专利名称：一种干细胞复合药物、其制备方法及其用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种干细胞复合药物、其制备方法及其在制备治疗各种肝病上的途，特别是采用存在于人类或哺乳类动物的胚胎、血液或幼体肝脏中，用生化方法提取出来的一种干细胞诱导因子，复合从人或其他哺乳动物的胚胎、脐带血、脊髓、等组织中制备的干细胞的复合药物，其制备方法及其在用于制备促进干细胞向成熟肝脏细胞转化及治疗肝脏疾病药物上的应用。
干细胞是一种具有自我更新能力的多潜能原始细胞，在一定条件下可定向诱导成为各种类型的成体细胞，被用于各种用传统方法难于治愈的细胞损伤型疾病。干细胞的治疗正在成为一类全新的有效的治疗方法。
干细胞作为一种新的治疗方式，已成为临床研究的热点。干细胞的治疗是相对安全的。但如何使干细胞定向诱导，使其分化成为所需的成体细胞并具有成体细胞的功能是尤为重要的。
干细胞包括胚胎干细胞和成体干细胞。干细胞的发育受多种内在机制和微环境因素的影响。目前人类胚胎干细胞已可成功地在体外培养。最新研究发现，成体干细胞可以横向分化为其他类型的细胞和组织，为干细胞的广泛应用提供了基础。研究干细胞增殖和分化机制的最终目的是通过干细胞治疗疾病。理论上讲，干细胞可以用于各种疾病的治疗，但其最适合的疾病主要是组织坏死性疾病、退行性病变、自体免疫性疾病等。干细胞作为一种新的治疗方式，已成为临床研究的热点。
肝脏是人体代谢的枢纽，根据有关医学专家研究，在当前及未来相当一段时间内，肝脏疾病将是威胁人类健康的最重要因素之一。据不完全统计，我国乙肝病毒携带者占10％，丙肝感染率平均为3.2％，全球每年死于肝炎后慢性肝病的病人中，就有42.5％在中国。可见寻找有效治疗肝脏疾病的药物，是非常重要的。
本发明的目的在于公开一种干细胞复合药物，特别是存在于人类或哺乳类动物的胚胎、血液或幼体肝脏中，用生化方法提取出来的一种干细胞复合药物，该复合药物可提高干细胞及干细胞诱导因子的疗效、促进肝脏增殖并可用于治疗各种原因引起的肝脏疾病。
本发明的另一目的在于公开一种从人类或其他哺乳类动物的胚胎、血液、脊髓、脐带血或幼体哺乳类动物肝脏中制备的干细胞复合药物的制备方法。
本发明的再一目的在于公开一种干细胞复合药物在制备促进干细胞向成熟肝脏细胞转化及治疗肝脏疾病药物上的应用。
上述目的通过以下技术方案来实现一种干细胞复合药物，包括干细胞和肝细胞诱导因子；其中所述的干细胞是以人胚胎、脐带血、脊髓等为原料，采用免疫磁珠阳性筛选制备的干细胞；所述的肝细胞诱导因子由哺乳类动物胚胎或幼体肝脏中提取，经层析方法分离、纯化的具有生物学活性的小分子量多肽，分子量为0.8-6KD，优选1.2-6KD。
使用时可以先使用干细胞诱导因子，然后用异源干细胞，也可以先用异源干细胞，再用细胞诱导因子，二者协同作用，促进异源干细胞在肝脏存活，并促进干细胞向肝脏细胞的转化。
本发明干细胞的制备方法包括如下步骤4)将原料稀释得到稀释液；5)单核细胞的获得；6)免疫磁珠阳性筛选。
其中步骤1)中的原料稀释是采用以20ml枸橼酸-枸橼酸钠(简称ACD)和葡萄糖(简称CB)的PBS缓冲溶液稀释脐带血或脊髓块等，得到脐带血或脊髓稀释液；缓冲溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
或将人或其他哺乳动物的胚胎匀浆。
步骤2)中通过下述方法获得单核细胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll分层，，4℃ 800g离心30分钟，收集界面层后，在4℃ 500g离心20分钟，弃上清，得到脊髓单核细胞收集界面层。
上述制备方法中还包括采用流式细胞仪分选干细胞。
当采用脐带血为原料时，还包括将弃上清后的沉淀物用红细胞裂解液4℃下裂解10分钟。用PBS缓冲液洗涤细胞，300g离心20分钟，采用流式细胞仪分选干细胞，得到脐带血的单核细胞(MNC)。
步骤3)中的免疫磁珠阳性筛选为采用MNC∶Dynabeads M-450CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。Dynabeads M-450 CD34洗涤，置于磁板(MPC)1分钟，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次。混合磁珠(MACS，Miltenyi公司产品)和脐带血的单核细胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分钟，阳性筛选CD34+细胞。
