专利名称：抗Pgp单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及抗Pgp(P-glycoprotein，P-糖蛋白)单克隆抗体重链和轻链可变区基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述的基因和多肽在制备用于耐药肿瘤的诊断和治疗的药物中的应用。具体地讲，本发明的重链和轻链可变区基因来自抗P-GLYCOPROTEIN(P-糖蛋白)单克隆抗体PHMA02。
背景技术：
恶性肿瘤是我国攻关的重点疾病之一。而肿瘤细胞对抗癌药物的耐受是导致临床化疗失败的主要原因。据美国癌症协会统计，美国每年约有49万例癌症患者死亡，其中90％以上肿瘤患者的死亡在不同程度上与耐药有关。肿瘤细胞对一系列结构及作用机制不同的药物产生交叉耐药的现象称为多药耐药(multidrug resistance，MDR)。产生MDR最主要的分子基础是细胞膜表面分子量为170KD的糖蛋白Pgp。Pgp依赖ATP酶提供的能量可将药物“泵”出细胞外，降低细胞内的药物浓度，表现为细胞对药物产生耐受。多种研究表明Pgp不仅与耐药相关，而且与肿瘤的侵袭、转移等生物学特性相关，所以针对Pgp这一广谱肿瘤抗原的研究具有广泛的应用前景。
抗Pgp单克隆抗体的研究已有十多年的历史，早在80年代抗Pgp抗体MRK16，JSB-1已用于耐药肿瘤的诊断。不同的抗Pgp抗体和Pgp结合的位点不同，有的结合于Pgp的胞外区(例如MRK16，UICЦ)，有的结合于胞内区(例如C219)。
单抗PHMA02是中国医学科学院血液学研究所于1999年研制成功的抗Pgp鼠源性单克隆抗体(中华血液学杂志1999.Vol 20.No.6)。制备的鼠源性单抗PHMA02特异性地结合于P-glycoprotein(P-糖蛋白)胞外区，与Pgp高表达的耐药肿瘤细胞系K562/A02及MCF-7/ADR具有较强的结合能力，而与亲代细胞株K562、MCF-7无结合能力，说明单抗PHMA02具有与多药耐药细胞特异结合的能力。
鼠源单抗作为异种蛋白应用于人体时产生的人抗小鼠抗体(human anti-mouseantibody，HAMA)反应，是限制其应用的重大缺陷。正是由于这一原因，80年代开始进行对鼠源性单抗的人源化改造。而后又通过基因操作技术制备出基因工程抗制抗体，力求在保持亲代抗体生物活性的同时，降低免疫原性。单链抗体(ScFv)是由接头(linker)将轻链可变区和重链可变区基因以两种取向(VL-Linker-VH，VH-Linker-VL)连接起来，从而可以构建具有特异性抗原结合功能的小分子片段。它具有分子量小，穿透能力强，异源性小，构建周期短，表达后的效果好，易于大量生产等优点。
发明内容
本发明的一个目的在于提供一种抗Pgp单克隆抗体轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达产物，两者重组后表达产生的抗PgpscFv片段，能降低鼠源性抗Pgp抗体的免疫原性。本发明的另一个目的在于抗PgpscFv片段在制备用于耐药肿瘤的诊断和治疗的药物中的应用。
本发明的抗Pgp单克隆抗体轻链可变区基因和重链可变区基因及其表达产物是所述的轻链可变区基因的全长为333bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO4所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示；所述的重链可变区基因的全长为375bp，其核苷酸序列如SEQ ID NO2所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO1所示；本发明利用噬菌体抗体展示技术克隆抗Pgp单克隆抗体PHMA02的轻重链可变区基因，再将其克隆到具有强启动子的PET28a(+)上，构建了表达载体PET28a(+)PGPscFv，表达产物为包涵体，经复性后能特异性的与表达Pgp抗原的K562/A02细胞相结合但并不抑制Pgp外排泵的功能。
本发明制备的抗PgpscFv片段只有针对Pgp抗原的识别功能，并无抑制作用，能作为靶向诊断治疗药物的载体和双功能抗体的一臂。
