。在FACScan上获取流式细胞仪数据，并使用来自Verity Software House的WinList软件进行分析。结果见下表1。
表1在CD23+B淋巴瘤细胞系中诱导凋亡

上述结果显示那些表达高水平CD23的细胞系在暴露于与CD23交联的抗体后将经历编程性细胞死亡。相反，不高水平表达CD23的细胞不经历广泛的凋亡。因此，本实施例提供了对可作为CD23+B细胞恶性肿瘤临床相关模型(例如SKW细胞和SB细胞)的所选择细胞系的鉴定。
实施例2CD23在CLL细胞中的表达为了证实本发明的临床实用性，通过流式细胞仪在全血中测定几个不同CLL样本(31名患者)上的CD23表达。使用适宜的试剂，基本上如实施例1中所述进行流式细胞分析。在此方面，在CD19+阳性的分选细胞上测定CD20和CD23表达。具体地说，分别使用PE标记的抗CD20(BD Biosciences/Pharmingen，Cat # 555623)和抗CD23(BDBiosciences/Pharmingen，Cat # 33615X)单克隆抗体来检测CD20和CD23分子。
在所有患者中，在CD19+B细胞中均检测到CD20和CD23抗原的表达，如以下表2所示。表达高CD20水平的患者在其CLL样本中表达不同程度的CD23抗原。所述表达水平通过CD19+细胞的百分比和平均荧光强度(MFI)来确定。然而，即使在表达低水平CD20的患者中，测量值显示可表达相对高水平的CD23。这些发现表明，CD23抗原可证实是治疗相关抗体如本发明所公开的那些抗体的极有吸引力的靶标。
表2CLL患者B-CLL细胞中CD23和CD20的表达

实施例3IDEC-152与CD23+细胞的结合为了进一步证实本发明的优点，如前面的实施例中所述，通过流式细胞仪测定IDEC-152与SKW淋巴瘤细胞上CD23的结合活性。如上所述，SKW细胞可用于提供CD23+恶性肿瘤包括CLL的临床相关模型。测定结果见图1，其显示了Rituxan和IDEC-152与SKW细胞以浓度依赖性方式的特异性结合。使用平均荧光强度衡量结合活性，其显示SKW细胞结合实质上比抗CD20抗体更高水平的抗CD23抗体。这表明，在某些细胞系和肿瘤中，CD23可能呈现出比其它标记如CD20更高的表位密度。正如所预期的，无关特异性的同种型匹配对照抗体(CE9.1，针对CD4)不与SKW结合。该实施例，以及在图1中所示的相应结果，证实了使用CD23作为治疗性抗体的靶在治疗所选择肿瘤中的理想性。
实施例4IDEC-152在CD23+细胞中介导ADCC活性测定了IDEC-152介导肿瘤细胞的ADCC的能力。在ADCC测定中，淋巴瘤细胞(SKW或SB)和活化的人外周单核细胞(PBMC)分别用作靶细胞和效应细胞。利用Histopaque(Sigma-Aldrich Corp.，St.Louis，MO)从健康供体的全血分离PBMC。将PBMC以5×106细胞/ml的浓度于完全培养基中与20U/ml重组人IL-2(Invitrogen，Carlsbad，CA)在75cm2组织培养瓶中于37℃和5％CO2条件下培养。过夜培养之后，于37℃和5％CO2用150μCi的51Cr(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)标记1×106SKW或SB靶细胞1小时。将细胞洗4次并重悬于5ml完全培养基中；取50μl细胞悬液分入含有等体积测试或对照抗体的各孔中。
Rituximab(Lot E9107A1)或IDEC-152(Lot ZC 152-02)用作测试抗体。无关特异性的同种型(IgGl)匹配的CE9.1(Lot M2CD4156)用作对照。所有孔一式三份平板接种到96孔圆底组织培养板中。收获效应细胞，用完全培养基洗一次，并向每孔加入在100μl体积中的1×106细胞，以获得50∶1的效应细胞∶靶之比。以下对照孔也一式三份包括在内与100μl完全培养基一起培养的靶细胞，以测定自发释放；和与100μl 0.5％Triton X-100(Sigma-Aldrich Corp.)一起培养的靶细胞，以测定最大释放。