专利名称：重组全长人肝再生增强因子的生产方法及其治疗严重肝病的用途的利记博彩app
技术领域：
本发明属于一种生物工程产品的生产方法及用途领域，尤其重组全长人肝再生增强因子的生产方法及其治疗严重肝病的用途。
背景技术：
肝脏是人体内再生能力最为强大的器官之一，肝脏的再生在多种肝脏疾病如急性/慢性病毒性肝炎、重型肝炎的发病与治疗中具有重要的意义，因此多年来人们对于肝脏再生的机理、调节机制进行了持续的研究，目前已经发现的具有调节作用的因子多达数十种，如肝细胞生长因子(HGF)、表皮生长因子(EGF)、转化生长因子-α(TGF-α)等。由于多数因子的作用缺乏肝特异性，因此不可能是肝脏再生的关键调节因子。1975年，Labrecque等首次报道在刚刚断乳的大鼠肝和肝部分切除大鼠的再生肝中存在一种热稳定的特异性刺激肝细胞增殖的物质，称为肝刺激物质(HSS)。之后的研究发现，在狗、小鼠等其它动物中也存在相同性质的物质。1994年，Hagiya等从成年大鼠部分肝切除后的再生肝中提取肝刺激物质，经过复杂的步骤后获得了一个全长1.2kb的cDNA，包含375bp的开发读框，编码125个氨基酸的小分子蛋白，将其命名为肝再生增强因子(ALR)。在大鼠ALR分子克隆的基础上，1999年我们利用同源引物PCR技术获得了人ALR的基因组序列(Genbank号为AF146394)，根据预测的375bp的开放读框，可以编码125个氨基酸的小分子蛋白。之后Lisowsky发现此基因有3种不同的剪切形式，125个氨基酸为不成熟形式，而204个氨基酸的形式为成熟形式，在组织中所占的比率最高，并且具有最强的生物学活性。全长hALR的分子量为23kDa，主要分布于肝脏、肾脏。hALR的主要生物学活性为促进肝再生。在肝部分切除大鼠模型中进行的实验表明，肝再生增强因子能促进肝细胞DNA合成，使3H-TdR掺入量提高2.5倍。对肝部分切除后肝再生增强因子mRNA的动态研究发现，术后12hmRNA即显著增加，并于术后24h达到峰值。在门腔静脉吻合模型中，重组肝再生增强因子能够使肝体积保持正常，防止肝细胞萎缩，而对照组肝组织出现肝萎缩，肝细胞粗面内质网和核糖体减少，线粒体变大且嵴破裂。肝再生增强因子对于肝细胞损伤具有保护作用。在CCl4模拟体内重肝损伤模型中，肝再生增强因子能够明显抑制CCl4诱导损伤肝细胞的LDH释放，在体内实验中重组肝再生增强因子能够使治疗组的存活率提高20％，血清LDH水平降低34％，ALT水平降低38.3％。此外，肝再生增强因子还能够提高糖尿病大鼠进行胎鼠胰腺移植的成功率，并且在精子生成中发挥作用。
发明内容
本发明的目的是通过原核表达、纯化获取具有生物活性的重组全长人肝再生增强因子并用于治疗严重肝病。
本发明的主要内容是在获取全长人肝再生增强因子基因并构建高效表达菌株的基础上，建立了一整套工程菌诱导表达、包涵体分离裂解、蛋白质复性纯化的工艺，以获重组全长人肝再生增强因子纯品，并对重组全长人肝再生增强因子的生物学活性进行了描述，表明重组全长人肝再生增强因子具有治疗严重肝病的用途。
关于全长人肝再生增强因子基因的获取及其高效表达载体的构建可以参阅成军，钟彦伟，刘妍，董菁，杨继珍，陈菊梅，人肝再生增强因子基因组DNA的克隆化与序列分析。中华肝脏病杂志，2000；8(1)12-14；以及夏小兵，成军，王刚，杨继珍，刘妍，董菁，王琳，李克，人肝再生增强因子在毕赤酵母中的表达。世界华人消化杂志，2001；9(7)743-746。全长人肝再生增强因子基因及表达蛋白见序列表中序列1和序列2。
本发明在获取全长人肝再生增强因子基因并构建高效表达菌株的基础上，建立了一整套工程菌诱导表达、包涵体分离裂解、蛋白质复性纯化的工艺，其特征为1)工程菌低密度发酵，其最佳诱导表达时间为OD600＝0.3-0.4；2)包涵体的变性采用8mol/L尿素溶液；3)包涵体的复性采用2mol/L尿素，0.2mmol/L氧化性谷胱甘肽、1mmol/L还原性谷胱甘肽、100mmol/L Tris-HCl pH8.0；4)蛋白纯化采用阳离子交换层析，采用SP-FF柱，上样后首先利用乙酸钠缓冲液洗脱未结合相，然后利用300mmol/L NaCl进行阶段洗脱，重组全长人肝再生增强因子位于第一峰；5)获得的重组全长人肝再生增强因子纯度可达99％以上，能够在体外促进肝细胞系HepG2的增殖，在体内促进肝部分切除术后大鼠肝脏的再生，促进CCl4中毒后大鼠肝细胞DNA合成，提高CCl4中毒后大鼠存活率。
