专利名称：胸腺刺激用于免疫改善的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及动物的免疫应答领域，尤其是通过胸腺刺激改善免疫应答的领域。
与本发明相关的背景技术免疫系统免疫系统的主要功能是区分“外来”和“自身”抗原，并且做出相应地应答以保护机体免受感染。这个定义也可称作区分“好的”和“坏的”分子。在正常免疫应答中，事件的序列涉及专门的抗原呈递细胞(APC)俘获外来抗原，并且将其加工成小肽片段，其在APC表面呈现为主要组织相容性复合物(MHC)分子的裂片。MHC分子可以是在所有的有核细胞上进行表达的I类分子(被细胞毒性T淋巴细胞(Tc)识别)，或者是主要由免疫系统细胞进行表达的II类分子(被辅助T淋巴细胞(Th)识别)。
静息APC用来俘获抗原，并将其加工成肽片段，然后被表达在表面的MHC分子。这些更加活化的APC随后变得更容易刺激T细胞，而不是俘获和加工另外的抗原。Th细胞识别APC上的MHCII/肽复合物，并作出应答。
存在两种类型的Th细胞，通过它们产生的不同类型的可溶性调节因子加以区别。Th1细胞主要产生IL2和γ干扰素(IFNγ)，后者如果出现在幼稚T细胞与抗原初始接触时，则可促进细胞介导免疫力(主要是Tc)的优先激活。Th2细胞表达一种不同类型的细胞因子，尤其是IL4、5、和10，其通过对于特定抗原有效的可产生抗体的B细胞诱导体液免疫。在某些情况下这可通过产生IgE而导致不适当的过敏应答。
Th细胞在事实上所有免疫应答中的重要性在HIV/AIDS中得到最好体现，在艾滋病患者体内的Th细胞被病毒破坏消失引起严重的免疫缺陷，最终导致死亡。由于它们作为免疫调节细胞的重要性，Th1和Th2细胞之间的平衡对免疫应答的本质具有深刻影响。这种失衡可以通过在免疫应答起始时发育异常或不适当的激活而产生。这可导致多种疾病，例如过敏症、癌症、和自身免疫性病症。
胸腺有人认为胸腺是免疫系统的主要器官，因其是产生T淋巴细胞的主要部位。其作用是从血液中吸引适当的来源于骨髓的前体细胞，并且诱导其对T细胞谱系的支持，包括产生抗原的T细胞受体(TCR)所必需的基因重排。与此相关的是程度显著的细胞分裂以使T细胞数量增加，从而提高识别和清除所用外来抗原的可能性。这一巨大的潜在的相异性意味着对于身体可能遇到的任一抗原、多种淋巴细胞可以用不同程度的结合强度(亲和力)对其进行识别，并做出不同程度的应答。然而，与B细胞不同的是，T细胞识别抗原的一个奇怪特征是TCR只识别与MHC分子物理上相联系的肽片段；正常情况下这是自身的MHC，而且这一能力只有胸腺才有。这一过程称为正性选择，并且是皮质上皮细胞独有的特征。如果TCR无法与自身的MHC/肽复合物结合，T细胞会因为“忽略”而死亡。T细胞的继续成熟需要某种程度的经由TCR的信号传导。
经过皮质的选择，发育中的胸腺细胞获得功能上的成熟和迁移能力，并且进入血流，成为幼稚(还未与抗原接触的)T细胞。它们在淋巴和血液之间游走，寻觅抗原。如果3-4周后，它们还没有被刺激，它们便容易被其他新近从胸腺迁移出的细胞从外周T细胞库中清除出去。这一胸腺输出和外周T细胞替换系统提供了T细胞质量的持续补充，将稳态保持在适当水平。
虽然胸腺对于一个功能性的免疫系统来说是不可缺少的，它每天将T细胞容量的1％释放到血流中，但是哺乳动物的一个很明显的异常现象是由于性类固醇产生，胸腺发生严重的萎缩。这甚至在儿童时期就可开始，但在青春期开始愈发严重。对于健康个体来说，产生和释放新T细胞这一功能的丧失并不总是带来临床后果。事实上，即便老年胸腺发生萎缩，仅为年轻胸腺的1％(见下)，它仍然释放非常少量的新生T细胞入血流。尽管这不足以维持外周T细胞亚群的最适水平，但是胸腺仍不是完全休眠，这使得它有可能成为治疗方案的选择目标。
随着年龄逐渐增长，胸腺输出的降低意味着外周T细胞的性质在量和质上都逐渐发生变化。除了血中绝对T细胞数目因其失去刺激而随年龄逐渐减少之外，每次接触抗原以后，相关的抗原特异性幼稚T细胞(那些尚未接触抗原的细胞)也被刺激和发生增殖。其中一个亚群会变成效应器细胞，除去病原体，但这些也将通过抗原诱导的细胞死亡而最后死掉。
另一亚群将转化为记忆细胞，并且为将来与该病原接触提供长期的保护。因此，幼稚T细胞的水平会降低，结果对抗原的应答能力也降低。衰老也导致Th细胞(通过表达式CD4表征)数量相对于Tc细胞(表达CD8)的选择性减少，并且Th1与Th2细胞的比值的失衡。其不发生在正常的年轻动物中，是因为，如上所述，年轻动物体内从胸腺不断输出新生T细胞，从而持续补充外周幼稚细胞库。
胸腺萎缩胸腺在很大程度上受其与神经内分泌系统的双向联系的影响(Kendall，1988)。尤其重要的是垂体、肾上腺、性腺对胸腺功能的交互影响，其中既包括营养的(促甲状腺素或TSH，以及生长激素或GH)，和萎缩的影响(促黄体激素或LH、促卵泡激素或FSH、和促肾上腺皮质激素或ACTH)(Kendall，1988；Homo-Delarche，1991)。实际上胸腺生理学的一个重要特征在于其结构和功能的进行性衰退，其与青春期血循环中性类固醇产生的增加成比例。(Hirokawa and Makinodan，1975；Tosi等，1982以及Hirokawa等，1994)。这些激素作用的精确靶位和诱导胸腺萎缩的机制尚未确定。由于胸腺是产生和维持外周T细胞库的主要部位，因此普遍认为胸腺萎缩是导致老年人以免疫异常为基础的疾病增多的主要原因。尤其是，以T细胞依赖性免疫功能(如溶细胞T细胞活性和促有丝分裂反应)的降低为代表的免疫系统缺陷，可以从老年时期免疫缺陷、自体免疫病和肿瘤的发病率增高得到反映(Hirokawa，1998)。
胸腺萎缩的影响反映在外周，随着胸腺对T细胞库输入的减少，导致T细胞受体(TCR)免疫细胞库的多样性减少。还观察到改变的细胞因子的改变(profile)(Hobbs等，1993；Kurashima等，1995)、CD4+和CD8+亚群的改变、以及由幼稚T细胞向记忆细胞的转变(Mackall等，1995)。此外，胸腺生成的效率随年龄而下降，以致免疫系统在T细胞衰竭后再生正常数量T细胞的能力最终丧失(Mackall等，1995)。但是，最近由Douek等(1998)所进行的工作显示，在人类中，胸腺输出即使在老年也可能发生。TCR基因重排的外切DNA产物被用来证实老年患者HIV感染后循环血中存在重新产生的幼稚T细胞。这一输出率和随后出现的外周T细胞库再生还需要进一步研究，因为经化疗的青春期后的患者与青春期前的患者相比，T细胞库的再生率显著降低，尤其是CD4+T细胞(Mackall等，1995)。Timm和Thoman的工作进一步证明了这一点(1999)，他们研究显示虽然CD4+T细胞在老年小鼠骨髓移植(BMT)后再生了，但由于外周微环境的老化，其表现出对记忆细胞的倾向性，胸腺产生幼稚T细胞的能力亦较差。
胸腺主要由正在发育的胸腺细胞组成，其散布在不同的基质细胞(主要是上皮细胞亚群)中，这些基质细胞构成微环境，并且提供T细胞最佳发育所需要的生长因子和细胞间相互作用。胸腺细胞和控制其分化和成熟的上皮细胞亚群之间共生性的发育关系(Boyd等，1993)意味着性类固醇抑制可以发生在任何细胞类型，其随后影响其他类型细胞的状态。胸腺细胞本身存在内在缺陷的可能性比较小，因为以往使用辐射嵌合体的研究表明，骨髓(BM)干细胞不受年龄的影响(Hirokawa，1998；Mackall and Gress，1997)，并且与年轻的BM细胞具有相似程度的胸腺再生潜能。此外，老年动物的胸腺细胞至少在某些程度上保留了分化能力(Mackall andGress，1997；George and Ritter，1996；Hirokawa等，1994)。然而，Aspinall(1997)最近的工作显示，在前体CD3-CD4-CD8-三阴性(TN)群体中的缺陷发生于TCRγ链基因重排阶段。