玫瑰花环状细胞—磁珠重新悬起，置于磁板(MPC)2分钟，弃清液，重复3次，得玫瑰花环状细胞—磁珠，悬于100μl PBS缓冲液。Detachabead CD34解离细胞，微旋孵育45分钟，加2ml PBS缓冲液，混匀，置于磁板(MPC)2分钟，收集细胞清液，重复3次，汇集细胞清液，置于MPC 2分钟，除去残留磁珠，将细胞清液移入锥形试管。离心、洗涤2次，细胞计数，流式细胞仪FACS检测。
为避免胞内冰晶损伤和溶液损伤，采用人胚胎细胞较多应用的玻璃化冻存方法。首先冰浴预冷冻存液，细胞离心管置于冰水浴操作，沿离心管壁缓加冻存液(何种冻存液)，至细胞终浓度为1×1061.5×106，吹吸匀。分装于冻存管中，火焰封口，将冻存管直接投入液氮罐保存，降温速度约为600℃/min，进行细胞冻存。细胞培养时，细胞浓度调至1×106培养。
本发明中采用MTT法测定干细胞增殖来鉴定所得干细胞的活性。具体为以无血清培养基制备单细胞悬液，接种于培养板中，加入MTT(中文名)溶液，孵育，离心，弃培养板孔内上清，加入二甲基亚砜。酶联免役检测仪测定OD570检测干细胞是否出现明显增殖，如有增殖说明所制备的干细胞具有活性。
本发明中采用免疫组化法检查干细胞是否向肝细胞转化，具体为取细胞涂片，丙酮固定，加稀释一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)，37℃ 40分钟，PBS洗3次，每次3分钟。加FITC标记的二抗(1∶50稀释)，37℃条件下保存40分钟。PBS洗3次每次3分钟。缓冲甘油封片，荧光显微镜下检查。实验结果表明人干细胞增殖及向肝细胞转化。
CD34+细胞用Hoechest33342、PKH26双标，尾静脉注射干细胞药物。取观察脏器制成冰冻切片、石蜡切片。细胞形态学鉴定采用紫外荧光显微成像，激光共聚焦细胞仪观察。细胞人源性检测采用PCR技术，提取组织中的DNA，用PCR的方法特异性的扩增人Alu序列，用于区分人和鼠的细胞。如果PCR扩增有阳性结果，可进一步通过用人Alu序列的核酸探针进行原位杂交鉴定。细胞造血干细胞性质检测采用CD34+CD38+双标，Confolcal检测。CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，尾静脉注射入裸鼠，加干细胞诱导因子SIF，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测。CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，尾静脉注射入裸鼠，加SIF的PBS缓冲液，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测。CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，尾静脉注射入裸鼠，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测。
肝性化检测，采用免疫组化方法可用CK14、CK19、清蛋白、AFP分别鉴定。肝细胞标记还可用HepParl，OC可采用OV-6和CD-117标记。免疫组化设立人肝阳性对照、鼠肝阴性对照。
本发明所述的肝细胞诱导因子是来源于人类或哺乳类动物胚胎肝脏的多肽类转化因子。其制备方法是取健康未哺乳新生牛、乳猪或乳羊等哺乳类动物的肝脏处理后，冰浴中在匀浆器匀浆，过滤组织碎片，超声波细胞粉碎(冰浴)，高温变性，醇沉，离心，取沉淀物溶于0.02M Tris-HCL(PH7.7)，DEAE离子交换树脂层析分离(或研磨、离心后经截留分子量小于20kD的滤膜过滤，滤液经浓缩冻干，用Sephadex LH 20层析柱制备层析分离分子量0.8-11kD的组分，以DEAE离子交换层析分离。)0-0.7M NaCl连续梯度洗脱，收集0.5M NaCl处洗脱液，冻干或制成无菌水溶液、颗粒剂、胶囊等，冷暗处保存，即得。
