专利名称：Vero细胞流行性感冒纯化疫苗的制备方法及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属于预防用新生物制品新型疫苗领域，涉及一种人用Vero细胞流行性感冒(以下简称流感)纯化疫苗的制备方法及其制品在预防流感中的应用内容。
背景技术：
流感是流行性感冒的简称，通常由甲、乙、丙三个不同型别流感病毒引起的急性呼吸道传染病，是最具有传染性的传染病之一，其特点是爆发突然、蔓延迅速、波及面广、死亡率高，对人群危害最大的是甲型和乙型流感病毒。流行期影响学校及公共服务机构的正常工作，严重时可导致学校停课、工厂停工。例如，1918-1919年的西班牙流感大流行时曾横扫欧洲，因此导致死亡的人数超过了第一次世界大战的死亡人数之和。据WHO最新统计，全球平均每年有1/10的成人和1/3的儿童要感染一次流感。目前唯一有效的预防流感的手段就是接种疫苗。而我国现在使用的流感疫苗有两类一类为进口疫苗，如法国的“凡而灵VAXIGRIP”，德国的“福禄立适”等，由于其价格昂贵，部分群众难以接受；另一类为国产疫苗，价格虽然比进口疫苗便宜，但其生产工艺是用鸡胚和动物细胞为基质，故存在异质成份多、副作用大、效价低、生产工艺复杂、质量不易控制、产量有限等诸多缺点。随着改革开放发展，人民文化生活水平的提高和国际交流的日益频繁，极其需要更安全、有效，质量更高的疫苗以充分满足国内外防病需要。因此，原工艺生产的疫苗需要用其他较先进工艺生产的疫苗替代。我公司通过三年的努力，从Vero细胞库的建立、病毒在Vero细胞中增殖的生产工艺和质量标准的制定、实施等一系列研究到连续研制三批上述纯化疫苗，完成了全部的临床前研究，各项结果指标均符合WHO和我国有关疫苗的质量标准。
发明内容
本发明的关键是有一个好的疫苗基质，即Vero细胞培养系统，并且通过独特的方法使病毒在基质中增殖，并产生高滴度抗原，稳定易行的生产工艺流程和一整套严格完整的质量控制标准及方法。祥见说明书附图Vero细胞流行性感冒纯化疫苗生产工艺流程图本发明的目的通过以下生产工艺达到疫苗生产用Vero细胞必须经过无菌实验、致瘤实验、染色体检查和外源因子检测，合格后方能用于生产。应建立原始细胞库、主细胞库和生产细胞库。
1、Vero细胞制备(1)从工作细胞库液氮罐中取出工作细胞库细胞进行细胞复苏；(2)T150培养瓶培养扩增长成单层的细胞瓶倾去培养液，加入混合消化液(0.5％胰酶1份加verson3份)溶液，待细胞面呈毛玻璃状，中间有裂隙时，倒去消化液，加入新配制的细胞生长液，反复振摇细胞培养瓶至细胞脱落，然后以1∶3比例将细胞分种到新的T150培养方瓶中，每瓶加入30ml新配制的细胞生长液，于37℃条件下培养。
(3)3L转瓶扩增培养细胞传够量时，改成3L转瓶传代培养。用4-5个T150 Vero细胞瓶，以混合消化液消化后传1个转瓶，每瓶加入适量的细胞生长液，置37℃培养。细胞长成单层后，倾去培养液，每瓶加入100ml混合消化液，待细胞面呈毛玻璃状时，倒去消化液，加入100ml细胞生长液，稍用力振荡使细胞脱落，然后以1∶3的比例将细胞分种到新的培养瓶中，每瓶加入含10％小牛血清的细胞生长液500ml，于37℃条件下旋转培养。
2、浸泡将长成单层细胞转瓶弃去培养液，每瓶加入含适量抗生素的Hank’s乳蛋白培养液，33℃旋转培养。浸泡过液。
3、接种病毒次日弃去浸泡液，加入含促病毒增殖因子后的维持液，再将甲1型(或甲3、乙型)毒种按1∶500比例接种细胞，接种后置34℃旋转培养。
4、单价病毒液冻融、收获细胞感染72小时后，将转瓶放-20℃冻融2次，使病毒自细胞中充分释放出来。再用切向流过滤系统去除细胞碎片，澄清。(采用Millipore的0.45μmPellicon-2膜包)，并抽样做无菌试验和测定血凝滴度。同时取培养相同时间未感染病毒的对照细胞做外源因子检查。
5、病毒液的浓缩将无菌试验和血凝滴度合格的单价收获液合并，用截留分子量为100kd的Millipore Pellicon-2膜包进行浓缩。
6、病毒液灭活浓缩后样品中加入适量β-丙内酯，灭活病毒，并检测血凝效价。
