专利名称：异种无细胞真皮支架及其制备方法
技术领域：
本发明涉及医学皮肤组织工程技术领域，是一种新型的异种无细胞真皮支架及其制备方法。
背景技术：
严重深度烧、创伤及难愈性溃疡等都需要解决快速有效封闭创面的问题。目前临床上主要利用自体皮封闭创面，不仅会增加新创面，而且对于大面积皮肤缺损患者常常存在自体皮源不足的问题。为此，希望通过组织工程技术在体外构建皮肤替代物，这种人工皮肤由真皮支架和种子细胞组成，但至今尚无理想的真皮支架。目前国外临床应用的真皮支架产品Alloderm是将异体皮通过去除其中的细胞成分而获得，虽然具有较好的临床效果，但存在来源有限、价格昂贵、病毒感染等问题。异种皮虽然来源丰富，尤其是猪皮，其真皮结构与人较为接近，但目前国内还没有成熟产品，动物实验和临床试验结果表明，其存在血管化速度慢、具有免疫原性和占位性(不能被新生组织及时取代)等问题。
发明内容
本发明采用具有丰富来源的乳猪皮为皮源，通过适当改变其空间结构和表面物理化学性状，从而达到加快血管化速度、降低免疫排斥反应和占位性的目的。
制备方法如下试剂与材料Dispase II酶Sigma公司，胰蛋白酶Difco进口分装，NaCl上海建鑫化工试剂厂、SDS上海华舜生物工程有限公司、戊二醛 中国医药(集团)上海化学试剂公司去表皮液0.025％Dispase II、1mol/L NaCl的无菌水溶液1.取皮考虑到皮肤的色泽和胶原成分，选用白色乳猪皮为皮源，体重不超过40kg，取其腹侧、背部皮，修剪去除皮下组织。
2.制备无基底膜的真皮支架，以便与自体刃厚皮结合封闭创面(1)分离真皮层利用劈皮机进一步去除皮下组织和部分真皮层，再用劈皮机分离真皮层，厚度不超过0.3mm，用0.05％洗必泰溶液浸泡消毒，无菌生理盐水充分漂洗；
(2)去细胞成分将分离到的真皮层在室温下用0.5％ SDS溶液或0.5％Triton X-100溶液作用24～48小时，振荡或搅拌，得无细胞真皮；(3)修饰空间结构将无细胞真皮用无菌生理盐水充分漂洗，而后用0.25％胰蛋白酶(PBS溶液配制，pH 7.0～7.4)浸泡，4℃，作用2～4小时，适度振荡或搅拌，从而真皮胶原纤维间隙增加，以便为创面细胞增殖和新生胶原的分泌提供适当的空间，加快血管化速度，降低占位性的发生；(4)修饰表面物理化学性状将上述无细胞真皮用无菌生理盐水充分漂洗，而后用0.02％新鲜配制的戊二醛溶液浸泡，室温下作用10～30min，以便将暴露的氨基酸残基侧链羟基封闭，降低免疫原性；(5)消毒用无菌生理盐水充分漂洗后，封装，60Co 100 Gy消毒，即成无基底膜真皮支架产品。
3.制备具有基底膜的真皮支架(1)制备皮层利用劈皮机先去除乳猪皮的皮下组织和部分真皮层，所剩余的皮层中含真皮层和表皮层，厚度不超过0.3mm，将其用0.05％洗必泰溶液浸泡消毒，无菌生理盐水充分漂洗；(2)去表皮层将所得皮层用去表皮液4℃浸泡24～48小时，揭去表皮层，得真皮层。其余各步骤与上述制备无基底膜真皮支架的第(2)～(5)相同，制成具有基底膜的真皮支架。
具体实施例方式实施例1制备无基底膜的真皮支架1.取皮考虑到皮肤的色泽和胶原成分，选用白色乳猪皮为皮源，体重不超过40kg，取其腹侧、背部皮，修剪去除皮下组织。
2.分离真皮层利用劈皮机先去除皮下组织和部分真皮层，再用劈皮机分离所需真皮层，厚度0.3mm；用0.05％洗必泰溶液浸泡消毒，无菌生理盐水漂洗3次，每次10分钟；3.去细胞成分将分离到的真皮层用0.5％ SDS溶液，在室温下作用36小时，振荡，得无细胞真皮。