本发明采用紫外分光光度法测定鉴别所述的肝细胞诱导因子。浓度为1mg/ml时PH为6.8，蛋白质、异常毒性、过敏试验、无菌等检查均符合《中国药典》2000年版(二部)各项下要求。
下面结合附图和具体实施例详细描述本发明，所述的实施例是用于描述本发明，而不是限制本发明。
图1.CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，干细胞诱导因子SIF作用于肝脏的激光共聚焦细胞仪检测结果图；图2.CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，加SIF的PBS缓冲液，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测结果图；图3.CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测结果图；干细胞诱导因子的活性鉴定，采用(1)运用流式细胞仪分离人脐血中的造血干细胞。CD34抗体标记，采用流式细胞仪分选CD34+细胞，并以无血清培养基调整细胞浓度为1×105个/ml细胞，按每孔1×104个细胞接种于96孔培养板。(2)以MTT法测定干细胞增殖，以无血清培养基制备单细胞悬液，以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为200μl，培养3天，接种细胞。每孔加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，孵育4小时。1000转/分，离心5分钟。弃培养板孔内上清。每孔加入150μl二甲基亚砜，震荡15分钟。酶联免役检测仪测定OD570。(3)免疫组化法检查干细胞是否向肝细胞转化，采用细胞涂片，丙酮固定10分钟。加稀释一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)37℃×40分钟。PBS洗3×3分钟。加FITC标记的二抗(1∶50稀释)37℃×40分钟。PBS洗3×3分钟。缓冲甘油封片。荧光显微镜下检查。实验表明干细胞诱导因子能促进人干细胞增殖及向肝细胞转化。
干细胞诱导因子潜在药物疗效的评价，在整体动物水平探索干细胞诱导因子对肝脏疾病的治疗作用，在整体动物水平和细胞水平上评价在造血干细胞向肝细胞转化过程中干细胞诱导因子的作用。免疫磁珠阳性筛选获得实验所需脐带血CD34+细胞，并建立细胞药物筛选平台。细胞冻存或细胞浓度调至1×106培养，为避免胞内冰晶损伤和溶液损伤，采用人胚胎细胞较多应用的玻璃化冻存方法。CD34+细胞用Hoechest33342、PKH26双标尾静脉注射，加干细胞诱导因子组首次因子剂量加倍，以后每天皮下注射追加因子。定期处死动物，取肝、脾，制成冰冻切片、石蜡切片。采用紫外荧光显微成像、激光共聚焦细胞仪进行细胞形态学鉴定。提取组织中的DNA，用PCR的方法特异性的扩增人Alu序列，用于区分人和鼠的细胞。进行细胞人源性检测。PCR扩增有阳性结果后，进一步通过用人Alu序列的核酸探针进行原位杂交鉴定。以CD34+CD38+双标，Confolcal进行造血干细胞性质检测。采用免疫组化方法进行肝性化检测。所用动物均为裸鼠肝纤维化损伤模型。CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，尾静脉注射入裸鼠，加干细胞诱导因子SIF，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测，结果见图1。CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，尾静脉注射入裸鼠，加SIF的PBS缓冲液，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测。CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，尾静脉注射入裸鼠，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测，结果见图3。实验结果表明干细胞诱导因子对肝脏疾病的具有良好的治疗作用，在造血干细胞向肝细胞转化过程中干细胞诱导因子具有明显的促进作用，可阻止肝细胞坏死，肝细胞DNA的合成明显加快，促进肝细胞再生的作用，加速肝脏组织的修复。