将培养物于37℃和5％CO2培养4小时，通过γ计数器(ISODATA)测定由于细胞溶解在培养上清中释放的51Cr。细胞毒性表示为特异性溶胞百分比并计算如下 图2显示该测定的结果，更具体地说，IDEC-152和Rituxan对CD20+/CD23+SKW细胞的ADCC活性。IDEC-152和Rituxan均显示出对SKW细胞的剂量依赖性杀伤，分别在10μg/ml和1μg/ml抗体浓度实现最大杀伤为75％，表明Rituxan比IDEC-152在介导该特定细胞系中的ADCC方面更有效。然而，在图1中显示的抗体结合活性提示IDEC-152与Rituxan之间的效力差异并不完全与抗体结合效率或CD23和CD20的表位密度相关。如所预期的，对于同种型匹配的人CE9.1对照抗体，仅观察到背景水平(＜10％)的ADCC(未显示)。
实施例5IDEC-152与Rituxan协同介导ADCC活性为了证实本发明与不同抗体的协同性方面，研究IDEC-152与Rituxan的组合有关ADCC介导的体外肿瘤杀伤。将SKW细胞与两个浓度(0.625μg/ml & 2.5μg/ml)的IDEC-152本身或IDEC-152与不同浓度Rituxan的组合一起培养。单独的相同浓度Rituxan用作对照。基本上如实施例4中所述测定所产生的对肿瘤细胞的ADCC活性，结果见图3A(0.625μg/ml IDEC-152) & 3B(2.5μg/ml IDEC-152)。
该测定的结果显示IDEC-152与Rituxan的组合增加了ADCC活性，超过用单独任一种物质实现的活性。更具体地说，图3A显示了所述抗体的组合在Rituxan的所有浓度下产生比单独IIDEC-152或Rituxan实质上更高水平的细胞溶解。相反，如图3B中所示，IDEC-152是非常有效的ADCC介导物，以至于在较高浓度下(即2.5μg/ml)，任何潜在的协同效应都被抗CD23抗体所覆没。即，如图3B所示，在IDEC-152或Rituxan的高浓度下，未观察到细胞毒性的改变。该实施例图示了本发明能显著增加已证实的化疗剂如Rituxan的有效性。
实施例6IDEC-152在CD23+肿瘤细胞中诱导凋亡已显示了本发明可用于有效介导ADCC活性和溶解肿瘤细胞，对抗CD23抗体进行检查以确定它们可用于在恶性细胞中诱导凋亡的程度。在此方面，下表3显示了基本上如实施例1中所述通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活化试验测定的凋亡。使用对数标度的平均荧光强度(MFI)，在4和24小时记录了凋亡百分比。
表3在SKW细胞中IDEC-152(p5E8)引起的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活化

(a)具有天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活性的阳性细胞％及其对数标度的平均荧光强度如在上表3中可见，在IDEC-152(p5E8γ1)存在下生长的SKW细胞不显示实质性的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活化。但是，IDEC-152和Rituxan在SKW细胞表面上的交联导致天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活化增加。相比之下，加入无关特异性的同种型匹配对照抗体(CE9.1)的培养物不显示任何凋亡。这证实了早先的结果，其显示本发明的抗体可用于在肿瘤细胞中诱导凋亡。
实施例7效应细胞上的Fc受体可诱导抗体的交联如上所述，本发明抗体的交联增强其诱导肿瘤细胞凋亡的能力。在体内诱导凋亡的一种机制可通过多种效应细胞上的Fc受体介导。因此，在本实施例中，表达Fc受体的细胞被用于在体外交联IDEC-152并增加凋亡诱导。