因此，根据本发明，提供了1、一种重组全长人肝再生增强因子的生产方法，该方法包括以下步骤
A、工程菌种的活化；B、发酵；C、裂菌；D、包涵体洗涤；E、包涵体裂解；F、包涵体复性；和G、纯化。
2、以上项1的方法，其中发酵为低密度发酵，其最佳诱导表达时间为OD600＝0.3-0.4。
3、以上项1的方法，包涵体的裂解采用尿素进行。
4、以上项1的方法，包涵体的复性采用尿素，氧化性谷胱甘肽，还原性谷胱甘肽和Tris-HCl进行，其中pH为7.5-8.5，优选8.0。
5、以上项1的方法，其中纯化采用阳离子交换层析和凝胶层析进行。
6、以上项1-5中任一项的方法获得的重组全长人肝再生增强因子。
7、以上项6的重组全长人肝再生增强因子在制备治疗严重肝病的药物中的用途。
有益效果通过我们的技术方案可以获得纯化的重组全长人肝再生增强因子。人肝再生增强因子在肝脏再生中的作用在很早以前就引起人们的注意，但以前对它的了解大多限于125氨基酸形式，对于人肝再生增强因子其它剪切产物以及它们功能上的差异则是刚刚了解。目前的认识是204氨基酸形式才是它的全长形式，在组织中所占的比率最高，并且具有最强的生物学活性，因此有望在治疗严重肝病中取得实际的应用。
附图简述
图1为生产工艺流程图；实施例实施例一重组全长人肝再生增强因子的生产方法一、本实施例的技术要点1、细菌为低密度发酵；2、包涵体变性剂为尿素；3、包涵体复性后利用阳离子交换层析进行纯化；二、操作步骤；1、工程菌种的活化重组pBV220-hALRL/JM109为本室构建。从4℃保存的细菌平皿中挑取分离良好的单菌落，接种于5mlLB/Amp(100ug/ml)培养基中，30℃200rpm振荡培养12h；5％接种于摇瓶中，培养基同前，30℃200rpm振荡培养12h作为种子液。
2、发酵种子液按照2.5％接种于500ml LB/Amp(100ug/ml)培养基中，30℃200rpm振荡培养3-4h，待其OD600＝0.3-0.4时升高培养温度至42℃，继续振荡培养5h。10000rpm离心，收集菌体，进行SDS-PAGE检测蛋白表达情况，约为4g/L。利用5L发酵罐进行小试，发酵参数为通气量2L/min，溶氧量50％，搅拌速度300-600rpm。每次投料4L，按照2.5％接种种子液，30℃生长至OD600＝0.3-0.4时升高培养温度至42℃诱导表达5h。10000rpm离心，收集菌体，进行SDS-PAGE检测蛋白表达情况，约为4g/L。
3、裂菌4℃3000rpm离心30min，弃上清。称量细菌湿重，按照100ml/10g菌体的比例加入细菌裂解液(50mmol/LTris-HCl，pH8.0，1mmol/L EDTA，1mg/ml溶菌酶)，0℃作用30min，冰浴超声破碎30-45s，间歇2min，共超声3次，之后4℃8000rpm离心30min，弃上清，收集包涵体，以100mmol/LTris-HCl，pH8.0洗涤一次。
4、包涵体洗涤以0.5％Triton X-100(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0)按照100ml/20g包涵体的比例重悬包涵体，室温搅拌40min。10000rpm离心30min，弃上清。沉淀用100mmol/L Tris-HCl，pH8.0洗涤一次，称重。以2mol/L NaCl(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0)按照100ml/20g包涵体的比例重悬包涵体，室温搅拌120min。10000rpm离心30min，弃上清。沉淀用100mmol/LTris-HCl，pH8.0洗涤一次，称重。以4mol/L尿素(100mmol/LTris-HCl，pH8.0)按照100ml/20g包涵体的比例重悬包涵体，室温搅拌40min。10000rpm离心30min，弃上清。沉淀用100mmol/LTris-HCl，pH8.0洗涤一次，称重。
5、包涵体裂解将包涵体按照20-30g/100ml的浓度重悬于8mol/L尿素(100mmol/L Tris-HCl，pH8.0)，1％巯基乙醇中，室温搅拌过夜。10000rpm离心30min，取上清。