本发明所述的干细胞诱导因子也可以采用现有技术中公开的从动物体内提取的各种促肝细胞生长素及具有类似功能的药物。
本发明中，采用干细胞诱导因子与异源干细胞(如人造血干细胞，胚胎干细胞等)协同使用，使用时可以先用干细胞诱导因子，然后用异源干细胞，也可以先用干异源干细胞，再用细胞诱导因子，二者协同作用，促进异源干细胞在肝脏存活，并促进干细胞向肝脏细胞的转化，可用于干细胞治疗各种肝病。注射用量100ug/kg，一日一次，10-14天为一疗程。亦可单独应用于各种急慢性肝病。促进肝细胞的再生和肝脏组织的损伤修复。
本发明经MNC细胞获取、CD34抗体标记、流式细胞仪分选及细胞接种分离干细胞，方法简便快捷；以MTT法测定干细胞增殖，免疫组化法检查干细胞是否向肝细胞转化，特异性强；所述的干细胞复合药物经诱导可定向转化，用于干细胞治疗各种疾病及进行细胞药物的筛选，对各种原因引起的急、慢性肝脏疾病适应症患者肌注或静注、口服给药，实用有效。本发明的干细胞复合药物可有效地促进自体或异体干细胞在肝脏的增殖及转化，通过肝细胞再生及细胞诱导因子的协同作用，达到提高和恢复肝功能的目的，可用于各种急、慢性肝病的治疗。本发明的干细胞复合药物具有特异的生物活性，安全无毒、无致病性。另外本发明因无种属特异性，所以可从多种哺乳类动物的胚胎和幼体肝脏提取、分离，纯化，生产工艺简单。
实施例1取人14周胚胎脊髓约5g剪碎，以20ml枸橼酸-枸橼酸钠(简称ACD)和葡萄糖(简称CB)的PBS缓冲溶液稀释，得到脊髓稀释液；缓冲溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
脊髓稀释液用Ficoll(Sigma公司产品)分层，Ficoll∶CB＝3∶7，4℃ 800g离心30分钟。收集界面层后，在4℃ 500g离心20分钟，弃上清，得到脊髓单核细胞(MNC)。
以磁珠(MACS，Miltenyi公司产品)阳性筛选CD34(抗体)和脊髓单核细胞(MNC)，所用抗体为Dynabeads M-450 CD34和Detachabead CD34，与MNC的比例及用量为MNC∶Dynabeads M-450 CD34抗体(Dynal公司产品)∶Detachabead CD34抗体(Dynal公司产品)＝4×108∶4×107∶4×107(浓度)＝1ml∶100μl∶100μl(用量)。
阳性筛选CD34+细胞(MNC)——混合磁珠和细胞，4℃下微旋孵育30分钟。
首先用Dynabeads M-450 CD34洗涤脊髓单核细胞，置于磁板(MPC)1分钟，弃清液后，用PBS缓冲液洗涤4次。
阳性筛选CD34+细胞(MNC)，——将玫瑰花环状细胞——磁珠重新悬起，置于磁板(MPC)2分钟，弃清液，重复3次，得玫瑰花环状细胞—磁珠，悬于100mlPBS缓冲液中。用Detachabead CD34解离细胞，微旋孵育45分钟，加2ml PBS缓冲液混匀，置于磁板(MPC)2分钟，收集细胞清液，重复3次，汇集细胞清液，置于磁板(MPC)2分钟，除去残留磁珠，将细胞清液移入锥形试管。离心、洗涤2次，细胞计数，CD34、CD3双标，流式细胞仪(FACS)检测MACS阳性筛选CD34+细胞。得到脊髓干细胞。
为避免胞内冰晶损伤和溶液损伤，采用人胚胎细胞较多应用的玻璃化冻存方法。首先冰浴预冷冻存液，细胞离心管置于冰水浴操作，沿离心管壁缓加冻存液，细胞终浓度为1×1061.5×106，吹吸匀。分装于冻存管中，火焰封口，将冻存管直接投入液氮罐保存，降温速度约为600℃/min，进行细胞冻存。
实施例2参考实施例1的方法，具体操作如下取人脐带血约100ml，以枸橼酸-枸橼酸钠(简称ACD)和葡萄糖(简称CB)的PBS缓冲溶液稀释，得到脐带血的稀释液，缓冲溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。
人脐带血稀释液用Ficoll(Sigma公司产品)分层，Ficoll∶CB＝3∶7，4℃ 800g离心30分钟。收集界面层后，在4℃ 500g离心20分钟，弃上清。沉淀物用红细胞裂解液4℃下裂解10分钟。用PBS缓冲液洗涤细胞，300g离心20分钟，采用流式细胞仪分选干细胞，细胞计数，FASC检测，调整细胞至4×107，得到脐带血的单核细胞(MNC)。