衰老不是导致T细胞丧失的唯一条件，严重的T细胞丧失也发生于如HIV/AIDS及随后的化疗或放疗。此外，在有活跃胸腺的年轻人中，免疫系统的恢复(通过T细胞介导的免疫的恢复)发生得相对较快(2-3个月)，而青春期后的人由于胸腺萎缩则需要1-2年。
疫苗疫苗可分成两类提供主动免疫的和提供被动免疫的。被动免疫涉及给患者施用异源抗体来对抗患者体内的外来抗原或患者将要遭遇的抗原。此类免疫通常存在时间短，因为患者自身的免疫系统没有参与。本发明披露的是主动免疫，即给患者施用抗原，因而患者的免疫系统形成对抗原特异性抗体做出应答。
有几个参数可影响免疫应答的性质和范围抗原水平和类型、接种部位、适当APC的有效性、个体健康状况、以及T细胞和B细胞库的状态。其中，T细胞是最脆弱的，因为从青春期开始性类固醇诱导了胸腺输出的关闭。因此，尽管对于具有代表特异性的主要库有幼稚T细胞的存在，以及有正常的Th1与Th2细胞和Th与Tc细胞的比值，可能应答的T细胞数量为最佳，任何免疫计划也应该仅仅在逻辑上进行。细胞因子的水平和种类也要进行调整，使其适合于所需要的应答。
通过抑制性类固醇的分泌，例如在促黄体激素释放激素(LHRH)向垂体信号传递水平，激活萎缩的胸腺，提供了产生具有不同库的TCR类型的新生幼稚T细胞群体的有效方法。这一过程通过使用导致最优胸腺生成的正常调节因子和通路，将胸腺有效地逆转至青春期前状态。
发明简述本发明披露了有关改善动物对接种的免疫应答的方法。这是通过定量和定性地恢复外周T细胞库，尤其是通过提高幼稚T细胞水平来实现的。这些幼稚T细胞随后能以更大的程度对呈递的外来抗原作出应答。
本发明的方法依赖于阻断传向胸腺的性类固醇介导的信号。在优选实施例中，使用化学阉割。在另一实施例中使用外科阉割。将胸腺逆转至青春期前状态，从而重新激活它。
在另一特殊实施例中，传向胸腺的性类固醇介导的的信号的阻断通过给予LHRH的激动剂或拮抗剂、抗雌激素抗体、抗雄性激素抗体、被动(抗体)或主动(抗原)的抗LHRH接种疫苗、或其组合(“阻断剂”)。
在优选的实施例中，阻断剂是以肽缓释配方的形式给予的。肽缓释配方的例子参见WO98/08533，其全部内容结合于此作为参考。
附图简要描述
图1A和B阉割前和阉割后胸腺细胞数目的变化。胸腺萎缩导致胸腺细胞数随年龄显著减少。阉割2周后，细胞数目增加到年轻成年体水平。阉割3周后，数目从这一水平显著增加，到阉割后4周时细胞数目稳定下来。***＝与年轻成年体(2个月)胸腺相比显著不同，P＜0.001。
图2A-C(A)脾细胞数目不受年龄以及阉割影响。外周B∶T细胞比值仍保持恒定(B)，然而，CD4∶CD8比值随年龄显著降低，(P＜0.001)，并阉割4周后恢复到正常年轻水平。
图3荧光激活的细胞分拣器(FACS)图，显示年龄和阉割对CD4与CD8胸腺细胞数目的影响。每个象限的百分比示于图上。胸腺细胞亚群不随着年龄发生变化，并且阉割后胸腺细胞呈同步扩增。
图4通过结合BrdU脉冲所检测到的胸腺细胞增殖。增殖的胸腺细胞的比例不随年龄和阉割发生变化。
图5A-D年龄和阉割对胸腺细胞亚群增殖的影响。(A)构成整体增殖细胞群的每一亚群的比例增殖细胞中CD8+T细胞的比例显著增加。(B)每个正在增殖的亚群的百分数TN和CD8亚群在2岁时比在2个月时增殖显著减少。阉割2周后，TN群已恢复到正常年轻时的增殖水平，而CD8亚群显著增殖。阉割4周后，其水平等于正常年轻的水平。(C)整体TN增殖情况不随年龄和阉割而变化。然而(D)TN1亚群增殖随年龄而显著降低，阉割4周后仍未恢复到正常水平。***＝高度显著，P＜0.001，**＝显著，P＜0.01。
图6小鼠胸腺内注射异硫氰荧光素(FITC)。在注射24小时后计算外周中FITC+细胞数量。虽然最新胸腺迁移的比例保持恒定，占胸腺细胞数目的1％左右，但在阉割2周后显著降低，RTE细胞数量随年龄显著减少(P＜0.01)。阉割2周后，这些值虽然上升，但仍显著低于阉割2周时年轻小鼠的水平。随年龄增长，CD4+与CD8+RTE比值显著上升，阉割1周后就会恢复正常。
图7A-C用一种化疗试剂环磷酰胺治疗后，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴结(C)细胞数目的变化。注意治疗后1周和2周后，阉割动物的胸腺与未阉割组动物(只用环磷酰胺治疗)相比，胸腺快速扩增。此外，阉割组的脾和淋巴结数目与只用环磷酰胺组相比也明显增加。4周后，细胞数目正常。(每个治疗组和时间点的n＝3-4)。
图8A-C外科阉割一周后用辐辐照(625拉德)后，胸腺(A)、脾(B)和淋巴结(C)细胞数目的变化。注意在治疗后1周和2周，阉割组动物与未阉割组动物(仅采用辐照)相胸腺发生快速扩增。(每个治疗组和时间点的n＝3-4)。
图9A-C同一天进行辐照和阉割后，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴结(C)细胞数目的变化。注意治疗2周后阉割组与未阉割组相比胸腺的快速扩增。然而，所观察到的差别不如治疗前1周小鼠进行阉割时那么显著(图7)(每个治疗组和时间点的n＝3-4)。
图10同一天用一种化疗剂环磷酰胺以及外科或化学阉割治疗后，胸腺(A)、脾(B)、和淋巴结(C)细胞数目的变化。注意治疗1和2周后阉割组动物与未阉割组动物(只用环磷酰胺)相比胸腺的快速扩增。此外，阉割组的脾和淋巴结数目与只用环磷酰胺组相比也明显增加。(每个治疗组和时间点的n＝3-4)。在环磷酰胺治疗后免疫系统的再生中，化学阉割的效果可以与外科阉割相比。
图11用I型单纯性疱疹病毒(HSV-1)进行足垫免疫后淋巴结细胞构成。注意老年阉割组与老年未阉割组相比细胞数目的增多。下图显示了通过FACS就CD25对CD8细胞进行门化的总激活的细胞数。
图12A-C接种HSV-1后，激活LN(淋巴结)中，Vβ10在细胞毒性T淋巴细胞(CTL)上的表达。注意老年小鼠中克隆反应减少，以及阉割后所预期反应的恢复。
图13A-C阉割恢复对HSV-1免疫的反应。(a)与年轻和阉割后小鼠相比，老年小鼠在感染后表现出淋巴结总细胞数的显著降低。(b)HSV-1感染小鼠的LN中激活的(CD8+CD25+)细胞的典型的FACS图。随着年龄或阉割后激活CTL的比例未见差别。(c)通过激活CTL数目的显著减少反映了老年小鼠的淋巴结细胞数目的下降。老年小鼠阉割后可恢复对HSV-1的免疫应答，并且CTL数目与年轻小鼠相当。结果用8-12只小鼠的均值±1SD(标准偏差)表示。**＝与年轻(2个月)小鼠相比，P≤0.01；^＝与老年(未阉割)小鼠相比，P≤0.01。
图14除去用HSV-1进行免疫的小鼠的腘窝淋巴结，并培养3天。用未经免疫的小鼠进行CTL试验，以作为裂解的背景水平的对照(测定51Cr-释放)。结果用8只小鼠的平均值3次测量值±1SD(标准偏差)来表示。在E∶T比值为10∶1和3∶1下，老年小鼠均显示CTL活性的显著降低(p≤0.01，*)，这显示淋巴结内存在的特异性CTL的百分数的降低。老年小鼠阉割后CTL反应恢复到年轻成年小鼠的水平。
图15A和B分析CD4+T辅助细胞辅助和VβTCR对HSV-1感染的反应。从HSV-1感染后的D5(第5天)除去腘窝淋巴结，并在体外分析(a)CD25、CD28、和特异性TCRVβ标记物和(b)CD4/CD8T细胞的表达。(a)表达Vβ10或Vβ8.1的活化的(CD25+)CD8+T细胞的百分率，用每组8只小鼠的均值±1SD来表示。结果不随年龄或是否阉割而变化。(b)在静息LN群中CD4/CD8比值随年龄增长而降低。阉割后恢复。结果用每组8只小鼠的均值±1SD来表示。***＝与年轻和阉割小鼠相比p≤0.001。