6、包涵体复性将100mmol/L Tris-HCl，pH8.0加入包涵体裂解液，将尿素由8mol/L稀释到2mol/L，同时调节总蛋白量不超过500ug/ml。加入氧化性谷胱甘肽至终浓度为0.2mmol/L，加入还原型谷胱甘肽至终浓度为1mmol/L。4℃复性8-10h。用含有谷胱甘肽氧化还原体系的100mmol/L Tris-HCl，pH8.0反复透析以除去尿素。
7、阳离子交换层析采用Amersham SP-FF强阳离子交换层析胶装填入26mm层析柱，以50mmol/L乙酸钠缓冲液，pH5.5进行平衡。包涵体复性溶液在乙酸钠缓冲液中充分透析后上样，每次上样10ml。以乙酸钠缓冲液洗脱未结合相，之后利用300mmol/L NaCl进行阶段洗脱，目的蛋白位于第一峰。收集第一峰。
8、凝胶层析采用Sephacryl S-100凝胶层析柱，以50mmol/LTris-HCl，pH8.0进行平衡。将样品用50mmol/L Tris-HCl，pH8.0充分透析后上样，目的蛋白位于主峰。收集主峰。
实施例二重组全长人肝再生增强因子体外促进肝细胞系HepG2的DNA合成一、本实施例的技术要点重组全长人肝再生增强因子体外促进肝细胞系HepG2的DNA合成。
二、操作步骤1、HepG2细胞培养HepG2细胞生长于高糖DMEM+10％胎牛血清中，37℃5％CO2培养。待细胞生长至对数期，胰酶消化，调整细胞密度至4×105/ml，在96孔培养板中每孔接种100ul，继续培养6h。
2、加样在96孔培养板中加入待测样品，每个浓度设置3个复孔，继续培养24h。假如2.0×104Bq3H-TdR，继续培养3h。
3、检测利用细胞收集器将细胞收集到滤纸片上，上液闪计数器计数。
4、结果通过实验证明重组全长人肝再生增强因子能够在体外促进肝细胞系HepG2的DNA合成。
实施例三重组全长人肝再生增强因子体内促进肝部分切除术后大鼠肝脏细胞DNA合成一、本实施例的技术要点重组全长人肝再生增强因子体内促进肝部分切除术后大鼠肝脏细胞DNA合成。
二、操作步骤1、大鼠肝部分切除术模型的建立大鼠单笼饲养1wk，实验前禁食过夜，术前腹腔注射戊巴比妥钠(40mg·kg-1)麻醉，上腹部脱毛后以750mL·L-1酒精消毒皮肤，以上腹部正中切口，显露肝脏，按Hoggin法充分游离左叶及中叶肝脏的韧带后，于各肝叶的根部结扎牢固，迅速于结扎线的远端切除左肝叶及肝中叶，即相当于2/3肝切除。保留余肝叶，缝合腹部切口。
2、加药术后腹腔注射重组全长人肝再生增强因子1ml(0.1mg/ml)，同时设生理盐水对照组。20h后按照100uCi/kg腹腔注射3H-TdR，2h后处死大鼠。
3、检测开腹，取肝组织，用Promega试剂盒提取组织DNA，进行3H-TdR计数。
4、结果通过实验证明重组全长人肝再生增强因子能够在体内促进肝部分切除术后大鼠肝脏细胞DNA合成。
实施例四重组全长人肝再生增强因子体外促进CCl4损伤肝细胞的修复一、本实施例的技术要点重组全长人肝再生增强因子体外促进CCl4损伤肝细胞的修复。
二、操作步骤1、体外CCl4损伤肝细胞模型的建立按照原位灌注法分离BalB/C小鼠肝细胞，将分离的细胞用含10％小牛血清，10-9mol/L胰岛素的RPMI1640培养液悬浮，按每孔3×104细胞/100ul的数量接种于96孔板，37℃5％CO2培养10h。换用含5mM CCl4，10％小牛血清及不同浓度重组全长人肝再生增强因子的RPMI1640培养液。
2、LDH释放实验于换液后不同时间收集细胞培养上清，利用Cytox 96非放射性细胞毒检测试剂盒测定细胞LDH释放率。
3、细胞存活率的测定使用MTT法评价肝细胞的存活率，用酶联仪检测OD490值。
4、结果通过实验证明，重组全长人肝再生增强因子能够明显抑制CCl4损伤肝细胞LDH释放，并显著增加CCl4损伤后肝细胞的存活率。
实施例五重组全长人肝再生增强因子体内促进CCl4损伤肝细胞的修复一、本实施例的技术要点重组全长人肝再生增强因子体内促进CCl4损伤肝细胞的修复。
二、操作步骤1、体内CCl4肝中毒模型的建立BalB/C小鼠腹腔注射CCl4(4ml/kg)，4h后随机分组，治疗组每12h腹腔注射重组全长人肝再生增强因子20ug，对照组注射生理盐水。记录动物死亡时间，存活超过96h即为存活。
2、体内CCl4肝损伤模型的建立BalB/C小鼠腹腔注射CCl4(2ml/kg)，4h后随机分组，治疗组每12h静脉注射重组全长人肝再生增强因子20ug，对照组注射生理盐水。48h后测定DNA增值率，同时取外周血测定ALT、LDH水平。