简而言之，将培养基(RPMI-2％FCS)中1×106细胞/ml密度的SKW细胞与10μg/ml的IDEC-152(p5E8)或Rituxan(C2B8)抗体于4℃在细胞培养管中培养。培养1小时后，通过离心去除培养基中未结合的抗体。将细胞重悬于适宜体积的生长培养基中，加入24孔组织培养板(2×106细胞/孔)，接种表达人Fc受体(FcγRI)的CHO细胞(1×105)过夜，并在5％CO2中于37℃培养。培养后在不同的时间点，收获细胞并通过基于流式细胞分析的Tunel测定(BD Pharmingen，Cat # 6536KK)分析凋亡。将理解Tunel测定测量DNA断裂，这是在凋亡性死亡晚期发生的事件。在Becton-Dickinson FACScan上使用FACScanRearch Software package进行流式细胞分析，使用WinList Softwarepackage(Variety Software House)进行最终数据分析。凋亡阳性细胞的百分比测定为高于背景(自身荧光)呈阳性的分选细胞百分比。与RF2(IgG1)培养的细胞用作试验的阴性对照。这些测量的结果如下表4中所示。
R5bis CF2CHF2

剂型/应用本发明的化合物一般与农业上适宜的载体一起作为剂型或组合物来应用，适宜的载体包括至少一种液体稀释剂、固体稀释剂或表面活性剂。剂型或组合物成分的选择应与活性成分的物理性质、应用方式和环境因素例如土壤类型、湿度与温度相一致。有用的剂型包括液新机制的进一步证据，通过该机制本发明可用于消除有需要的患者的肿瘤细胞。
实施例9在不同时间点IDEC-152在CD23+细胞中诱导凋亡为了进一步阐明与本发明相关的机制，在不同时间点测量SKW细胞中的凋亡进展。
将在培养基(RPMI-2％FBS)中密度为1×106细胞/ml的SKW细胞与10μg/ml的p5E8(IDEC-152)或C2B8(Rituxan)抗体一起于4℃在细胞培养管中培养。培养1小时后，通过离心去除培养基中未结合的抗体。将细胞重悬于适宜体积的生长培养基中并加入24孔组织培养板(2×106细胞/孔)，加入或不加山羊抗人IgG特异性二抗(50μg/ml)以提供交联。培养后在不同时间点，收获细胞，通过实施例7中所述的基于流式细胞分析的Tunel测定分析凋亡。该测定的结果如图5所示。
如本文之前所述的实施例，图5显示了p5E8(IDEC-152)和Rituxan与抗Igγ特异性二抗的交联大大增加了CD23+SKW细胞的凋亡。有意思的是，尽管凋亡程度似乎随时间而下降，其保持显著2整天。如所预期的，在与RF2和二抗或单独二抗一起培养的细胞中未观察到实质性的凋亡。
实施例10IDEC-152与Rituxan协同在CD23+细胞中诱导凋亡本发明其它意外的优点包括抗CD23抗体能增加多种化疗剂包括生物制品如Rituxan的有效性。本实施例用于例示这种优点。
更具体地说，本实施例显示递增浓度的抗CD23抗体，单独或与Rituxan相结合，对SKW细胞的凋亡作用。基本上如实施例8中所述使用天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3试验，将交联的抗CD23抗体和Rituxan与SKW细胞一起培养。在第一个试验中，IDEC-152和Rituxan的浓度均增加，并测定各单独抗体的凋亡活性。在第二个试验中，将固定浓度的IDEC-152与多种浓度的Rituxan相结合以阐明任何协同效应。所述试验分别如图6A和图6B所示。
从图6A和图6B可见，在与山羊F(ab’)2抗人IgG(GaHIg)交联后IDEC-152和Rituxan均在SKW细胞中诱导凋亡。具体地说，图6A显示IDEC-152在约1μg/ml的水平诱导40％-50％凋亡，而Rituxan则表现出稍低的活性。除了各抗体的活性之外，图6B显示向固定浓度的IDEC-152(0.1μg/ml)加入递增量的Rituxan增加凋亡活性超过单独任何一种抗体。在此方面，以10μg/ml浓度向IDEC-152加入Rituxan提供约45％的凋亡率。观察到的这一协同效应大大强调了本发明的优点。
实施例11IDEC-152增加CD23+细胞中Rituxan介导的凋亡再进行一项试验以证实在实施例10中看到的有关SKW细胞凋亡的协同效应，其得自抗CD23抗体与抗CD20抗体的组合。