图16A-DLy5同种小鼠骨髓移植后，胸腺(A)、脾(B)、淋巴结(C)、和骨髓(D)中细胞数目的变化。注意在治疗后所有时间点，阉割动物与未阉割动物相比胸腺的快速扩增。此外，阉割组的脾和淋巴结数目与只用环磷酰胺组相比显著增加。(每个治疗组和时间点的n＝3-4)。阉割小鼠与未阉割动物相比同种细胞(Ly5.2)显著增加(没有显示数据)。
图17A和B胎儿肝重建后阉割和未阉割小鼠中胸腺细胞数目的变化。(每个测试组的n＝3-4)。(A)2周时，阉割小鼠的胸腺细胞数目处于正常水平，显著高于未阉割小鼠(*p≤0.05)。4周后阉割小鼠的胸腺呈肥大。未非阉割小鼠的细胞数目保持在对照水平以下。(B)CD45.2+细胞CD45.2+细胞是显示供体来源的标记物。重建2周后，阉割和未阉割的小鼠都出现源于供体的细胞。治疗4周后，阉割小鼠胸腺中大约85％的细胞是来源于供体的。未阉割小鼠胸腺中未见来源于供体的细胞。
图18致死量辐照和胎儿肝脏重建后、以及其后的外科阉割以后，CD4与CD8供体来源的胸腺细胞群的FACS图。每个象限的百分比示于图右方。年龄匹配的对照图是8个月大的Ly5.1同种小鼠的胸腺。阉割和未阉割的小鼠用在CD45.2+细胞门化，只显示来源于供体的细胞。重建2周后，阉割和未阉割小鼠的胸腺细胞亚群未见区别。
图19A和B在致死量辐照、胎儿肝脏重建和外科阉割以后，骨髓性和淋巴样树突状细胞(DC)的数目。(每一测试组的n＝3-4)后面图中对照(在其上划斜线)条图是基于未处理的年龄匹配的小鼠中发现的树突状细胞正常数目。(A)来源于供体的树突状骨髓性细胞重建2周后，DC在非阉割小鼠中呈正常水平。同一时间点，在阉割小鼠中DC显著较多。(*p≤0.05)。4周时，阉割小鼠的DC数仍高于对照水平。(B)来源于供体的淋巴样树突状细胞重建2周后，阉割小鼠的DC数目是未阉割鼠的2倍。治疗4周后，DC数目仍高于对照水平。
图20A和B胎儿肝脏重建后，阉割和未阉割小鼠中总细胞数和CD45.2+骨髓细胞数的改变。每一测试组有3-4只小鼠。(A)总细胞数重建2周后，骨髓细胞数恢复正常。阉割和未阉割小鼠的细胞数目未见明显不同。重建4周后，在阉割与未阉割小鼠之间细胞数目有明显区别(*p≤0.05)。(B)CD45.2+细胞数重建2周后，在阉割和未阉割小鼠骨髓中的CD45.2+细胞数之间未见明显不同。4周时，CD45.2+细胞数在阉割小鼠中仍较高。同一时间点未阉割小鼠中没有任何来源于供体的细胞。
图21A-C胎儿肝脏重建后，在阉割和未阉割小鼠骨髓中T细胞、来源于骨髓和淋巴的树突状细胞(DC)的改变。(每一测试组有3-4只小鼠)图中对照(在其上划斜线)条图是基于未处理的年龄匹配的小鼠的T细胞和树突状细胞正常数目。(A)T细胞数阉割和未阉割小鼠重建2和4周后数目都有所降低。(B)来源于供体的骨髓性树突状细胞阉割和未阉割小鼠重建2周后数目都正常。这一时间点，在阉割和未阉割小鼠的细胞数之间未见明显不同。(C)来源于供体的淋巴样树突状细胞重建2和4周后数目都在正常水平。2周时，在阉割和未阉割鼠之间的细胞数未见明显不同。
图22A和B胎儿肝脏重建后，阉割和未阉割小鼠中总细胞数、和供体(CD45.2+)脾细胞数的改变。(每一测试组有3-4只小鼠)(A)总细胞数重建2周后，细胞数目降低，并且在阉割和未阉割小鼠之间的细胞数未见明显不同。重建4周后，阉割小鼠的细胞数目接近正常水平。(B)CD45.2+细胞数重建2周后，在阉割和未阉割小鼠脾中的CD45.2+细胞数之间未见明显不同。4周时阉割小鼠的CD45.2+细胞数仍较高。在同一时间点，未阉割小鼠中没有来源于供体的细胞。
图23A-C胎儿肝脏重建后，脾T细胞及来源于骨髓和淋巴的树突状细胞(DC)(每一测试组有3-4只小鼠)。图中对照(在其上划斜线)条图是基于未处理的年龄匹配的鼠的T细胞和树突状细胞正常数目。(A)T细胞阉割和未阉割小鼠重建2和4周后数目都有所降低。(B)来源于供体的(CD45.2+)骨髓性树突状细胞重建2和4周后，阉割和未阉割小鼠的DC数目都正常。重建2周时，在阉割和未阉割小鼠的细胞数之间处于正常水平。(C)来源于供体的(CD45.2+)淋巴样树突状细胞重建2和4周后数目处于正常水平。2周时，在阉割和未阉割小鼠的细胞数之间未见明显不同。
图24A和B胎儿肝脏重建后，阉割和未阉割小鼠总细胞数、和供体(CD45.2+)淋巴结细胞数的改变。(每一测试组有3-4只小鼠)(A)总细胞数重建2周后，细胞数处于正常水平，并且在阉割和未阉割小鼠之间未见明显不同。重建4周后，阉割小鼠的细胞数目处于正常水平。(B)CD45.2+细胞数重建2周后，淋巴结供体CD45.2+细胞数在阉割和未阉割小鼠之间未见明显不同。4周时阉割小鼠的CD45.2+细胞数仍较高。在同一时间点，未阉割小鼠中没有来源于供体的细胞。
图25A-C胎儿肝脏重建后，在阉割和未阉割小鼠的肠系膜淋巴结中，T细胞、来源于骨髓和淋巴的树突状细胞(DC)的改变。(每一测试组有3-4只小鼠)图中对照(在其上划斜线)条图是基于未处理的年龄匹配的鼠的T细胞和树突状细胞正常数目。(A)重建2和4周后，阉割和非阉割小鼠中的T细胞数目都有所降低。(B)在阉割鼠和未阉割小鼠中，来源于供体的骨髓性树突状细胞都正常。4周时，它们都减少。在2周时，在阉割和未阉割小鼠的细胞数之间未见明显不同。(C)来源于供体的淋巴样树突状细胞重建2和4周后数目处于正常水平。2周时，在阉割和未阉割小鼠的细胞数之间未见明显不同。
图26对患者(全部超过60岁)的外周血淋巴细胞表型组成进行了分析，这些患者接受了前列腺癌的LHRH激动剂治疗。在LHRH激动剂治疗前和开始治疗4个月后，对患者样品进行分析。治疗前，在所有病人中，每毫升血中总淋巴细胞数在对照值的最低水平。治疗后，6/9的病人总淋巴细胞计数显著上升(有些病例的总淋巴细胞数翻番)。与此对应的是6/9的患者总T细胞数量的上升。在CD4+亚群中，这一升高甚至更为显著，8/9的患者表现出CD4T细胞水平升高。另一不太明显的趋势是4/9患者CD8+亚群水平有所升高，虽然一般来说其升高的程度小于CD4+T细胞。
图27对患者血在LHRH激动剂治疗前和治疗后进行分析显示，T细胞、CD4或CD8T细胞的总体比例上并无显著改变，治疗后CD4∶CD8比值上有不定的变化。这显示治疗对T细胞亚群的内环境稳定的维持具有最小的治疗作用，虽然治疗使得总T细胞数目显著上升。所有值均与对照值有可比性。
图28对进行LHRH激动剂治疗的患者外周血中B细胞和髓样细胞(NK、NKT、和巨噬细胞)的比例进行分析，显示不同亚群内的变化程度有所差别。虽然在治疗后NK、NKT、和巨噬细胞的比例保持相对恒定，但是B细胞的比例在4/9的病人中有所降低。
图29对治疗后外周血中B细胞和骨髓性细胞总数进行分析显示，NK(5/9患者)、NKT(4/9患者)、和巨噬细胞(3/9患者)数量在治疗后明显上升。B细胞数目未见明显趋势2/9患者的水平上升，4/9患者不变，3/9患者的水平降低。
图30A和BLHRH激动剂治疗后所见到的主要变化在外周血的T细胞群体中。尤其是幼稚(CD45RA+)CD4+细胞的比例选择性增高，CD4+T细胞亚群中幼稚(CD45RA+)与记忆(CD45RO+)的比例在6/9患者中有所上升。
图31使用各种激光脉冲能量使皮肤的阻碍效应降低。当使用拟合的曲线来内推数值时，能量低至10mJ辅照皮肤就能使皮肤阻碍效应降低。
图32药物对皮肤的通透。使用胰岛素做样本药物，经激光辅照使皮肤通透性显著增强。