本发明的有益效果是在所有正常人类组织中均可检测到P-gp及mdr-1基因的mRNA，不同器官中的Pgp及mdr-1基因mRNA的水平相差很大，在肾脏、肝、消化道、肺等器官Pgp及mdr-1基因mRNA的水平较高，而在睾丸、卵巢、子宫、皮肤等器官处于较低水平。这些研究提示Pgp与正常细胞的分泌功能密切相关。本发明制备的抗Pgpscfv PgpscFv片段只有针对Pgp抗原的识别功能，并无抑制作用，因此应用于人体后不会干扰正常细胞的排泄分泌功能，无论是作为靶向诊断治疗的载体还是作为双功能抗体的一臂，均具有广泛的应用前景。
附图1 表达产物进行12％SDS-PAGE电泳分析图。
图中1纯化后的Pgpscfv片段，2 Marker。
附图2 表达产物进行WESTERNBLOT分析图。图中1粗提液，2流出液，3纯化后样品(未复性)，4纯化后样品(复性后)。
附图3 免疫荧光竞争实验的测定结果图之一——PBS+K562/A02。
附图4 免疫荧光竞争实验的测定结果图之二——无关蛋白(抗CD20Fab片段)+K562/A02。
附图5 免疫荧光竞争实验的测定结果图之三——抗Pgpscfv+K562。
附图6 免疫荧光竞争实验的测定结果图之四——PHMAO2+K562/A02。
附图7 免疫荧光竞争实验的测定结果图之五——抗Pgpscfv免疫荧光竞争实验。
附图8 流式细胞仪测定细胞内Rh123的蓄积测定结果图之一——阴性对照。
附图9 流式细胞仪测定细胞内Rh123的蓄积测定结果图之二——PHMA02。
附图10 流式细胞仪测定细胞内Rh123的蓄积测定结果图之三——抗Pgpscfv。
附图11 流式细胞仪测定细胞内Rh123的蓄积测定结果图之四——维拉帕米(VRP)。
附图12 流式细胞仪测定细胞内Rh123的蓄积测定结果图之五——K562细胞。
具体实施例方式
以下列举部分实施例仅对本发明进行具体说明，但不限制本发明。
实施例1、抗Pgp抗体轻重链可变区基因克隆。
采取异硫氰酸胍一步法(Chomczynski P，Sacchi N，Single-step method of RNAisolation by acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction.Anal.Biochem.1987，162156)提取总RNA，利用逆转录的方法扩增抗PGP单克隆抗体PHMA02轻重链可变区基因取2μg总RNA置于0.5ml Eppendorf管中，依次加入600ng随机引物、4×dNTP各10nmol、Rnasin 20μl、于65℃水浴5-10分钟，然后加入200U的M-MLV逆转录酶，37℃水浴放置1小时，转移至70℃水浴放置10分钟。
轻链可变区基因PCR扩增反应体系(100μl)逆转录产物10μl，10mM dNTP 2μl，10×PCR buffer 10μl，Taq DNA聚合酶2U，购于pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统的轻链扩增引物1、2各2μl，加水至终体积100μl。反应条件为95℃预变性5分钟后，再进行30循环的PCR扩增(94℃变性1分钟，55℃退火2分钟，72℃延伸2分钟)，最后于72℃延伸10分钟。
重链可变区基因PCR扩增反应体系(100μl)逆转录产物10μl，10mM dNTP 2μl，10×PCR buffer 10μl，Taq DNA聚合酶2U，购于pharmacia公司的重组噬菌体抗体系统的重链扩增引物1、2各2μl，加水至终体积100μl。反应条件为95℃预变性5分钟后，再进行30循环的PCR扩增(94℃变性1分钟，55℃退2分钟，72℃延伸2分钟)，最后于72℃延伸10分钟。
用编码接头(GGGGS)3的寡核苷酸序列连接所获得的轻重链可变区基因，经酶切后组装到一嗜菌体表达载体pCANTAB 5E(Pharmacia Biotech)相应的酶切位点上，采用电穿孔的方法将组装好的单链抗体(scFv)表达载体PCANTAB PGPscFv质粒转化大肠杆菌菌株TG1(本发明人所在实验室保存)，建立一个重组噬菌体抗体库。用ELISA法对抗体库进行了筛选，获得几株分泌抗Pgp单链抗体的克隆株。经核酸测序，免疫球蛋白(IgG)一级结构中特征氨基酸同源分析，证明我们克隆的基因是目的基因。