在本实施例中，将SKW细胞以0.5×106细胞/mL的密度与递增浓度的IDEC-152、Rituxan或这两者的组合一起于冰上培养。1小时后，沉淀细胞并重悬于2％FCS RPMI和15ug/mL山羊F(ab’)2抗人IgG中进行交联。于37℃培养18小时后，如实施例1中所述通过天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3试验测定凋亡。结果如图7所示。
图7明确说明了抗CD23抗体如IDEC-152与抗CD20抗体如Rituxan的组合在恶性细胞系中提供增加的凋亡。甚至在IDEC-152相对低浓度(即0.1μg/ml)下，凋亡率也约为与单独Rituxan培养的细胞的两倍。图7还显示，在IDEC-152更高浓度下该效应增强。
实施例12IDEC-152与阿霉素协同在CD23+细胞中诱导凋亡为了证实本发明的多用性和广泛适用性，进行试验以显示本发明的方法可适用于多种化疗剂。更具体地说，本实施例证实了抗CD23抗体可有效用于增强临床上批准的化疗剂(此处为阿霉素)的效力。
使用基本上与实施例11中所述相同的方法进行本试验，除了将阿霉素与IDEC-152相组合使用而不是Rituxan。处方级的阿霉素RDF(盐酸阿霉素-NDC 0013-1086-91)获自Pharmacia and Upjohn。将多种浓度的阿霉素与3种不同浓度的IDEC-152相组合，使用如实施例1中所述的基于流式细胞分析的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3试验，测定在SKW细胞中所产生的凋亡率。结果如图8所示。
图8图示了加入IDEC-152大大增加了阿霉素在图上所有浓度的凋亡有效性。这些协同效应在相对低的阿霉素浓度(10-7M)得到显著证实，在这种情况下，加入少至0.1μg/ml的IDEC-152增加细胞凋亡百分比至约70％，而无IDEC-152存在时，凋亡低于20％。本领域技术人员将理解这是显著的改善并可能会反映在临床效力中。
实施例13IDEC-152与氟达拉滨协同在CD23+细胞中诱导凋亡在另一项对本发明的多用性的证实中，重复在实施例12中所述的试验，采用广泛使用的化疗剂氟达拉滨代替阿霉素。处方级的Fludara(磷酸氟达拉滨-NDC 504-19-511-06)获自Berlex Corporation。基本上如实施例12中所述获得结果并绘于图9中。
由图9清楚可见，与单独的氟达拉滨相比，本发明的方法和组合物可用于大大增加SKW细胞中的凋亡率。在此方面，向10-5M氟达拉滨溶液中加入少至0.1μg/ml的IDEC-152将凋亡率从低于20％增加至大于50％。如实施例12，本实施例清楚验证了本发明对于临床上有用的化疗剂的有效性。
实施例14抗CD23抗体在B-CLL细胞中诱导凋亡如本文所述，本发明的方法和组合物可应用于多种恶性肿瘤，包括在优选的实施方案中的CLL。为了直接证实本发明在治疗CLL中的有效性，测定抗CD23抗体在这种细胞中诱导凋亡的能力。
用标准方法通过Ficoll梯度从CLL患者供体的血液中分离外周血单核细胞(PBMC)。使用台盼蓝排斥试验测定细胞存活，为接近100％，用新鲜CLL细胞进行所有试验。通过流式细胞仪分析细胞表型(CD19，CD20和CD23表达)。将来自CLL患者的白血病细胞(0.5-1×106细胞/ml)与p5E8(10ug/ml)或对照抗体(CE9.1，抗CD4抗体)于冰上培养。培养1小时后，将细胞旋转沉淀下来以除去未结合的抗体，并以1×106细胞/ml重悬于生长培养基(5％FCS-RPMI)中，在组织培养管中培养。通过以15μg/ml掺加山羊抗人Ig-Fcγ特异性抗体的F(ab’)2片段交联细胞表面结合的抗体，培养物于37℃温育，直至进行凋亡测定。在此方面，下表5显示了通过基本上如实施例1中所述的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活化试验测定的凋亡。在4和24小时用对数标度的平均荧光强度(MFI)记录了凋亡百分比。
表5IDEC-152(p5E8)对来自CLL患者的B-CLL细胞的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3活化