图33给皮肤施加5-氨基乙酰丙酸(ALA)和单个短暂短暂脉冲后，皮肤荧光随时间的变化。强度峰值出现在大约640nm处，并在治疗210分钟后最高(虚线)。
图34不加短暂脉冲，只加入5-氨基乙酰丙酸(ALA)后，皮肤荧光随时间的变化。在各个时间点的强度几乎没有变化。
图35在各种峰值应力下，给皮肤加入5-氨基乙酰丙酸(ALA)和单一短暂脉冲后，比较皮肤荧光的变化。角质层的通透程度取决于峰值应力。
发明详述本发明涉及在患者体内改善免疫应答的方法。该方法通过定量地和定性地恢复外周T细胞库，尤其是幼稚T细胞的水平来加以完成。幼稚T细胞是那些尚未与抗原接触的细胞，因而具有广泛的特异性，即能与多种抗原中的任一种发生反应。作为本发明方法的结果，可以得到一个大的幼稚T细胞库，以对疫苗中的施加的抗原发生应答。
在优选实施例中，传向胸腺的性类固醇介导的信号被阻断，通过萎缩的胸腺被重新激活，从而产生这一幼稚T细胞库。该阻断过程使患者的激素状态发生逆转。优选的产生阻断的方法是阉割。阉割方法包括但不限于化学阉割和外科阉割。
重新激活胸腺的优选方法是通过阻断LHRH对垂体的刺激效应，导致促性腺激素FSH和LH的丧失。这些促性腺激素通常作用于性腺，使其释放性激素，尤其是女性的雌激素和男性的睾丸酮。FSH和LH的丧失导致性类固醇释放的阻断。其直接后果是血浆性类固醇水平的迅速降低，从而，逐渐释放对胸腺的抑制信号。胸腺再生的程度和动力可以通过注射CD34+造血细胞(理想的是自体或同源的)来加以增强。
本发明可以用于任何具有性类固醇驱动的成熟和免疫系统的动物(包括人类)，例如哺乳动物和有袋动物，更好为大型哺乳动物，最好为人类。
术语“再生”、“重新激活”、和“重建”、以及他们的派生词在此交替使用，并指萎缩的胸腺恢复到其活性状态。
本文所使用的“阉割”是指体内的性类固醇的产生和分布的急剧和消失。胸腺完全行使功能时，就可以有效地将患者恢复到青春期前的状态。外科阉割除去患者的性腺。
较少永久性的阉割方式是在一段时间内使用化学试剂，本文称为“化学阉割”。多种化学试剂可以这种方式作用。在施用过程中以及施用后一段时间，患者的激素分泌被关闭。优选地，当化学试剂停用后阉割作用就被逆转。
本发明用于多种情况。例如，在较长时间以后，免疫系统实际上缺乏幼稚细胞。随着这些细胞的减少，对疫苗中的抗原的应答也降低，因为没有足够数量的幼稚细胞来产生这些应答。胸腺的重新激活产生大的幼稚细胞库能够对疫苗作出适当的应答。
此外，患有可诱导长时间的免疫应答的疾病或病症，例如癌症的患者，可能患有抗原特异性“克隆耗损”。虽然病人的幼稚T细胞起初可以对肿瘤上的外源抗原作出适当应答，因而可以产生各种细胞克隆，持续产生针对外来抗原的抗体，在较长一段时间以后，这些克隆将失去它们的生产能力。当患者的胸腺已经萎缩时，能够继续免疫应答的幼稚T细胞库很可能已经相当少，甚至不存在，因此免疫应答实际上已经停止，或者在无法使患者消除肿瘤的水平上运行。重新激活胸腺将产生大的能够对外来肿瘤抗原产生反应的幼稚T细胞库，以防止或减轻“克隆耗损”。
阻断传向胸腺的性类固醇介导的的信号很容易理解，传向胸腺的性类固醇介导的信号可以用本领域熟知的多种方法被阻断，其中有些在本发明加以描述。例如，抑制性类固醇的产生或者阻断一种或多种胸腺内性类固醇受体，都可以实现所需的阻断。也可以施用性类固醇激动剂或拮抗剂、或主动(抗原)或被动(抗体)的抗激素接种疫苗。性类固醇的抑制也可以通过使用一种或多种性类固醇类似物而达到。在有些临床病例中，通过物理阉割永久性地除去性腺可能是适合的。
在优选实施例中，传向胸腺的性类固醇介导的的信号是通过使用性类固醇类似物而阻断，优选促黄体激素释放激素(LHRH)类似物。性类固醇类似物和它们在治疗和化学阉割上的应用已为人们所熟知。这种类似物包括但不限于，如下的LHRH受体(LHRH-R)激动剂布舍瑞林(Hoechst)、Cystorelin(Hoechst)、达必佳(商品名Debiopharm；Ipsen/Beaufour)、地洛瑞林(BalancePharmaceuticals)、戈那瑞林(Ayerst)、戈舍瑞林(商品名Zoladex；Zeneca)、组氨瑞林(Ortho)、亮丙立德(商品名Lupron；Abbott/TAP)、亮丙瑞林(Plosker et al)、黄体瑞林(Wyeth)、美替瑞林(WO9118016)、那法瑞林(Syntex)、和曲普瑞林(美国专利第4,010,125号)。LHRH类似物也包括但不限于如下LHRH-R的拮抗剂阿巴瑞克(商品名Plenaxis；Praecis)、西曲瑞克(商品名；Zentaris)。还包括激动剂的组合、拮抗剂的组合、激动剂与拮抗剂的组合。上述参考文献所披露的内容结合于此作为参考。目前优选的类似物是地洛瑞林(描述于美国专利第4,218,439号)。更完整的目录参见Vickery等，1984。
在一优选实施例中，给予患者LHRH受体(LHRH-R)拮抗剂，随后给予LHRH-R激动剂。这一方法消除或限制在性类固醇分泌降低之前可能出现的任何性类固醇高峰，性类固醇分泌降低可因给予激动剂而引起。在另一实施例中，使用了只产生很少或没有性类固醇分泌高峰的LHRH-R激动剂，此前可使用或不使用LHRH-R拮抗剂。
尽管对胸腺激活的刺激主要基于对性类固醇效应的抑制和/或LHRH类似物的直接效果，但包括其他可以协同增强胸腺效应的物质是有用的。这类化合物可以包括但不限于白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-15(IL-15)，上皮和成纤维细胞生长因子家族的成员、干细胞因子、粒细胞集落刺激因子(GCSF)和角质化细胞生长因子(KGF)。目前认为其他化合物只在最初使用LHRH类似物之前使用一次。但是，这些物质中的一种或其组合也可以在任何时候加用，以进一步刺激胸腺。此外，可能靶向于胸腺特异性的类固醇受体基调节剂也可被开发和使用。
药物组合物本发明所用的化合物可在任何药学上可接受的载体中或无需载体而使用。载体的例子包括生理上可接受的包衣、溶剂和稀释剂。对于经胃肠外、皮下、静脉、和肌肉给药来说，组合物可以用胶囊加以保护。可以替换地，组合物可以与保护活性成分的载体一起使用，同时这种载体可以使活性成分缓慢释放。本技术领域已知多种用于制备缓释制剂的聚合物和共聚物，例如各种乳酸/乙醇酸共聚物。实施例参见美国专利第5,410,016号，其中使用聚乙二醇(PEG)的改性聚合物作为生物可降解的包衣。
口服制剂可以制备成液体、胶囊、片剂及其类似物。这些组合物可以包括赋形剂、稀释剂、和/或防止活性成分降解的覆盖物。这些配方都是已知的。
在任何配方中，只要不对LHRH类似物的活性产生负面影响的化合物都可以使用。这里描述了各种生长因子和其他细胞因子的实施例。
剂量LHRH类似物可以以一次剂量使用，这一剂量将持续一段时间。优选地，该配方的效果将持续1-2个月。标准剂量随所用类似物的种类不同而不同。一般来说，剂量在大约0.01μg/kg至10mg/kg之间，优选在大约0.01mg/kg至5mg/kg之间。剂量随所用LHRH类似物或疫苗不同而不同。在优选实施例中，剂量的持续时间为流行病持续的时间。例如，“流感季节”一般出现在冬季的几个月。LHRH类似物的配方可以在流感季节开始时配制并按照本文所描述的方法施用，以提供患者2个或更多个月的保护，以后每两个或更多个月施用一次，直到感染的危险减退或消失。
该配方可以用来增强免疫系统。可替换地，该配方可以用来在增强免疫系统的同时特异性阻挡流感病毒的感染。后一配方可以包括GM细胞，该细胞已被加工，可产生对流感病毒的抵抗作用(见下文)。GM细胞可与LHRH类似物配方一起使用或分开使用，即在空间和/或时间上分开使用。正如非GM细胞来说，可以在一段时间内给病人多次使用，以在整个流感季节产生保护、防止流感病毒感染。