3、DNA增殖测定在最后一次注射重组全长人肝再生增强因子厚12h，按照1ml/kg的量腹腔注射5-FU标记液，2h后处死动物，开腹取肝组织，甲醛固定，石蜡包埋。常规石蜡切片，二甲苯脱蜡，酒精脱水后PBS洗涤三次，抗5-FU单抗室温孵育60min，PBS洗涤二次，切片以过氧化物酶标记的鼠抗兔IgG室温孵育30min，洗涤三次后显色10min，脱水、透明、封片，显微镜下随即挑选五个视野，计数阳性细胞。
4、结果通过实验证明，重组全长人肝再生增强因子在体内能够显著提高CCl4肝中毒小鼠的存活率，显著降低CCl4肝损伤小鼠的外周血ALT、LDH水平。光镜下可见重组全长人肝再生增强因子能够显著减轻肝细胞变性坏死的比率，并能够促进CCl4诱导肝损伤模型小鼠肝细胞DNA合成。
序列表<110>中国人民解放军传染病研究所<120>重组全长人肝再生增强因子的生产方法及其治疗严重肝病的用途<160>2<210>1<211>615<212>DNA<213>人<220><223>n＝a或g或c或t<400>1ATG GCG GCG CCC GGC GAG CGG GGC CGC TTC CAC GGC GGG AAC CTC TTC TTC 51Met Ala Ala Pro Gly Glu Arg Gly Arg Phe His Gly Gly Asn Leu Phe PheCTG CCG GGG GGC GCG CGC TCC GAG ATG ATG GAC GAC CTG GCG ACC GAC GCG 102Leu Pro Gly Gly Ala Arg Ser Glu Met Met Asp Asp Leu Ala Thr Asp AlaGGG CCG GGG CGC GGG GCG GAG AGA CGC GGC CGC CTC GGC CTC GAC GCC AGC 153Gly Pro Gly Arg Gly Ala Glu Arg Arg Gly Arg Leu Gly Leu Asp Ala SerCCA GGC GCC GAC CTC CGA TTC TCC TGT CGC CGA GGA CGC CTC CCG GAG GCG 204Pro Gly Ala Asp Leu Arg Phe Ser Cys Arg Arg Gly Arg Leu Pro Glu AlaGCG TGC CGG GCC TGC GTC GAC TTC AAG ACG TGG ATG CGG ACG CAG CAG AAG 255Ala Cys Arg Ala Cys Val Asp Phe Lys Thr Trp Met Arg Thr Gln Gln LysCGG GAC ACC AAG TTT AGG GAG GAC TGC CCG CCG GAT CGC GAG GAA CTG GGC 306Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Cys Pro Pro Asp Arg Glu Glu Leu GlyCGC CAC AGC TGG GCT GTC CTT CAC ACC CTG GCC GCC TAC TAC CCC GAC CTG 357Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp LeuCCC ACC CCA GAA CAG CAG CAA GAC ATG GCC CAG TTC ATA CAT TTA TTT TCT 408Pro Thr Pro Glu Gln Gln Gln Asp Met Ala Gln Phe Ile His Leu Phe SerAAG TTT TAC CCC TGT GAG GAG TGT GCT GAA GAC CTA AGA AAA AGG TTG TGC 459Lys Phe Tyr Pro Cys Glu Glu Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu CysAGG AAC CAC CCA GAC ACC CGC ACC CGG GCA TGC TTC ACA CAG TGG CTG TGC 510Arg Asn His Pro Asp Thr Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu CysCAC CTG CAC AAT GAA GTG AAC CGC AAG CTG