7、安全试验用12-14克小白鼠进行脑腔注射，每只0.03ml，观察14天后无一死亡，再连续盲传两代，均无一死亡判为合格。
8、柱层析纯化、稀释
(1)使用Phamarcia公司生产的Sepharose 4FF进行纯化。用280nm波长检测柱后分离情况，记录结果。根据出峰情况收集第一个蛋白峰样品为单价原苗。抽样测定总蛋白含量及牛残含量。
(2)根据测定后的总蛋白含量对单价原液进行稀释。
9、合并三型原液将无菌试验、安全试验合格的三型单价灭活原液，按血凝含量比例混合即为三型疫苗原液。
10、半成品配制三型原液中加入0.2％人血白蛋白为保护剂和终浓度≤0.10mg/ml硫柳汞为防腐剂，即为半成品。抽样进行无菌检测、血凝素抗原测定、总蛋白含量测定、硫柳汞含量测定。
11、检定合格后分装安瓶，每支0.5ml，包装、入库并抽样进行成品检定。
上述Vero细胞流行性感冒纯化疫苗的工艺方法具有以下特征。
1.制备流感疫苗先进的Vero细胞培养技术以及将此细胞培养技术用于制备疫苗的甲1(A/New Caledonia/20/99(H1N1)、甲3(A/莫斯科/10/99(H2N2)和乙型(B/香港/330/2001)流感病毒株在传代的Vero细胞上增殖，获得了高滴度病毒；其病毒效价均达到1∶160以上，具有较好的免疫原性及抗原性。
2.本生产工艺建立了Vero细胞规模化培养技术，比较了各种转瓶培养的最佳条件，选择了简便经济质量易于控制的3L转瓶培养技术用于本疫苗生产。
此Vero细胞培养技术和流感病毒在此培养基质上的增殖技术可被用于Vero传代细胞为基质的疫苗生产。继而，其它的流感病毒也可用于此方法以Vero细胞为基质进行疫苗生产。
3.甲1、甲3和乙型流感毒种分别在Vero细胞上(细胞由美国ATCC引进，中国药品生物制品检定所提供，生产疫苗时所用细胞代数不超过140代)增殖，冻融后收获，合并即为原液，原液经切向流滤过(0.45μm膜板)，Pellicon 100KD超滤浓缩，Sepharose 4FF(BPG柱)纯化，β-丙内酯灭活，再经稀释、除菌，三价配伍，加保护剂、防腐剂为半成品，检定合格后，包装并进行成品检定合格而成纯化疫苗。
半成品检定(1)无菌试验阴性，合格；(2)血凝素含量测定≥12μg/株/0.5ml(3)总蛋白量测定≤300μg/0.5ml(4)硫柳汞含量测定≤0.10mg/ml成品检定(1)鉴别试验与相应的免疫血清进行单扩试验，各型的血凝素抗原应为阳性；(2)无菌试验阴性(无细菌生长)，合格；(3)异常毒性测定无异常毒性，合格；(4)过敏原测定阴性，合格；(5)血凝素含量测定每型均符合标准，均应≥12μg/株/0.5ml；(6)残余牛血清含量测定≤25ng/0.5ml(7)细胞DNA含量≤10Pg/0.5ml(8)内毒素测定≤100EU/0.5ml；(9)pH值6.8-7.8；(10)装量；0.50ml/支；
(11)外观轻微乳白色液体，无异物4.建立了本疫苗的质量控制标准特别是抗原量(血凝素)的检定，用单向辐射免疫扩散法检测，各型均不低于12μg/0.5ml。
Vero细胞流感病毒纯化疫苗在Vero传代细胞上的生产和半成品、成品的全面合理的检定内容和方法，可以被用于Vero细胞流感纯化疫苗的质量控制标准。
5.用甲1、甲3和乙型毒株生产和检定已经形成系统化，生产工艺和质量控制稳定而且合理，能确保疫苗产品的质量。Vero细胞流感病毒纯化疫苗在Vero细胞上的全面、系统、合理稳定的生产工艺流程及质量控制标准，可以被用于作为Vero细胞流感纯化疫苗的制造和检定规程。
6.Vero细胞流感病毒纯化疫苗由于使用了切向流滤过可去除细胞碎片和更多的杂质，同时根据检测标准可以人为主动控制病毒蛋白和抗原量，因而本疫苗具有效价高、副作用小、质量易控制、操作不复杂，并降低了生产成本达到了安全、有效的目的。使用本生产技术生产的Vero细胞流感纯化疫苗避免了疫苗生产、纯化形成制品时来自人或者动物附加的蛋白质、原材料的污染。比目前我国已上市使用的流感疫苗具有更好的免疫效果和安全性，其中包括大大减轻的变态反应等。因而具有良好的社会效益和较大的经济效益。
7.Vero细胞流行性感冒纯化疫苗在预防流感中予以应用，其特征是全程免疫只需一针0.5ml，皮下接种，能产生良好的免疫力。