化学阉割试剂的使用本发明的化合物的施用可以用本领域熟知的多种方法来完成。使用化学抑制剂来抑制传向胸腺的性类固醇介导的信号的一个标准方法是使用单一剂量的LHRH激动剂，其疗效可维持三个月。对此，简单的一次静脉内或肌肉注射将是不够的，因为三个月时间还没有到，激动剂就将从患者体内清除出去。相反，应该使用贮存式注射或植入法，或其他任何可以使抑制剂缓慢释放的方法。同样也可以使用延长抑制剂在体内半衰期的方法，例如对化学药品进行改性同时保持此处所需功能。
更有用的给药机制包括但不限于，用激光照射皮肤、以及在皮肤上产生高压短暂短暂脉冲(也称应力波或短暂短暂脉冲)，每种方法实施的同时或之后，将有或无载体的化合物放置在同一部位。优选的方法是放置一块胶布，在治疗期间一直贴在皮肤上。
一种给药方法是使用激光束，尤其是聚焦激光束，以合适波长发射激光，在患者皮肤上产生小面积的穿孔或蚀变。参见美国专利第4,775,361号、第5,643,252号、第5,839,446号、和第6,056,738号，所有这些专利结合于此作为参考。在优选实施例中，激光束波长在0.2～10微米之间，更好为波长在1.5～3.0微米之间，最好为波长约2.94微米。在一个实施例中，激光束用透镜聚焦，穿透表皮在皮肤上产生一辐照斑。在另一实施例中，激光束聚焦后仅穿透角质层产生一辐照斑。
在此，“消融”和“穿孔”指在皮肤上形成孔。孔的深度可以各异；例如，可仅穿透角质层，也可穿入皮肤的毛细血管层，或在终止于两层之间任何位置。在此，所用“蚀变”指的是皮肤结构的变化，不产生孔，增加皮肤的通透性。与穿孔一样，皮肤可在任何深度上被蚀变。
可以用几个因素来定义激光束，包括波长、能注量、脉冲时间宽度和辐照斑大小。在优选实施例中，能注量在0.03～100,000J/cm2范围内。更优选地，能注量在0.03～9.6J/cm2范围内。光束波长部分依赖于激光材料，例如，铒(Er):钇铝石榴石(YAG)。例如，脉冲时间宽度是由一系列电容器、闪光灯、以及激光棒材料所产生的脉冲宽度决定的。脉冲宽度优选1fs(微毫秒)～1000μs。
根据该方法，激光所产生的孔或蚀变不一定由来自激光的单一脉冲所产生。在一个优选实施例中，透过角质层的穿孔或蚀变是由多个激光脉冲产生的，每一个仅穿孔或蚀变靶组织厚度的一部分。
最后，可以粗略估计多个脉冲穿孔或蚀变角质层所需要的能量，即取单一脉冲的能量，除以所需脉冲的数量。例如，如果一个特定大小的点需要1J的能量来穿孔或蚀变整个角质层，那么我们可以使用10次脉冲，每次用1/10的能量，产生从定性上来说基本相似的穿孔或蚀变效果。由于需要患者在辐射期间不移动靶组织(人体反应时间在100ms左右)，并且每次脉冲所产生的热不显著扩散，在一优选实施例中激光器的脉冲重复率应如此，以使得整个穿孔过程在少于100ms的时间段内完成。可替换地，靶组织和激光的定位可以机械固定，使得在较长的辐射时间内靶组织位置不发生移动。
为了在穿透皮肤时少流血或不流血，可以在皮肤的外表(例如角质层)完成穿孔或蚀变，但不深入毛细血管层。激光束精确地聚焦于皮肤，在皮肤上产生的光束直径大约为0.5μm～5.0cm。任选地，光斑可以是裂隙状的，宽约0.05～0.5mm，长为2.5mm。宽度可以任意大小，由辐照部位的解剖以及所要除去的液体或施用的药物的所需通透率决定。聚焦透镜的焦距可以任意长，但在一个实施例中为30mm。
通过调整波长、脉冲长度、能注量(是激光输出能量(J)和焦点光束大小(cm2)的函数)和辐照光斑大小，可以在消融(穿孔)和非消融性调整(蚀变)之间，改变对角质层的影响。角质层的消融和非消融蚀变都可导致随后使用的药物的通透性增高。
例如，通过降低脉冲能量而保持其他参量恒定，可以在消融和非消融的组织效应间进行转换。使用脉冲长度约300μs的铒(Er):钇铝石榴石(YAG)激光器，采用单一脉冲或辐射能，并在皮肤上辐照2mm大小的光斑，超过大约100mJ的脉冲能量产生部分或完全消融，而任何低于100mJ的脉冲能量则导致角质层的部分消融或非消融性改变。任选地，通过使用多个脉冲，体液或施用的药物的通透性所需的阈脉冲能量降低，其数值约等于脉冲的数量。
可替换地，通过将光斑缩小而保持其他参量恒定，也可以在消融和非消融性组织效应之间进行转换。例如，将光斑面积减半，导致相同效应所需的能量也会减半。可以得到低至0.5微米的辐照，例如，可以通过将激光器的辐射输出耦合于显微镜的多个物镜(如购自Nikon公司，Melville，纽约)。这种情况下，可以将光束聚焦到显微镜分辨率的极限等级的光斑，其也许在0.5微米的等级上。事实上，如果光束特性是高斯分布的，受影响的辐照面积的大小可以小于所测量的光束大小，而超过显微镜的成像分辨率。在这种情况下为了无消融地蚀变组织，使用3.2J/cm2的能注量可能是合适的，其对0.5微米的光斑大小来说，需要脉冲能量约5nJ。这么低的脉冲能量容易从二极管激光获得，也可以获得，例如，通过吸收滤片(如玻璃)衰减的铒(Er):钇铝石榴石(YAG)。
任选地，通过改变辐射能量的波长而保持其他参数恒定，可以在消融和非消融性组织效应间进行转换。例如，使用Ho:YAG(钬:钇铝石榴石；2.127μm)而不是Er:YAG(铒:钇铝石榴石；2.94μm)激光器，可以使组织对能量的吸收更少，使穿孔或蚀变更少。
激光器所产生的微微秒和毫微微秒脉冲也可用于产生皮肤蚀变或消融。这可以通过调制的二极管或相关微芯片激光器完成，其可以在1fs-1ms的时间宽度发射单一脉冲。(参见D.Stern等，“用在532nm和625nm处的毫微秒、微微秒、毫微微秒激光进行角膜消融”(“Corneal Ablation by Nanosecond，Picosecond，andFemtosecond Lasers at 532 and 625nm”)《角膜激光消融》(CornealLaser Ablation)，第107卷，587-592页(1989)，其结合于此作为参考，其披露了低至1毫微微秒脉冲长度的使用)。
另一种给药方法使用高压短暂脉冲，以在皮肤上产生通透性。参见美国专利第5,614,502号、和第5,658,892号，两者结合于此作为参考。高压短暂脉冲，例如，应力波(如激光产生时的激光应力波(LSW))具有特定的上升时间和峰值应力，可以安全和有效地影响化合物的传递，如本发明的化合物，使其通过上皮组织层，例如角质层和粘膜。这些方法可以用来传递各种大小的化合物而无需考虑其净电荷。此外，本发明方法的短暂脉冲可以避免组织损伤。
在暴露于短暂脉冲之前，上皮组织层，例如角质层很可能对外来化合物不通透；这可以防止化合物向上皮层下面的细胞扩散。将上皮层暴露于短暂脉冲下，可使化合物扩散入上皮层。一般而言，扩散过程取决于短暂脉冲的性质和运输的化合物的大小。
通过特定上皮组织层的穿透率，例如皮肤角质层的穿透率也取决于其他几个因素，包括pH值、皮肤基质组织的代谢、角质层内外区域的压力差、以及解剖部位和皮肤的理条件。此外，皮肤的生理条件取决于健康状况、年龄、性别、种族、皮肤护理和病史。例如，先前接触有机溶剂或表面活性剂可以影响皮肤的生理状况。
经上皮组织层传递的化合物的量也取决于上皮层保持通透的时间长短，以及变得通透的上皮层表面积的大小。