采用MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。Dynabeads M-450 CD34洗涤，置于磁板(MPC)1分钟，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次。混合磁珠(MACS，Miltenyi公司产品)和脐带血的单核细胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分钟，阳性筛选CD34+细胞。
玫瑰花环状细胞—磁珠重新悬起，置于磁板(MPC)2分钟，弃清液，重复3次，得玫瑰花环状细胞—磁珠，悬于100μl PBS缓冲液。Detachabead CD34解离细胞，微旋孵育45分钟，加2ml PBS缓冲液，混匀，置于磁板(MPC)2分钟，收集细胞清液，重复3次，汇集细胞清液，置于MPC 2分钟，除去残留磁珠，将细胞清液移入锥形试管。离心、洗涤2次，细胞计数，流式细胞仪FACS检测。
实施例3同实施例1，不同之处在于采用10周猪胚胎脊髓为原料，得到猪脊髓干细胞。
实施例4同实施例2，不同之处在于采用牛脐带血为原料，得到牛脐带血干细胞。
实验例1干细胞活性的鉴定方法如下MTT法测定干细胞增殖将实施例1-4的干细胞细胞浓度分别调至1×106，以无血清培养基分别制备上述实施例的单细胞悬液，按每孔1×104个细胞接种于96孔培养中，每孔体积为200μl，培养3天，接种细胞。每孔加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，孵育4小时。1000转/分，离心5分钟。弃培养板孔内上清。每孔加入150μl二甲基亚砜，震荡15分钟。酶联免役检测仪测定OD570，实施例1-4的实验结果都表明干细胞出现明显增殖，说明所制备的干细胞具有活性。
实验例2本实验例涉及干细胞向肝细胞转化活性的鉴定采用免疫组化法检查干细胞是否向肝细胞转化取细胞涂片，丙酮固定10分钟。加稀释一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)，37℃下放置40分钟，PBS缓冲液洗3次，每次3分钟。加FITC标记的二抗(1∶50稀释)，37℃条件下保存40分钟。PBS洗3次每次3分钟。缓冲甘油封片，荧光显微镜下检查。实验结果表明人干细胞增殖及向肝细胞转化。
实验例3本实验例涉及脐带血来源的干细胞对于肝脏损伤的修复。
裸鼠肝损伤模型造膜以40％CCl4橄榄油，0.3ml/100g，2次/周，皮下注射，6周制成肝纤维化模型。免疫磁珠阳性筛选获得实验所需脐带血CD34+细胞，并建立细胞药物筛选平台。
依实验分组情况进行实验，CD34+细胞用Hoechest33342、PKH26双标，尾静脉注射促肝细胞生长因子(市售产品)，首次因子剂量加倍，以后每天皮下注射追加促肝细胞生长因子。定期处死动物，取肝、脾，制成冰冻切片、石蜡切片。以紫外荧光显微成像、激光共聚焦细胞仪，进行细胞形态学鉴定。参见图1-3。
以PCR技术进行细胞人源性检测。提取组织中的DNA，用PCR的方法特异性的扩增人Alu序列，用于区分人和鼠的细胞。设立人肝阳性对照、鼠肝阴性对照。PCR步骤1mm3大小的组织块置于EP管中，加25μl 1×TE缓冲液，捣碎组织块，取1μl组织浆置于PCR反应管中，加基因释放剂20μl，振荡10-30秒，加一层石蜡油，置微波炉中加热5-7分钟，置预调至80-90度的扩增仪上，分别按要求加入引物、Mg2+、dNTP、ddH2O、TaqDNA聚合酶，进行反应。反应结束后，进行2％琼脂糖凝胶电泳，观察扩增条带。如果PCR扩增有阳性结果，可进一步通过用人Alu序列的核酸探针进行原位杂交鉴定。CD34+CD38+双标，Confolcal检测进行细胞造血干细胞性质检测。