实施例2、单链抗体基因表达载体PET28a(+)PGPscFv的构建用引物①②从PCANTAB PGPscFv质粒中扩增Pgp scFv基因(连同纯化标记E-tag一起扩增)，并在5’端加上HindIII酶切位点，再以PET28a(+)质粒(购于Novagen公司)为模板用引物③④扩增到该载体从起始密码子至酶切位点SphI之间的片段，上述两片段经OverlapPCR连接后，纯化后的PCR产物经HindIII+SphI处理后再与经HindIII+SphI处理后的PET28c(+)载体连接(16℃，过夜)。
引物①5’GACCAGGTCAAACTGCAGCA 3’。
②5’GCGTACCTAAGCTTTGCGGCACGCGGTTCCAG 3’。
③5’CGCAAGGAATGGTGCATGCA 3’。
④5’TGCTGCAGTTTGACCTGGTCGCTGCTGCCCATGGTATATC 3’。
实施例3、抗PgpScFv抗体片断的表达、纯化及复性。3.1抗PgpScFv抗体片断的表达用构建的PET28c(+)-PGPscFv质粒转化大肠杆菌BL21，并在含有50ug/ml卡那霉素，LB平板(1％agar)上筛选转化子。挑取经鉴定正确的单克隆活化后，37℃振荡培养至OD600＝0.7-0.9，加入IPTG(异丙基硫代半乳糖苷，购于SIGMA公司，终浓度为100umol/L)，37℃，250rpM诱导表达3小时，6200g，4℃离心15min收集菌体。收集的菌体沉淀中加入1/30培养体积的冰预冷50mmol/Ltris-HCL、100mmol/LnaCl、1mmol/LEDTA、PH7.0溶解。反复冻融三次后超声破碎细胞(超声30秒/冷却1分钟/200瓦/8次)，4℃，30000g离心30分。沉淀中加入1/30培养体积的3M尿素和50mmol/LTris-HCL PH7.0溶解后离心30000g 30’，4℃收集包涵体，用1/40培养体积的6M盐酸胍和0.1Mtris-HCL PH7.0于4℃摇动过夜溶解包涵体。4℃ 30000g离心30’去处沉淀，上清用于纯化。3.2抗PgpScFv抗体片段的纯化及复性a、3倍柱床体积的Start buffer(6M盐酸胍，0.1MTris-HCL，PH7.0)平衡柱后，上样(样品中加入终浓度5mmol/L咪唑)，20倍柱床体积的6M尿素，50mmol/Ltris-HCL，50mmol/L咪唑，PH7.0洗柱，用4倍柱床体积的含250mmol/l咪唑，6M尿素，50mmol/Ltris-HCL，PH7.0洗脱结合在镍柱上的scfv。b、洗脱样品在TEA缓冲液(0.4M精氨酸-HCl，0.1Mtris-HCL，2mmol/LEDTA，PH7.0)透析复性，4℃过夜。c、12％SDS-PAGE电泳及Wersternblot(蛋白质杂交)分析表达产物分子量约为30KD，见附图1、2。
实施例4、抗PgpScfv抗体活性测定。
1、免疫荧光竞争实验，见图3-7将k562/A02制成5×105细胞悬液，加样于40孔细胞培养板，2×106/孔，PHMA027.5μl(4.8μg/μl)/孔，阴性对照组加15μlPBS，4℃孵育1小时。PBS洗两次，加纯化后抗Pgpscfv50μg/孔，阳性对照组加PBS，4℃孵育1小时。PBS洗两次，加兔抗鼠荧光抗体，4℃孵育40分钟。PBS洗去未结合的荧光抗体，流式细胞仪测定。
单抗PHMA02与K562/A02的结合阳性率为96.44％，经抗Pgpscfv竞争后，PHMA02与K562/A02的结合阳性率为51.08％。实验证明抗Pgpscfv能够与小鼠抗Pgp全抗竞争结合表达Pgp抗原的K562/A02细胞。
2、流式细胞仪测定细胞内Rh123(罗丹明123，购于SIGMA公司)的蓄积，见图8-12取对数生长期的K562和K562/A02细胞，用冷生理盐水洗两次，以无血清RPMI1640稀释成细胞浓度为5×105/ml，加入10μM的荧光染料Rh123，再分别加入a)1×10-6-10-8MPHMA02，b)4×10-6-1×10-8抗Pgpscfv。以10μMVRP作为阳性对照，以不含Rh123的细胞悬液作为阴性对照。与细胞共同孵育60分钟后冷生理盐水洗去Rh123，继续孵育2小时，冷生理盐水洗2次，流式细胞仪(激发波长488nm，发射波长530nm)检测细胞内Rh123的浓度。检测结果表明1×10-6-10-8M单抗PHMA02与K562/A02共同孵育后测定的相对荧光强度分别为3.37，3.07，3.41，4×10-6-1×10-8抗Pgpscfv与K562/A02共同孵育后测定的相对荧光强度分别为3.02，4.02，3.38。阳性对照耐药逆转剂维拉帕咪(VRP)与K562/A02共同孵育后测定的相对荧光强度为79.81。实验证明单抗PHMA02及抗Pgpscfv均不能抑制Pgp泵的功能。