短暂脉冲的特性是由产生它们的能量源所控制的。参见WO98/23325，起结合于此作为参考。然而，它们的特性是由它们在其中扩散的偶联介质的线性和非线性特性所调节。偶联介质所引起的线性衰减主要使短暂脉冲中的高频成分得以衰减。这使得带宽随着短暂脉冲相应的上升时间的增加而减少。另一方面，偶联介质的非线性特性使得上升时间减少。上升时间的减少是声音和粒子速度对应力依赖的结果。应力增加，声音和粒子速度也增加。这导致短暂脉冲的前沿变得更陡。线性衰减、非线性系数和峰值应力的相对强度决定了波需传播多远，才能使上升时间的陡度增加变得显著。
选择上升时间、强度和短暂脉冲的持续时间，以产生的非毁灭性的(即非休克波)短暂脉冲，这可以暂时提高上皮组织层的通透性。一般而言上升时间至少1ns，更优选约10ns。
短暂脉冲的峰值应力或压力随不同的上皮组织或细胞层而有所不同。例如，对于传送化合物通过角质层来说，短暂脉冲的峰值应力或压力应设至至少400巴；更优选至少1,000巴，但不高于约2,000巴。
对上皮粘膜层来说，峰值压力应设至300～800巴，优选300～600巴。
短暂脉冲优选的持续时间为几十个毫微秒(ns)，因此仅在短时间内与上皮组织相互作用。
与短暂脉冲接触之后，上皮组织并不受到永久损伤，但在约三分钟内保持通透。
此外，本发明的新方法涉及仅给患者施用数个彼此孤立的高强度脉冲。给予患者的短暂脉冲的数量一般少于100，更优选少于50，最优选少于10。当使用多个适当脉冲以产生短暂脉冲时，相邻脉冲之间的时间间隔应为10～120秒，其足够长以防止对上皮组织的永久损害。
使用本技术领域的标准方法对短暂脉冲的特性进行测量。例如，峰值应力或压力、和上升时间可以用聚偏氟乙烯(PVDF)转换器方法(描述于Doukas等，Ultrasound Med.Biol.，21961(1995))进行测定。
短暂脉冲可用各种能量源产生。能够产生短暂脉冲的物理现象一般来自三种不同的机制(1)热弹性生成；(2)光学击穿；或(3)消融。
例如，该短暂脉冲可以通过使用高能激光源使一靶材料产生消融而发生，然后通过一偶联介质将短暂脉冲与上皮组织或细胞层耦合。该偶联介质可以为，例如，液体或胶质，只要其是非线性的。
因此，水、油(例如蓖麻油)等、渗介质如磷酸缓冲盐水(PBS)、或胶质(如胶原蛋白胶)都可以用作偶联介质。
此外，该偶联介质也可以包括增强传导的表面活性剂，例如，在短暂脉冲产生之后，延长角质层对化合物的通透时间。表面活性剂可以是，例如，离子洗涤剂或非离子洗涤剂，因此可以包括例如十二烷基硫酸钠、十六烷基三甲基溴化铵，和月桂基二甲基氨基氧化物。
吸收性靶材料起到光学触发的转换器的作用。光被吸收以后，靶材料进行快速传热膨胀或被消融，以产生短暂脉冲。一般来说，金属和聚合物膜在可见和紫外光谱区具有高吸收系数。
许多类型的材料可以与激光束一起作为靶材料，只要它们在所用激光波长内可完全吸收光。靶材料可由金属组成，例如铝或铜；塑料，例如聚苯乙烯，如黑色聚苯乙烯；陶瓷；或高度浓缩的燃料溶液。靶材料的大小必须大于所施用的激光能的截面积。此外，靶材料必须厚于光学穿透深度，这样激光就不会打到皮肤表面。靶材料还必须足够厚，以提供机械支撑。当靶材料为金属时，标准厚度为1/32～1/16英寸(0.79375～1.5875mm)。塑料靶材料的厚度为1/16～1/8英寸(1.5875～3.175mm)。
还可以使用限制性消融来加强短暂脉冲。在限制性消融中，激光束透明材料，例如石英光学窗，被放置在靶材料旁边。通过使用透明材料使靶材料消融，而使血浆限制，以使耦合系数在数量级上增长(Fabro等，J.Appl.Phys，68775，1990)。该透明材料可以是石英、玻璃或透明塑料。
由于靶材料与限制性透明材料之间的空隙使血浆膨胀，因此降低了到达靶上的动量，透明材料最好用液体粘附剂(例如含碳的环氧物质)固定在靶材料上，以避免上述空隙。
激光束可由本技术领域熟知的标准光学调制技术加以产生，例如使用Q-开关的或模式锁定激光器，如电或声-光设备。可在红外光、可见光、和/或红外光谱区以脉冲模式操作的标准商售激光器包括Nd:YAG激光器、Nd:YLF激光器、CO2激光器、激态原子激光器、染料激光器、Ti:蓝宝石激光器，二极管激光器，钬(和其他稀土元素)激光器、以及金属蒸气激光器。这些光源的脉冲宽度可调，并且可在几十微微秒(PS)至几百微秒之间变化。在本发明的应用中，光脉冲宽度可在100ps～约200ns之间，优选大约在500ps～40ns之间。
短暂脉冲也可用体外碎石机(一个实例参见Coleman等，Ultrasound Med.Biol.，15213-227，1989)产生。这些短暂脉冲的上升时间为30～450ns，长于激光产生的短暂脉冲。为了使用体外碎石机用新方法形成具有合适上升时间的短暂脉冲，短暂脉冲在非线性偶联介质(如水)中扩散，扩散距离有上述公式(1)决定。例如，当使用碎石机产生上升时间为100ns和峰值压力为500巴的短暂脉冲时，短暂脉冲在接触上皮细胞层前应在偶联介质中通过的距离约为5mm。
用碎石机产生短暂脉冲的另一个好处在于波的拉伸成分被扩展并衰减，这是其在非线性偶联介质扩散的结果。这一扩散距离可以加以调整，使得短暂脉冲的拉伸成分的压力仅占波的压缩成分的峰值压力的约5～10％。因此，形成的短暂脉冲将不会损伤组织。
碎石机的类型并不是关键。无论电液、电磁还是压电碎石机都可以使用。
短暂脉冲也可以用换能器产生，例如压电换能器。优选地，换能器与偶联介质直接接触，在施加光场、热场、或电场后快速位移，以产生短暂脉冲。例如，可使用电解质击穿，并且一般由高压火花或压电换能器诱导(在某些体外碎石机中所使用的类似，Coleman等，Ultrasound Med.Biol.，15213-227，1989)。在使用压电换能器时，换能器在施加电场后迅速膨胀，导致偶联介质发生快速位移。
此外，可以使用纤维光学帮助短暂脉冲的产生。纤维光学传导系统很容易操作，并且可以用来辐照位于上皮组织层附近的靶材料，以在难以到达的区域产生短暂脉冲。当与激光器发生光耦合时，这类传导系统是优选的，因为它们可被整合入导管和相关的柔软器械内，并用于辐照人体内的大部分器官。此外，为了产生具有所需上升时间和峰值压力的短暂脉冲，光源的波长很容易整形，以在特殊的靶材料中产生合适的吸收。
可以替换地，一种高能材料可以通过对爆炸脉冲的反应而产生短暂脉冲。爆炸物可以通过产生放电或电火花而使高能材料爆炸。
流体静压可以与短暂脉冲一起使用可用来增强化合物经上皮组织层的运输。由于短暂脉冲所诱发的效应持续几分钟，药物沿浓度梯度经上皮细胞层被动扩散的运输速度可以通过在施加短暂脉冲后，在上皮组织层(例如皮肤角质层)表面施加流体静压而得到提高。
疫苗应答的改善通过在此描述的方法，在所有目前可确定的术语中，性类固醇诱导的萎缩胸腺可以在结构上和功能上显著地恢复到其最优的青春期前水平。这包括所有T细胞亚群的数量、种类和比例。也包括复杂的基质细胞和它们的三维结构，它们构成了产生T细胞所需要的胸腺微环境。新生成的T细胞从胸腺移出，恢复外周T细胞水平和功能。
通过在胸腺开始再生前或再生时加入CD34+造血干细胞(HSC)和/或上皮干细胞，可以对胸腺的重新激活稍微进行补充。这些细胞最好是自体或同源的，在胸腺重新激活前取自患者或双胞胎。HSC可以通过从患者血和/或骨髓分拣CD34+细胞而得到。可以用几种方法提高HSC数量，包括(但不限于)在收集细胞前给病人施用G-CSF(Neupogen，Amgen)，在干细胞生长因子中培养收集到的细胞，和/或在补充CD34+细胞后给患者施用G-CSF。可以选择地，如果通过事先给患者注射G-CSF以使CD34+细胞数量增多，就不需要再从血或骨髓中分拣CD34+细胞。
开始阻断传向胸腺的性类固醇介导的信号3-4周时(约在LHRH治疗开始后2-3周)，血流中出现最初的新生T细胞。T细胞库的完全发育却要3-4个月的时间。原则上新生成的幼稚细胞一出现便可以开始免疫，然而，最好等到LHRH治疗开始4-6周后再开始免疫，此时才会有足够的新T细胞产生以产生足够强的应答，并会经历任何必要的胸腺后成熟过程。