本实施例明确显示了本发明的方法和组合物在触发基于白血病的肿瘤中的编程性细胞死亡方面有效。
实施例15IDEC-152和Rituxan在CLL细胞中诱导凋亡已显示了CD23拮抗剂如IDEC-152在CLL细胞中诱导凋亡的能力，进行另外的试验来确定拮抗剂本身和与生物性化疗剂(Rituxan)相组合的效力如实施例4，对来自CLL患者的白血病细胞(1×106细胞/ml)进行表型分析，并与多种浓度的IDEC-152或IDEC-152和Rituxan于冰上培养。培养1小时后，将细胞旋转沉淀下来以除去未结合的抗体，并重悬于生长培养基(2％FCS-RPMI)中，培养24孔板。通过以15μg/ml掺加山羊抗人Ig-Fcγ特异性抗体的F(ab’)2片段交联细胞表面结合的抗体，培养物于37℃温育18小时，然后使用如实施例1中所述的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶试验进行凋亡测定。结果如图10A和图10B所示。
图10A证实了实施例14中所看到的结果，即CD23拮抗剂如IDEC-152可用于在白血病细胞中诱导凋亡。在1μg/ml，IDEC-152在大约30％CLL细胞中有效地诱导了凋亡。图10B显示，尽管IDEC-152以其本身独自可在CLL细胞中诱导凋亡，该作用可通过加入Rituxan而增强。更具体地说，图10B显示了加入不同浓度的Rituxan大大增加了在所测试的3个浓度IDEC-152下经历凋亡的细胞百分比。观察到的这一协同作用进一步强调了本发明的潜在临床效力。
实施例16IDEC-152和氟达拉滨在CLL细胞中诱导凋亡在另一项对本发明有用性的证实中，CD23拮抗剂与常用的化疗剂氟达拉滨相组合使用，在CLL细胞中诱导凋亡。
如前所述从CLL患者获得纯化的B细胞并进行加工处理。处方级的Fludara(磷酸氟达拉滨-NDC 504-19-511-06)获自BerlexCorporation。基本上如实施例15中所述，用不同剂量的单独IDEC-152，单独氟达拉滨或这两者的组合处理细胞。通过如实施例1中所述的基于流式细胞分析的天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶3试验检测凋亡百分比。
本试验的结果呈现于图11，表明尽管IDEC-152和氟达拉滨均表现出一定的剂量依赖性诱导凋亡，这两种化合物的组合显著增加了编程性细胞死亡率。这些数据表明IDEC-152，单独或于其它药剂相组合，在治疗可能已对氟达拉滨或其它化疗剂复发的患者方面可能有效。
实施例17IDEC-152在体内的抗肿瘤活性在证实了本发明的CD23拮抗剂在体外多种肿瘤细胞中介导ADCC和凋亡活性方面有效后，进行试验以显示所述拮抗剂可在体内杀伤恶性细胞。更具体地说，由于CD23抗原在人CLL患者中以高密度表达，并经常在B细胞NHL患者中以不同的抗原密度表达，有兴趣确定CD23拮抗剂，单独或与化疗剂相组合，是否可在动物模型中介导抗肿瘤应答。
在人B淋巴瘤/SCID小鼠模型中测定IDEC-152的抗肿瘤活性，所述模型在本领域中常用，并可预测临床成功。对动物静脉内注射SKW细胞(CD20+，CD23+)。将SKW细胞(4×106存活，在100μl HBSS缓冲液中)注射(iv)入6-8周龄雌性CB17 SCID小鼠的尾静脉中。接种肿瘤后1天，对小鼠注射(ip)IDEC-152(在200μl HBSS缓冲液中)。每2天重复治疗，总共6次MAb注射(Q2d×6)。有10只动物用于各治疗和对照(未治疗，注射200μl HBSS缓冲液)组。观察动物的疾病征象，并监测存活。所有显示出疾病征象的小鼠在死亡前发生瘫痪形式。处死在观察期间死亡的小鼠或双腿均发生严重瘫痪并伴有呼吸困难的小鼠，记为死亡。使用Statistical Analysis System(SAS)进行Kaplan-Meier分析，通过Log-rank检验生成p值。结果如图12所示。