采用免疫组化方法进行肝性化检测，设立人肝阳性对照、鼠肝阴性对照。免疫组化步骤载玻片酸洗、预处理、石蜡切片处理、冰冻切片处理。染色步骤3％H2O2室温孵育5～10分钟，以消除内源性过氧化物酶活性，蒸馏水冲洗，PBS浸泡5分钟。饱和处理内源性生物素，将切片浸入25μg/ml亲和素溶液中15分钟，PBS清洗15分钟后即可染色。蛋白酶消化或抗原修复，具体按要求进行。5-10％正常二抗来源的动物血清封闭(PBS稀释)，室温孵育10分钟，倾去血清，勿洗，滴加适当比例稀释的一抗工作液，37度孵育1-2小时或4度过夜。(置湿盒中)PBS冲洗，5分钟3次。滴加适当比例稀释的生物素标记的二抗(1％BSA-PBS稀释)，37度孵育10-30分钟。PBS冲洗，5分钟3次。滴加适当比例稀释的LRP标记的链霉卵白素(PBS稀释)，37度孵育10-30分钟，PBS冲洗，5分钟3次。显色剂显色(DAB或AEC)，自来水充分冲洗，复染(苏木素)，正常羊血清封片，观察。
上述结果表明，所制备的干细胞可以用于治疗、修复病变或失去功能的组织或器官。
实施例4干细胞诱导因子是来源于人类或哺乳类动物胚胎肝脏的多肽类转化因子。其生产方法是取健康未哺乳新生牛、乳猪或乳羊等哺乳类动物的肝脏处理后，冰浴中在匀浆器匀浆，过滤组织碎片，超声波细胞粉碎(冰浴)，高温变性，醇沉，离心，取沉淀物溶于0.02M Tris-HCL(PH7.7)，DEAE离子交换树脂层析分离(或研磨、离心后经截留分子量小于20kD的滤膜过滤，滤液经浓缩冻干，用Sephadex LH 20层析柱制备层析分离分子量0.8-11kD的组分，以DEAE离子交换层析分离。)0-0.7M NaCl连续梯度洗脱，收集0.5M NaCl处洗脱液，冻干或制成无菌水溶液、颗粒剂、胶囊等，冷暗处保存，即得。
本品鉴别采用紫外分光光度法测定。浓度为1mg/ml时PH为6.8，蛋白质、异常毒性、过敏试验、无菌等检查均符合《中国药典》2000年版(二部)各项下要求。
干细胞诱导因子的活性鉴定，采用(1)运用流式细胞仪分离人脐血中的造血干细胞。CD34抗体标记，采用流式细胞仪分选CD34+细胞，并以无血清培养基调整细胞浓度为1×105个/ml细胞，按每孔1×104个细胞接种于96孔培养板。(2)以MTT法测定干细胞增殖，以无血清培养基制备单细胞悬液，以每孔1×104个细胞接种于96孔培养板中，每孔体积为200μl，培养3天，接种细胞。每孔加入MTT溶液20μl(5mg/ml)，孵育4小时。1000转/分，离心5分钟。弃培养板孔内上清。每孔加入150μl二甲基亚砜，震荡15分钟。酶联免役检测仪测定OD570。(3)免疫组化法检查干细胞是否向肝细胞转化，采用细胞涂片，丙酮固定10分钟。加稀释一抗(白蛋白1∶50；CK81∶10)37℃×40分钟。PBS洗3×3分钟。加FITC标记的二抗(1∶50稀释)37℃×40分钟。PBS洗3×3分钟。缓冲甘油封片。荧光显微镜下检查。实验表明干细胞诱导因子能促进人干细胞增殖及向肝细胞转化。
干细胞诱导因子潜在药物疗效的评价，在整体动物水平探索干细胞诱导因子对肝脏疾病的治疗作用，在整体动物水平和细胞水平上评价在造血干细胞向肝细胞转化过程中干细胞诱导因子的作用。免疫磁珠阳性筛选获得实验所需脐带血CD34+细胞，并建立细胞药物筛选平台。细胞冻存或细胞浓度调至1×106培养，为避免胞内冰晶损伤和溶液损伤，采用人胚胎细胞较多应用的玻璃化冻存方法。CD34+细胞用Hoechest33342、PKH26双标尾静脉注射，加干细胞诱导因子组首次因子剂量加倍，以后每天皮下注射追加因子。定期处死动物，取肝、脾，制成冰冻切片、石蜡切片。采用紫外荧光显微成像、激光共聚焦细胞仪进行细胞形态学鉴定。提取组织中的DNA，用PCR的方法特异性的扩增人Alu序列，用于区分人和鼠的细胞。进行细胞人源性检测。PCR扩增有阳性结果后，进一步通过用人Alu序列的核酸探针进行原位杂交鉴定。以CD34+CD38+双标，Confolcal进行造血干细胞性质检测。采用免疫组化方法进行肝性化检测。所用动物均为裸鼠肝纤维化损伤模型。CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，尾静脉注射入裸鼠，加干细胞诱导因子SIF，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测，结果见图1。CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，尾静脉注射入裸鼠，加SIF的PBS缓冲液，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测，结果见图2。CD34+细胞，Hoechest33342、PHK26双标，尾静脉注射入裸鼠，取肝制成冰冻切片，激光共聚焦细胞仪检测，结果见图3。实验结果表明干细胞诱导因子对肝脏疾病的具有良好的治疗作用，在造血干细胞向肝细胞转化过程中干细胞诱导因子具有明显的促进作用，可阻止肝细胞坏死，肝细胞DNA的合成明显加快，促进肝细胞再生的作用，加速肝脏组织的修复。