4.修饰空间结构用无菌生理盐水充分漂洗(3次，每次10分钟)无细胞真皮，而后用0.25％胰蛋白酶(PBS溶液配制，pH 7.0)浸泡，4℃，作用2小时，适度振荡，使真皮胶原纤维间隙增加；5.修饰表面物理化学性状用无菌生理盐水充分漂洗(3次，每次10分钟)上述无细胞真皮，而后用0.02％新鲜配制的戊二醛溶液浸泡，室温下作用20分钟；6.消毒用无菌生理盐水充分漂洗(3次，每次10分钟)，封装，60Co 100 Gy消毒，得无基底膜真皮支架。
使用时，将真皮支架放置在深度皮肤缺损创面上，上面覆盖自体刃厚皮(0.3mm)。优点取刃厚皮结合真皮支架封闭创面可以达到中厚皮或全厚皮的效果，同时降低供皮区瘢痕增生的可能性；供皮区可快速愈合，必要时可以多次供皮。
实施例2制备具有基底膜的真皮支架1.制备皮层取皮后利用劈皮机先去除乳猪皮的皮下组织和部分真皮层，所剩余的皮层中含真皮层和表皮层，厚度不超过0.3mm，将其用0.05％洗必泰溶液浸泡消毒，无菌生理盐水漂洗3次，每次10分钟；2.去表皮层上述所得皮层用去表皮液(含0.025％Dispase II、1mol/L NaCl的无菌水溶液)4℃浸泡36小时，揭去表皮层，得真皮层。其余各步骤同实施例1的第3-6，得具有基底膜的真皮支架。
使用时，先与人成纤维细胞、表皮细胞共培养，真皮面种植成纤维细胞，基底膜面培养表皮细胞，得到组织工程化的皮肤替代物。优点以异种无细胞真皮为支架在体外构建复合皮，用于封闭深度皮肤缺损，其性状和功能接近于自体皮。对供皮区的依赖性小。
权利要求
1.一种异种无细胞真皮支架的制备方法，包括取皮、分离真皮层、去细胞成分、消毒、封装，其特征在于还包括对无细胞真皮层的空间结构和表面物理化学性状的修饰，亦即将无细胞真皮层用胰蛋白酶浸泡处理，使真皮胶原纤维间隙增加；再用戊二醛溶液浸泡，以改变真皮支架表面的物化性状。
2.按权利要求1所述异种无细胞真皮支架的制备方法，其特征在于异种皮为乳猪皮，所分离的真皮层无基底膜。
3.按权利要求1所述异种无细胞真皮支架的制备方法，其特征在于异种皮为乳猪皮，所分离的真皮层具有基底膜。
4.权利要求1所述异种无细胞真皮支架制备方法所制得的真皮支架。
5.权利要求2所述异种无细胞真皮支架制备方法所制得的无基底膜的真皮支架。
6.权利要求3所述异种无细胞真皮支架制备方法所制得的具有基底膜的真皮支架。
7.权利要求4、5、6所述真皮支架用于封闭烧、创伤创面的用途。
全文摘要
本发明涉及医学皮肤组织工程技术领域,是一种新型的异种无细胞真皮支架及其制备方法。严重烧、创伤及难愈性溃疡等都需快速有效封闭创面。异种皮来源丰富,尤其是猪皮,其真皮结构与人较为接近,但目前用猪皮制作的真皮支架存在血管化速度慢、具有免疫原性和占位性等缺陷。本发明选用乳猪皮制作真皮支架,对无细胞真皮支架进行空间结构和表面物化性状修饰,亦即将无细胞真皮层用胰蛋白酶处理,使真皮胶原纤维间隙增加,以利于创面的细胞增殖和加快血管化速度;用戊二醛溶液浸泡处理,以改变真皮支架表面的物化性状,降低免疫排斥反应和占位性。
文档编号A61L27/00GK1387923SQ02112478
公开日2003年1月1日 申请日期2002年7月11日 优先权日2002年7月11日
发明者夏照帆, 田建广, 唐洪泰, 郇京宁, 肖仕初, 程大胜, 王光毅 申请人:中国人民解放军第二军医大学