图12清楚显示，与未治疗的对照相比，本发明的CD23拮抗剂延迟了小鼠中的肿瘤生长，并导致存活显著增加。具体地说，在所有测试剂量(100，200和400μg抗体/注射)，携带肿瘤的动物比未治疗的对照存活增加，由此证实了抗肿瘤活性。在两个较高的剂量，治疗组中50％的动物在第46天仍存活，而此时所有对照动物均死亡。值得注意的是，当在最后一只对照动物死亡后20天试验结束时(即第66天)，在这些组中30％的受治疗动物仍存活。这些结果是有关本发明化合物单独使用时的效力的重要证据。
实施例18IDEC-152与Rituxan协同诱导抗肿瘤活性已证实了CD23拮抗剂单独使用时是极有效的杀肿瘤剂，再进行试验以探究这种化合物与已证实的化疗剂一起合作的有效性。为此，使用如实施例17中所述的SKW/SCID小鼠模型，测试本发明的CD23拮抗剂与Rituxan相组合。对于此试验，接种肿瘤之后在预先确定的时间向小鼠注射(ip)在200ul HBSS缓冲液中的IDEC-152、Rituxan或IDEC-152加Rituxan。试验结果如图13所示。
图13显示IDEC-152加Rituxan的抗肿瘤活性大于各测试抗体单独的抗肿瘤活性(p≤0.01)。使用相同的给药方案，IDEC-152和Rituxan的组合明显优于各单独单克隆抗体的抗肿瘤活性。这由以下事实证明在第68天，在联合抗体治疗组中动物存活率为60％，相比之下，在IDEC-152组中有20％存活，在Rituxan组中有30％存活。值得注意的是，在组合组10动物中有6只在第68天实现无病，此时距最后一只未治疗动物死亡已超过20天。此外，在接受每次注射200ug的IDEC152/Rituxan的小鼠中观察到的肿瘤应答比接受每次注射400ug单独的IDEC152的小鼠要强，提示联合治疗的协同反应。总的来说，至第46天这些结果清楚表明了CD23拮抗剂加Rituxan的组合可提供协同性抗肿瘤应答，针对在播散疾病的小鼠异种移植物模型中的人恶性肿瘤。
本领域技术人员将进一步理解本发明可以以其它具体的形式实施而不偏离其实质或中心特质。本发明的前述说明书仅仅公开了其示例性的实施方案，应理解也可以想到其它改变在本发明的范围之内。因此，本发明并不限于本文详细描述的特定实施方案，而是应参照所附的权利要求，其表明了本发明的范围和内容。
权利要求
1.治疗需要治疗的哺乳动物中的肿瘤性疾病的方法，包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的CD23拮抗剂。
2.权利要求1的方法，其中所述CD23拮抗剂选自CD23反应性多肽，CD23反应性肽，CD23反应性小分子，及其组合。
3.权利要求2的方法，其中所述CD23反应性多肽包括单克隆抗体或多克隆抗体。
4.权利要求3的方法，其中所述CD23反应性多肽包括单克隆抗体。
5.权利要求4的方法，其中所述单克隆抗体选自嵌合抗体和人源化抗体。
6.权利要求5的方法，其中所述单克隆抗体是嵌合抗体，且所述嵌合抗体是灵长类动物源化的。
7.权利要求6的方法，其中所述灵长类动物源化的抗体是IDEC-152。
8.权利要求7的方法，其中所述肿瘤性疾病选自复发性霍奇金病；耐药的霍奇金病；高分级、低分级和中间级的非霍奇金淋巴瘤；B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)；浆细胞样淋巴细胞性淋巴瘤(LPL)；套细胞淋巴瘤(MCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)；弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)；伯基特淋巴瘤(BL)；AIDS相关性淋巴瘤；单核细胞性B细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞淋巴结病；小淋巴细胞、滤泡性弥漫性大细胞、弥漫性小分裂细胞、大细胞免疫母细胞成淋巴细胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、滤泡性大细胞为主、滤泡性小分裂细胞为主和滤泡性小分裂细胞和大细胞混合的淋巴瘤。