序列表<110>中国医学科学院血液学研究所<120>抗Pgp单克隆抗体的重链和轻链可变区基因及其应用<160>4<210>1<211>125<212>PRT<213>小鼠(musculus)<400>1Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Arg Pho Gly1 5 10 15Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe Ser20 25 30Ile Tyr Asp Met Ser Trp Phe Arg Leu Thr Pho Glu Lys Arg Leu35 40 45Glu Trp Val Thr Tyr Ile Ser Ser Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Pho50 55 60Asp Thr Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys65 70 75Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr80 85 90Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Thr Tyr Tyr Gly Lys Gly Asp95 100 105Pho Phe His Tyr Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr110 115 120Val Thr Val Ser Ser125<210>2<211>375<212>DNA<213>小鼠(musculus)<221>V-region<222>(1)------(375)<400>2caggtcaaac tgcagcagtc tgggggaggc ttagtgaggc ctggagggtc cctgaaactc 60tcctgtgcag cctctggatt cgctttcagt atctatgaca tgtcttggtt cctcctgact120cctgagaaga ggctggagtg ggtcacatac attagtagtg gtggtggcac ctactatcca180
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权利要求
1.一种抗Pgp抗体的重链可变区基因，其具有SEQ ID NO2的序列。
2.由权利要求1的基因编码的多肽，其具有SEQ ID NO1的序列。
3.一种抗Pgp抗体的轻链可变区基因，其具有SEQ ID NO4的序列。
4.由权利要求3的基因编码的多肽，其具有SEQ ID NO3的序列。
5.一种表达载体，其含有权利要求1的抗Pgp抗体的重链可变区及权利要求3的抗Pgp抗体的轻链可变区基因。
6.如权利要求5的表达载体，其为PET28a(+)PGP scFv。
7.如权利要求5或6的表达载体所表达的多肽。
8.权利要求7所述的多肽在制备用于耐药肿瘤的诊断和治疗的药物中的应用。
全文摘要
本发明公开了抗Pgp单克隆抗体PHMA02重链和轻链可变区基因，由所述基因编码的多肽，含有所述基因的载体及所述的基因和多肽在制备用于耐药肿瘤的诊断和治疗药物中的应用。本发明制备的抗Pgpscfv PgpscFv片段只有针对Pgp抗原的识别功能，并无抑制作用，因此应用于人体后不会干扰正常细胞的排泄分泌功能，无论是作为靶向诊断治疗的载体还是作为双功能抗体的一臂，均具有广泛的应用前景。
文档编号A61K39/395GK1498894SQ0214674
公开日2004年5月26日 申请日期2002年11月6日 优先权日2002年11月6日
发明者杨纯正, 熊冬生, 高瀛岱, 彭辉, 许元富, 邵晓枫, 齐静, 范冬梅 申请人:中国医学科学院血液学研究所