GGC AAG CCT GAC TTC GAC TGC 561His Leu His Asn Glu Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp CysTCA AAA GTG GAT GAG CGC TGG CGC GAC GGC TGG AAG GAT GGC TCC TGT GAC 612Ser Lys Val Asp Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys AspTAG615<210>2<211>204<212>PRT<213>人<400>2Met Ala Ala Pro Gly Glu Arg Gly Arg Phe His Gly Gly Asn Leu Phe Phe5 10 15Leu Pro Gly Gly Ala Arg Ser Glu Met Met Asp Asp Leu Ala Thr Asp Ala20 25 30Gly Pro Gly Arg Gly Ala Glu Arg Arg Gly Arg Leu Gly Leu Asp Ala Ser35 40 45 50Pro Gly Ala Asp Leu Arg Phe Ser Cys Arg Arg Gly Arg Leu Pro Glu Ala55 60 65Ala Cys Arg Ala Cys Val Asp Phe Lys Thr Trp Met Arg Thr Gln Gln Lys70 75 80 85Arg Asp Thr Lys Phe Arg Glu Asp Cys Pro Pro Asp Arg Glu Glu Leu Gly90 95 100Arg His Ser Trp Ala Val Leu His Thr Leu Ala Ala Tyr Tyr Pro Asp Leu105 110 115Pro Thr Pro Glu Gln Gln Gln Asp Met Ala Gln Phe Ile His Leu Phe Ser120 125 130 135Lys Phe Tyr Pro Cys Glu Glu Cys Ala Glu Asp Leu Arg Lys Arg Leu Cys
140 145 150Arg Asn His Pro Asp Thr Arg Thr Arg Ala Cys Phe Thr Gln Trp Leu Cys155 160 165 170His Leu His Asn Glu Val Asn Arg Lys Leu Gly Lys Pro Asp Phe Asp Cys175 180 185Ser Lys Val Asp Glu Arg Trp Arg Asp Gly Trp Lys Asp Gly Ser Cys Asp190 195 200
权利要求
1.一种重组全长人肝再生增强因子的生产方法，该方法包括以下步骤A、工程菌种的活化；B、发酵；C、裂菌；D、包涵体洗涤；E、包涵体裂解；F、包涵体复性；和G、纯化。
2.权利要求1的方法，其中发酵为低密度发酵，其最佳诱导表达时间为OD600＝0.3-0.4。
3.权利要求1的方法，其中包涵体的裂解采用尿素进行。
4.权利要求1的方法，其中包涵体的复性采用尿素，氧化性谷胱甘肽，还原性谷胱甘肽和Tris-HCl进行，其中pH为7.5-8.5，优选8.0。
5.权利要求1的方法，其中纯化采用阳离子交换层析和凝胶层析进行。
6.权利要求1-5中任一项的方法获得的重组全长人肝再生增强因子。
7.权利要求6的重组全长人肝再生增强因子在制备治疗严重肝病的药物中的用途。
全文摘要
本发明为重组全长人肝再生增强因子的生产方法及其治疗严重肝病的用途，属于生物产品的生产方法及用途领域。在获取全长人肝再生增强因子基因序列并成功构建高效表达菌株的基础上，建立了重组全长人肝再生增强因子原核表达、包涵体分离裂解、蛋白质纯化复性的工艺，最终获得重组全长人肝再生增强因子纯品。后者能够在体外促进肝细胞系HepG2的DNA合成，在体内促进肝部分切除术后大鼠肝脏的再生，促进CCl
文档编号A61K38/18GK1418964SQ02125768
公开日2003年5月21日 申请日期2002年8月16日 优先权日2002年8月16日
发明者成军, 王刚, 夏小兵, 洪源, 刘妍, 钟彦伟, 王琳, 董菁 申请人:中国人民解放军传染病研究所