9.权利要求8的方法，其中所述肿瘤性疾病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。
10.权利要求1的方法，其中所述肿瘤性疾病选自复发性霍奇金病；耐药的霍奇金病；高分级、低分级和中间级的非霍奇金淋巴瘤；B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)；浆细胞样淋巴细胞性淋巴瘤(LPL)；套细胞淋巴瘤(MCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)；弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)；伯基特淋巴瘤(BL)；AIDS相关性淋巴瘤；单核细胞性B细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞淋巴结病；小淋巴细胞、滤泡性弥漫性大细胞、弥漫性小分裂细胞、大细胞免疫母细胞成淋巴细胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、滤泡性大细胞为主、滤泡性小分裂细胞为主和滤泡性小分裂细胞和大细胞混合的淋巴瘤。
11.权利要求10的方法，其中所述肿瘤性疾病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。
12.权利要求1的方法，其中所述CD23拮抗剂与细胞毒性剂相结合。
13.权利要求12的方法，其中所述细胞毒性剂是放射性同位素。
14.权利要求1的方法，还包括施用化疗剂的步骤。
15.权利要求14的方法，其中所述化疗剂包括抗体。
16.权利要求15的方法，其中所述抗体与CD19，CD20，CD22，CD40，CD40L，CD52或B7反应或结合。
17.权利要求14的方法，其中所述化疗剂包括氟达拉滨。
18.治疗哺乳动物中的肿瘤性疾病的方法，包括以下步骤向所述哺乳动物施用治疗有效量的至少一种化疗剂；和向所述患者施用治疗有效量的至少一种CD23拮抗剂，其中所述化疗剂和所述CD23拮抗剂可以以任何次序或同时施用。
19.权利要求18的方法，其中所述CD23拮抗剂选自CD23反应性多肽，CD23反应性肽，CD23反应性小分子，及其组合。
20.权利要求19的方法，其中所述CD23反应性多肽包括单克隆抗体或多克隆抗体。
21.权利要求20的方法，其中所述CD23反应性多肽包括单克隆抗体。
22.权利要求21的方法，其中所述单克隆抗体选自嵌合抗体和人源化抗体。
23.权利要求22的方法，其中所述单克隆抗体是IDEC-152。
24.权利要求18的方法，其中所述化疗剂包括抗体。
25.权利要求24的方法，其中所述抗体与CD19，CD20，CD22，CD40，CD40L，CD52或B7反应或结合。
26.权利要求18的方法，其中所述肿瘤性疾病选自复发性霍奇金病；耐药的霍奇金病；高分级、低分级和中间级的非霍奇金淋巴瘤；B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)；浆细胞样淋巴细胞性淋巴瘤(LPL)；套细胞淋巴瘤(MCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)；弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)；伯基特淋巴瘤(BL)；AIDS相关性淋巴瘤；单核细胞性B细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞淋巴结病；小淋巴细胞、滤泡性弥漫性大细胞、弥漫性小分裂细胞、大细胞免疫母细胞成淋巴细胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、滤泡性大细胞为主、滤泡性小分裂细胞为主和滤泡性小分裂细胞和大细胞混合的淋巴瘤。
27.权利要求18的方法，其中所述肿瘤性疾病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。