实施例5胚胎猪肝来源的干细胞诱导因子取新鲜胚胎猪肝，用无钙镁HBSS缓冲液肝脏灌流，剪切成小块(1-3mm2)研磨，离心后经截留分子量小于20kD的滤膜过滤，滤液经浓缩冻干，用Sephadex LH20层析柱制备层析分离分子量0.8-11kD的组分，以DEAE离子交换层析分离。冷冻干燥后，无菌分装。
每批含量和活性由药典标准方法测定。
无菌提取的胚胎干细胞或干细胞克隆来源的干细胞，静注给予治疗107个/60kg后治疗组给予肌注或静注干细胞转化因子100ug/kg一日一次，10-14天为一疗程。
治疗效果鉴定可见肝脏干细胞增殖并有分化趋势，临床检测各肝功能逐渐恢复。
质量标准及临床应用均同前。
实施例6新生牛来源的干细胞诱导因子取健康未哺乳新生牛的肝脏，用无钙镁HBSS缓冲液肝脏灌流，高速组织捣碎机捣碎，离心后经截留分子量小于20kD的滤膜过滤，滤液，用Sephadex LH 20层析柱制备层析分离分子量0.8-11kD的组分，以离子交换树脂层析分离。浓缩后冻干，无菌分装，即得。
实施例7新生猪肝来源的干细胞诱导因子取新生健康未哺乳猪的肝脏，经处理后，在匀浆器中匀浆(冰浴)，经截留分子量小于20kD的滤膜过滤，用Sephadex LH 20层析柱制备层析分离分子量0.8-11kD的组分，以DEAE离子交换层析分离，5ml/min流速上样，收集0.5M NaCl处洗脱液，制成无菌水溶液，4℃以下保存，即得。
质量标准及临床应用基本同前。
权利要求
1.一种干细胞复合药物，包括干细胞和肝细胞诱导因子；其中所述的干细胞是以人或其他哺乳动物的胚胎、脐带血、脊髓为原料，采用免疫磁珠阳性筛选制备的干细胞；所述的肝细胞诱导因子由哺乳类动物胚胎或幼体肝脏中提取经层析方法分离、纯化的具有生物学活性的小分子量多肽，分子量为0.8-6KD，优选1.2-6KD；
2.根据权利要求1所述的一种干细胞复合药物，其制备方法包括如下步骤1)将原料稀释得到稀释液；2)单核细胞的获得；3)免疫磁珠阳性筛选。
3.根据权利要求2所述的一种干细胞复合药物，其制备方法的步骤1)中的原料稀释为以20ml枸橼酸-枸橼酸钠(简称ACD)和葡萄糖(简称CB)的PBS缓冲溶液稀释脐带血或脊髓块等，得到脐带血或脊髓稀释液；缓冲溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4。或将人或其他哺乳动物的胚胎匀浆后稀释。
4.根据权利要求2所述的一种干细胞复合药物，其中步骤2)中通过下述方法获得单核细胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll将脊髓或胚胎稀释液分层，4℃800g离心30分钟，收集界面层后，在4℃ 500g离心20分钟，弃上清，得到脊髓单核细胞收集界面层。
5.根据权利要求4所述的一种干细胞复合药物，上还包括采用流式细胞仪分选干细胞。
6.根据权利要求2所述的一种干细胞复合药物，其中步骤2)中通过下述方法获得单核细胞按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll将脐带血稀释液分层，4℃ 800g离心30分钟，收集界面层后，在4℃ 500g离心20分钟，弃上清，将弃上清后的沉淀物用红细胞裂解液4℃下裂解10分钟，用PBS缓冲液洗涤细胞，300g离心20分钟，采用流式细胞仪分选干细胞，得到脐带血的单核细胞(MNC)。