这一过程可与其他任何形式的免疫系统刺激结合，包括佐剂、辅助分子和细胞因子疗法。例如，有用的细胞因子包括但不限于作为一般性免疫生长因子的白细胞介素-2(IL2)、用于影响对Th2应答(体液免疫)的IL4、和用于影响对Th1应答的扰素(细胞介导的炎症应答)。辅助因子包括但不限于CTLA4的抑制剂，它们可以通过促进CD28/B7.1、B7.2刺激通路来增强一般性免疫应答，该通路通常被CTLA4所抑制。
小动物研究材料和方法动物
CBA/CAH和C57B16/J雄性小鼠获自Monash大学的动物服务中心(Central Animal Services)，并在传统条件下饲养。年龄在4-6周至26个月，并将在相关处示明。
阉割向动物腹腔内注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(Rompun；BayerAustralia Ltd.，Botany NSW，澳大利亚)和1.5mg盐酸酮胺(氯胺酮针剂；Parke-Davis，Caringbah，NSW，澳大利亚)的生理盐水进行麻醉。外科阉割是将阴囊切开、暴露睾丸、用缝线系紧、并与周围脂肪组织一起除去。
5-溴脱氧尿苷(BrdU)掺入小鼠以4小时的间隔接受两次腹腔内BrdU注射(Sigma化学公司，圣路易斯，密苏里州)(100mg/kg体重，在100μl PBS中)。对照小鼠仅接受赋形剂注射。第二次注射后一小时，切下胸腺，或者制备细胞悬液用于FACS分析，或者立刻包埋于Tissue Tek(O.C.T.化合物，迈尔斯公司，印第安纳州)，在液氮中快速冷冻并储存于-70℃待用。
流式细胞计分析用CO2窒息杀死小鼠，取下胸腺、脾和肠系膜淋巴结。器官在冷PBS/1％FCS/0.02％叠氮化物的溶液中，轻柔地通过200μm的滤网、离心(650g，5分钟，4℃)、并重新悬浮于任何一种PBS/FCS/叠氮化物中。脾细胞在红细胞裂解缓冲液(8.9g/l氯化铵)中4℃孵育10分钟，冲洗，并重新悬浮于PBS/FCS/叠氮化物。细胞浓度和存活度采用血球计数仪和溴乙锭/吖啶橙测定两次，在荧光显微镜下观察(Axioskop；Carl Zeiss，Oberkochen，德国)。
为进行三色免疫荧光检测，胸腺细胞例行用抗αβTCR-FITC或抗γδTCR-FITC、抗CD4-PE、和抗CD8-APC(全部获自Pharmingen，圣地亚哥，加利福尼亚)进行常规标记，然后进行流式细胞计分析。脾和淋巴结悬液用αβTCR-FITC/CD4-PE/CD8-APC或B220-B(Sigma)与CD4-PE和CD8-APC进行标记。B220-B用抗生蛋白链菌素三色共轭物(购自Caltag实验室公司，伯林盖姆，加利福尼亚)显色。
为进行BrdU检测，细胞用CD4-PE和CD8-APC进行表面标记，接着进行如前述的固定和通透(Carayon and Bord，1989)。简而言之，染色的细胞用1％PFA/0.01％吐温-20在4℃固定O/N。冲洗过的细胞在37℃下，置于500μl DNase中孵育(100孔尼兹单位，Boehringer Mannheim，西德)30分钟，以使DNA变性。最后，细胞用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson)进行孵育。
为进行四色免疫荧光检测，胸腺细胞用CD3、CD4、CD8、B220、Mac-1标记，用抗大鼠Ig-Cy5(Amersham，英国)总体检测，门化的阴性细胞(TN)用于分析。它们继而用CD25-PE(Pharmingen)和CD44-B(Pharmingen)进行染色、并接着用抗生蛋白链菌素-三-色(Caltag，加利福尼亚)显色，如前所述的检测(Godfrey and Zlotnik，1993)。然后按如前所述的方法进行BrdU检测。
样品用FacsCalibur(Becton-Dickinson)进行分析。存活的淋巴细胞根据0°和90°光散射图进行门化，并且数据用细胞寻找软件(Cell quest software)进行分析(Becton-Dickinson)。
免疫组化冰冻胸腺切片(4μm)用冷冻箱(Leica)切片，并迅速用100％的丙酮固定。
为进行双色免疫荧光检测，切片用本实验室生产的一组单克隆抗体进行双标记MTS6、10、12、15、16、20、24、32、33、35和44(Godfrey等，1990；表1)，并用多价兔抗细胞角蛋白抗体(Dako，Carpinteria，加利福尼亚)对上皮细胞决定簇的共同表达进行检测。结合的单克隆抗体(mAb)用FITC共轭的绵羊抗大鼠Ig(Silenus实验室)进行显色，并且抗细胞角蛋白用异硫氰酸四甲基若丹明(TRITC)共轭的山羊抗兔免疫球蛋白(Silenus实验室)显色。
为进行BrdU检测，切片用抗细胞角蛋白，再用抗兔TRITC染色，或用特异的mAb染色，然后用抗大鼠免疫球蛋白(Ig)-Cγ3(Amersham)显色。然后按上述方法进行BrdU检测(Penit等，1996)。简而言之，切片用70％乙醇固定30分钟。半干的切片在4MHCl中孵育，在硼酸缓冲液(Sigma)中冲洗以中和，然后用PBS冲洗两次。BrdU用抗BrdU-FITC(Becton-Dickinson)进行检测。
为进行三色免疫荧光检测，切片用特异性MTS单克隆抗体(mAb)与抗细胞角蛋白一起进行标记。然后如上所述方法进行BrdU检测。
切片用Leica荧光显微镜和Nikon共焦显微镜进行分析。
迁移研究动物用腹腔注射0.3ml含0.3mg甲苯噻嗪(盐酸赛拉嗪；BayerAustralia公司，Botany NSW，澳大利亚)和1.5mg盐酸氯酮胺(氯胺酮针剂；Parke-Davis，Caringbah，NSW，澳大利亚)的生理盐水进行麻醉。
胸腺细胞的FITC标记技术与其他文献的描述类似(Scollay，等，1980；Berzins等，1998)。简而言之，暴露胸腺叶，每叶用大约10μm(μl)的350μg/ml FITC(在PBS中)进行注射。伤口用外科手术针缝合，保温小鼠，直至其完全从麻醉中苏醒。注射后约24小时，用CO2窒息法杀死小鼠，并切下淋巴器官用于分析。
细胞计数以后，样品用抗CD4-PE和抗CD8-APC进行染色，然后用流式细胞计进行分析。迁移的细胞被认为是表达CD4或CD8的活的门化的(live-gated)FITC+细胞(以排除自身荧光细胞和双联体)。加入FITC+CD4和CD8细胞的百分率，各自得到淋巴结和脾的总迁移率。每日输出率用Berzins等(1998)描述的方法计算。
使用非配对的“t”检验或非参量曼-惠特尼(Mann-Whitney)检验以进行数据分析，以确定对照组和测试组检验结果之间的统计显著性，实验至少进行三次。实验值与对照值相比有显著差别，用下列方式表示*P≤0.05、**P≤0.01、和***P≤0.001。
结果年龄对胸腺细胞群体的影响(i)胸腺重量和胸腺细胞数量随着年龄的增长，胸腺重量(图1A)和总胸腺细胞数(图1B)都有显著降低(P≤0.0001)。年轻成年鼠的相对胸腺重量(mg胸腺/g体重)平均值为3.34，18-24个月时则降低至0.66(由于脂肪沉积无法精确计算)。胸腺重量的降低可以归因于总胸腺细胞数量的减少1-2个月的胸腺含有约6.7×107个胸腺细胞，24个月后则降低至约4.5×106个胸腺细胞。阉割使得性类固醇对胸腺的作用消除，于是胸腺再生，阉割4周后，胸腺在重量和细胞构成上都与年轻成年鼠的胸腺相当(图1A、1B)。有趣的是，阉割2周后，胸腺细胞的数量有明显增加(P≤0.001)，约为1.2×108个，而在阉割4周后则恢复到正常年轻鼠的水平(图1B)。