28.治疗需要治疗的哺乳动物中的B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)的方法，包括向所述哺乳动物施用治疗有效量的CD23拮抗剂。
29.权利要求28的方法，其中所述CD23拮抗剂选自CD23反应性多肽，CD23反应性肽，CD23反应性小分子，及其组合。
30.权利要求29的方法，其中所述CD23反应性多肽包括单克隆抗体或多克隆抗体。
31.权利要求30的方法，其中所述CD23反应性多肽包括单克隆抗体。
32.权利要求31的方法，其中所述单克隆抗体选自嵌合抗体和人源化抗体。
33.权利要求32的方法，其中所述单克隆抗体是IDEC-152。
34.权利要求28的方法，还包括施用化疗剂的步骤。
35.权利要求32的方法，其中所述化疗剂包括抗体。
36.权利要求35的方法，其中所述抗体与CD19，CD20，CD22，CD40，CD40L，CD52或B7反应或结合。
37.权利要求34的方法，其中所述化疗剂包括氟达拉滨。
38.治疗哺乳动物中的肿瘤性疾病的方法，包括以下步骤向所述哺乳动物施用治疗有效量的Rituxan；和向所述哺乳动物施用治疗有效量的IDEC-152，其中所述Rituxan和所述IDEC-152可以以任何次序或同时施用。
39.权利要求38的方法，其中所述肿瘤性疾病选自复发性霍奇金病；耐药的霍奇金病；高分级、低分级和中间级的非霍奇金淋巴瘤；B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)；浆细胞样淋巴细胞性淋巴瘤(LPL)；套细胞淋巴瘤(MCL)；滤泡性淋巴瘤(FL)；弥漫性大细胞淋巴瘤(DLCL)；伯基特淋巴瘤(BL)；AIDS相关性淋巴瘤；单核细胞性B细胞淋巴瘤；血管免疫母细胞淋巴结病；小淋巴细胞、滤泡性弥漫性大细胞、弥漫性小分裂细胞、大细胞免疫母细胞成淋巴细胞瘤；小未分裂、伯基特和非伯基特、滤泡性大细胞为主、滤泡性小分裂细胞为主和滤泡性小分裂细胞和大细胞混合的淋巴瘤。
40.权利要求38的方法，其中所述肿瘤性疾病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。
41.诱导恶性细胞凋亡的方法，包括使所述恶性细胞接触凋亡诱导量的CD23拮抗剂。
42.权利要求41的方法，其中所述CD23拮抗剂选自CD23反应性多肽，CD23反应性肽，CD23反应性小分子，及其组合。
43.权利要求41的方法，其中所述CD23反应性多肽包括单克隆抗体或多克隆抗体。
44.权利要求43的方法，其中所述CD23反应性多肽包括单克隆抗体。
45.权利要求44的方法，其中所述单克隆抗体选自嵌合抗体和人源化抗体。
46.权利要求44的方法，其中所述单克隆抗体是IDEC-152。
47.权利要求41的方法，还包括使所述恶性细胞接触化疗剂的步骤。
48.权利要求47的方法，其中所述化疗剂包括抗体。
49.权利要求48的方法，其中所述抗体与CD19，CD20，CD22，CD40，CD40L，CD52或B7反应或结合。
50.权利要求41的方法，其中在体内接触所述恶性细胞。
51.用于治疗患有或倾向于患肿瘤性疾病的哺乳动物的药盒，包括至少一个容器，其中存放有CD23拮抗剂；和标签或插页，指示所述CD23拮抗剂可用于治疗所述肿瘤性疾病。
52.权利要求51的药盒，其中所述肿瘤性疾病是B细胞慢性淋巴细胞白血病(B-CLL)。
53.权利要求51的药盒，其中所述CD23拮抗剂是单克隆抗体。
54.权利要求53的药盒，其中所述单克隆抗体是IDEC-152。
全文摘要
本发明提供了用于治疗肿瘤性疾病的方法和药盒，包括使用CD23拮抗剂。所述CD23拮抗剂可以单独或与化疗剂相组合使用。在特别优选的实施方案中，所述CD23拮抗剂可以用于治疗B细胞慢性淋巴细胞白血病(B－CLL)。
文档编号A61K45/00GK1494433SQ02805771
公开日2004年5月5日 申请日期2002年1月31日 优先权日2001年1月31日
发明者K·哈里哈兰, N·翰纳, G·R·布拉斯劳斯克, N·帕圣, K 哈里哈兰, 布拉斯劳斯克 申请人:Idec药物公司