7.根据权利要求2所述的一种干细胞复合药物，步骤3)中的免疫磁珠阳性筛选为Dynabeads M-450 CD34洗涤，置于磁板(MPC)1分钟，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次，混合磁珠(MACS，Miltenyi公司产品)和脐带血的单核细胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分钟，阳性筛选CD34+细胞；玫瑰花环状细胞—磁珠重新悬起，置于磁板(MPC)2分钟，弃清液，重复3次，得玫瑰花环状细胞—磁珠，悬于100μl PBS缓冲液；Detachabead CD34解离细胞，微旋孵育45分钟，加2ml PBS缓冲液，混匀，置于磁板(MPC)2分钟，收集细胞清液，重复3次，汇集细胞清液，置于MPC 2分钟，除去残留磁珠，将细胞清液移入锥形试管；离心、洗涤2次，细胞计数，流式细胞仪FACS检测；其中MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl。
8.根据权利要求1所述的一种干细胞复合药物，其特征在于所述的肝细胞诱导因子的制备方法是取健康未哺乳新生牛、乳猪或乳羊等哺乳类动物的肝脏处理后，冰浴中在匀浆器匀浆，过滤组织碎片，超声波细胞粉碎，高温变性，醇沉，离心，取沉淀物溶于0.02M Tris-HCL，PH7.7，DEAE离子交换树脂层析分离，或研磨、离心后经截留分子量小于20kD的滤膜过滤，滤液经浓缩冻干，用Sephadex LH20层析柱制备层析分离分子量0.8-11kD的组分，以DEAE离子交换层析分离；0-0.7M NaCl连续梯度洗脱，收集0.5M NaCl处洗脱液，冻干或制成无菌水溶液、颗粒剂、胶囊等，冷暗处保存。
9.根据权利要求1所述的干细胞复合治疗药物，其特征在于可制成注射用冻干制剂、注射液、颗粒剂或胶囊剂型。
10.权利要求1所述干细胞复合药物的制备方法，包括(1).干细胞的制备以20ml枸橼酸-枸橼酸钠(简称ACD)和葡萄糖(简称CB)的PBS缓冲溶液稀释脐带血或脊髓块等，得到脐带血或脊髓稀释液；缓冲溶液中ACD∶CB＝1∶6，CB∶PBS＝1∶4；或将人或其他哺乳动物的胚胎匀浆后稀释。按照Ficoll∶CB＝3∶7的量用Ficoll将脊髓或胚胎稀释液分层，4℃ 800g离心30分钟，收集界面层后，在4℃ 500g离心20分钟，弃上清，得到脊髓或或胚胎单核细胞收集界面层。用流式细胞仪分选干细胞。免疫磁珠阳性筛选Dynabeads M-450 CD34洗涤，置于磁板(MPC)1分钟，弃清液，PBS缓冲液洗涤2次，混合磁珠和脐带血的单核细胞的CD34溶液，4℃微旋孵育30分钟，阳性筛选CD34+细胞；玫瑰花环状细胞—磁珠重新悬起，置于磁板(MPC)2分钟，弃清液，重复3次，得玫瑰花环状细胞—磁珠，悬于100μl PBS缓冲液；Detachabead CD34解离细胞，微旋孵育45分钟，加2ml PBS缓冲液，混匀，置于磁板2分钟，收集细胞清液，重复3次，汇集细胞清液，置于MPC 2分钟，除去残留磁珠，将细胞清液移入锥形试管；离心、洗涤2次，细胞计数，流式细胞仪FACS检测。其中MNC∶Dynabeads M-450 CD34∶Detachabead CD34＝4×108∶4×107∶4×107＝1ml∶100μl∶100μl；(2).肝细胞诱导因子取健康未哺乳新生牛、乳猪或乳羊等哺乳类动物的肝脏处理后，冰浴中在匀浆器匀浆，过滤组织碎片，超声波细胞粉碎，高温变性，醇沉，离心，取沉淀物溶于0.02M Tris-HCL，DEAE离子交换树脂层析分离，或研磨、离心后经截留分子量小于20kD的滤膜过滤，滤液经浓缩冻干，用Sephadex LH 20层析柱制备层析分离分子量0.8-11kD的组分，以DEAE离子交换层析分离；0-0.7M NaCl连续梯度洗脱，收集0.5M NaCl处洗脱液，冻干或制成无菌水溶液、颗粒剂、胶囊等，冷暗处保存，即得。
全文摘要
本发明涉及一种干细胞复合药物、其制备方法及其在用于治疗各种肝病药物上的应用，所述干细胞复合药物包括干细胞和肝细胞诱导因子；其中所述的干细胞是以人胚胎、脐带血、脊髓等为原料，采用免疫磁珠阳性筛选制备的干细胞；所述的肝细胞诱导因子由哺乳类动物胚胎或幼体肝脏中提取经层析方法分离、纯化的具有生物学活性的小分子量多肽；使用时二者协同作用，促进异源干细胞在肝脏的存活及向肝脏细胞的转化。
文档编号A61K35/54GK1397344SQ0212363
公开日2003年2月19日 申请日期2002年7月2日 优先权日2001年7月2日
发明者韩梅, 王宁, 李凌松, 黄小华 申请人:北京北医基因科技投资有限公司