附图为Vero细胞流行性感冒纯化疫苗生产工艺流程图
权利要求
1.Vero细胞流行性感冒纯化疫苗其特征在于(1)制备该疫苗的先进的Vero细胞培养技术以及用此细胞培养技术将用于制备疫苗的甲1(A/New Caledonia/20/99(H1N1)、甲3(A/莫斯科/10/99(H3N2)和乙型(B/香港/330/2001)流感病毒株在传代的Vero细胞上增殖，获得了高滴度病毒；其病毒效价均达到1∶160以上，具有较好的免疫原性及抗原性。(2)本生产工艺建立了Vero细胞规模化培养技术，比较了各种转瓶培养的最佳条件，选择了简便经济质量易于控制的3L转瓶培养技术用于本疫苗生产。(3)甲1、甲3和乙型流感毒种分别在加入促病毒繁殖因子的Vero细胞上(细胞由美国ATCC引进，中国药品生物制品检定所提供，生产疫苗时所用细胞代数不超过140代)增殖，冻融后收获，合并即为原液，原液经切向流滤过(0.45μm膜板)，Pellicon 100KD超滤浓缩，Sepharose 4FF(BPG柱)纯化，β-丙内酯灭活，再经稀释、除菌，三价配伍，加保护剂、防腐剂为半成品，检定合格后，分装安瓶并进行成品检定，合格后包装成纯化疫苗。半成品检定a.无菌试验阴性，合格；b.血凝素含量测定≥12μg/株/0.5mlc.总蛋白量测定≤300μg/0.5mld.硫柳汞含量测定≤0.10mg/ml成品检定a.鉴别试验与相应的免疫血清进行单扩试验，各型的血凝素抗原应为阳性；b.无菌试验阴性(无细菌生长)，合格；c.异常毒性测定无异常毒性，合格；d.过敏原测定阴性，合格；e.血凝素含量测定每型均符合标准，均应≥12μg/株/0.5ml；f.残余牛血清含量测定≤25ng/0.5mlg.细胞DNA含量≤10Pg/0.5mlh.内毒素测定≤100EU/0.5ml；i.pH值6.8-7.8；j.装量0.50ml/支；k.外观轻微乳白色液体，无异物(4)建立了本疫苗的质量控制标准特别是抗原量(血凝素)的检定，用单向辐射免疫扩散法检测，各型均不低于12μg/0.5ml。(5)用甲1、甲3和乙型毒株生产和检定已经形成系统化，生产工艺和质量控制稳定而且合理，能确保疫苗产品的质量。(6)使用本生产技术生产的Vero细胞流感纯化疫苗避免了疫苗生产、纯化形成制品时来自人或者动物附加的蛋白质、原材料的污染。比目前我国已上市使用的流感鸡胚疫苗具有更好的免疫效果和安全性，其中包括大大减轻的变态反应等。因而具有良好的社会效益和较大的经济效益。(7)Vero细胞流行性感冒纯化疫苗在预防流感中予以应用，其特征是全程免疫只需一针0.5ml，皮下接种，能产生良好的免疫力。
2.根据权利要求1(1)、(2)此Vero细胞培养技术和流感病毒在此培养基质上的增殖技术可被用于Vero传代细胞为基质的疫苗生产。继而，其它的流感病毒也可用于此方法以Vero细胞为基质进行疫苗生产。
3.根据权利要求1(3)、(4)Vero细胞流感病毒纯化疫苗在Vero传代细胞上的生产和半成品、成品的全面合理的检定内容和方法，可以被用于Vero细胞流感纯化疫苗的质量控制标准。
4.根据权利要求1(5)Vero细胞流感病毒纯化疫苗在Vero细胞上的全面、系统、合理稳定的生产工艺流程及质量控制标准，可以被用于作为Vero细胞流感纯化疫苗的制造和检定规程。
5.根据权利要求1(6)Vero细胞流感病毒纯化疫苗由于使用了切向流滤过可去除细胞碎片和更多的杂质，同时根据检测标准可以人为主动控制病毒蛋白和抗原量，因而本疫苗具有效价高、副作用小、质量易控制、操作不复杂等特点，做到了即安全又有效，并降低了生产成本，达到了贵族药平民用的目的。
全文摘要
本发明属于预防用新生物制品新型疫苗领域，涉及一种人用Vero细胞流行性感冒纯化疫苗的制备方法及其制品在预防流感中的应用内容。本发明中制备Vero细胞流感纯化疫苗的方法在来源于非洲绿猴肾传代的Vero细胞上加入促病毒增殖因子后，分别感染流感甲
文档编号A61K39/145GK1511587SQ0216000
公开日2004年7月14日 申请日期2002年12月27日 优先权日2002年12月27日
发明者李忠义, 刘江秋 申请人:辽宁卫星生物制品研究所(有限公司), 李忠义, 刘江秋