胸腺产生的T细胞的减少并没有反映在外周中，脾细胞的数量随年龄增长仍保持恒定(图2A)。外周的内环境稳定机制是很明显的，因为脾和淋巴结中B细胞对T细胞的比率并不受年龄以及随之而来的到达外周的T细胞数量减少的影响(图2B)。但是，CD4+对CD8+T细胞的比值却随年龄显著降低(P≤0.001)，从2个月时的的2∶1降至2岁时的1∶1(图2C)。阉割后和随后到达外周的T细胞数量随之上升，但外周的T细胞数量未见变化脾T细胞数目和脾、淋巴结中B/T细胞比值在阉割后均无改变(图2A和B)。外周血CD4∶CD8比值的降低在阉割2周时仍然明显，但在阉割4周后则完全逆转(图2C)。
(ii)αβTCR，、γδTCR、CD4和CD8的表达为了测定胸腺细胞数量随年龄的减少是否是某种特异性细胞损耗所产生的结果，将胸腺细胞用特定标记物进行标记，以对不同的亚群进行分析。此外，还允许分析阉割后胸腺再生的动力学。将主要胸腺细胞亚群的比例与正常年轻胸腺进行比较(图3)，发现其虽年龄增长保持恒定。此外，将胸腺细胞按表达αβTCR和γδTCR进行细分，这些群体的比率随年龄并无变化(数据未显示)。阉割后2和4周，胸腺细胞亚群维持同一比率，并且由于胸腺细胞数量在阉割后上升了高达100倍，这显示所有胸腺细胞亚群的同步扩增，而并非进化式的逐步扩增。
老年动物胸腺中细胞数量的减少可能是所有细胞表型均衡降低的结果，未见T细胞群体的显著变化。胸腺再生以同步方式进行，所有T细胞亚群均同时得到补充，而不是按次序补充。
胸腺细胞的增殖如图4所示，15-20％的胸腺细胞在年龄为4-6周时开始增殖。其中大部分(约80％)是DP，其次是TN亚群(约6％)(图5A)。因此，免疫组化所见的细胞分裂大部分发生在被膜下和皮质(数据未显示)。用FACS分析可在髓质区见到一些细胞分裂，显示部分SP细胞(9％的CD4T细胞和25％的CD8T细胞)分裂(图5B)。
虽然老年胸腺中的细胞数量显著减少，胸腺细胞的增殖仍保持恒定，2岁时降至12-15％(图4)，其增殖亚群的表型与2个月胸腺类似(图5A)。免疫组化显示了1岁时的细胞分裂，反映了年轻成年鼠的状况；但在2岁时，增殖主要见于外层皮质和维管结构周围(数据未显示)。阉割后2周，虽然胸腺细胞数量显著增加，增殖的胸腺细胞的比率没有变化，再次显示细胞的同步扩增(图4)。免疫组化显示了胸腺细胞增殖的定位和分裂细胞的范围类似于2个月胸腺在阉割2周后的状况(数据未显示)。分析代表增殖亚群的每一亚群的比率时，CD8T细胞在增殖细胞中的比率有显著上升(P＜0.001)，(2个月和2岁时为1％，阉割2周后增至约6％)(图5A)。
图5B显示年轻、老年和阉割鼠中每一亚群的增殖情况。DN亚群中增殖呈显著衰减(P≤0.001)(2个月时的35％到2岁时的4％)。CD8+T细胞的增殖也显著减少(P≤0.001)，反映了免疫组织学的结果(数据未显示)，即在老年胸腺的髓质中未见明显细胞分裂。阉割4周后DN增殖的减少也未恢复到正常年轻水平。但是，阉割2周后CD8+T细胞亚群的增殖显著增加(P≤0.001)，阉割4周后恢复到正常年轻水平。
使用CD44和CD25标记物进一步对DN亚群中的增殖减少进行分析。DN亚群中除已含胸腺细胞前体外还包含αβTCR+CD4-CD8-胸腺细胞，后者被认为下调向SP细胞转换的两种受体(Godfrey & Zlotnik，1993)。通过对这些成熟细胞进行门化(gating)，便可以分析真正的TN区域(CD3-CD4-CD8-)，并且这些随年龄或阉割在增殖上没有表现出差别(图5C)。但是，对表达CD44和CD25的亚群进行分析，显示在TN1亚群(CD44+CD25-)的增殖上呈明显降低(P＜0.001)，从正常年轻鼠的20％降至18个月时的约6％(图5D)，阉割4周后得到恢复。TN1亚群增殖的减少被TN2亚群(CD44+CD25+)增殖的显著增加(P≤0.001)所弥补，后者在阉割2周之后恢复到正常年轻水平(图5D)。
年龄对胸腺微环境的影响使用来自MTS系列的单克隆抗体(Mabs)的延伸板，用多克隆抗细胞角蛋白抗体进行双标记，用免疫荧光法，来检测胸腺微环境随年龄的变化。
被这些单克隆抗体所识别的抗原可以分为三组胸腺上皮、血管相关性抗原、和那些存在于基质细胞及胸腺细胞上的抗原。
(i)上皮细胞抗原2岁小鼠胸腺的抗角蛋白染色(泛上皮)，显示了一般胸腺结构的丧失，伴随严重的上皮细胞无序化，和明显的皮-髓质连接的丧失。使用单克隆抗体、MTSIO(髓质)、和MTS44(皮质)进行进一步分析发现，皮质大小随年龄呈明显的减少现象，而髓质上皮则不呈此显著减少(数据未显示)。无上皮细胞区域，或角蛋白阴性区域(KNA’s，van Ewijk等，1980；Godfrey等，1990；Bruijntjes等，1993)在老年胸腺中更为明显，并范围增大，如抗角蛋白标记所见。老年胸腺中也出现胸腺上皮“囊样”结构，尤其在髓质区(数据未显示)。脂肪沉积、胸腺尺寸的严重缩小以及皮-髓质连接区无序化均只能用抗细胞角蛋白染色才可见(数据未显示)。胸腺在阉割2周后开始再生。这表现在胸腺叶的大小、皮质上皮用MTS44显示的增多以及髓质上皮的定位化。髓质上皮用MTS10检测，在2周时，仍有用MTS10染色的上皮副囊(subpockets)，分散于皮质中。阉割4周后，便有清楚的髓质、皮质和可分辨的皮质-髓质连接(数据未显示)。
标记物MTS20和24被认为可用来检测原生上皮细胞(Godfrey，等，1990)，进一步显示了老年胸腺的退化。它们在E14时数量很多，可4-6周时检测到孤立的髓质上皮细胞簇，在老年胸腺中的强度再次增加(数据未显示)。阉割后，所有这些抗原均以与年轻成年鼠胸腺相当的水平表达(数据未显示)，MTS20和MTS24恢复到位于皮质-髓质连接区的清晰可见的上皮副囊(subpocket)中。
(ii)血管相关抗原血-胸腺屏障被认为负责T细胞前体向胸腺的迁移，以及成熟T细胞从胸腺向外周的转移。
单克隆抗体(Mab)MTS15是胸腺血管的内皮特异性的，呈现出颗粒状、弥散的染色图像(Godfrey等，1990)。在老年胸腺中，MTS15的表达显著增加，并反映出血管和血管周围间隙的增多和尺寸的增大。(数据未显示)。
胸腺细胞外基质含有重要的结构和细胞粘附分子，例如胶原蛋白、层粘连蛋白、纤维蛋白原，可用单克隆抗体(MAb)MTS16进行检测。MTS表达在正常年轻胸腺中较分散，而在老年胸腺中变得更为扩散并彼此相连。MTS16的表达在阉割2周后进一步增加，而在阉割4周后时，这一表达反映的状况与2月龄胸腺类似(数据未显示)。
(iii)共有抗原用单克隆抗体(MAb)MTS6检测的正常年轻胸腺中的MHCII表达在皮质上皮中呈强阳性(颗粒)(Godfrey等，1990)，髓质上皮则染色较弱。老年胸腺表现出MHCII表达的降低，阉割2周后表达显著上升。阉割4周后，表达再次降低，并与2个月时的胸腺类似(数据未显示)。
胸腺细胞迁移在年轻小鼠每天有大约1％的T细胞从胸腺移出(Scollay等，1980)。14个月的正常年轻小鼠和甚至2岁的小鼠，其迁移细胞的比例几乎相等(图5)，虽然其数量显著减少(P≤0.0001)。最新的从胸腺迁移出的细胞中CD4∶CD8比率有所升高，从2个月时的约3∶1升到26个月时的约7∶1。阉割1周后，迁移到外周的细胞数量显著上升，而总迁移率仍保持1-1.5％。
实施例下面的实施例提供了本发明方法的特定实施例，但并不构成对本发明的内容限制。为方便起见，这些实施例描述了提供LHRH激动剂，以阻断传向胸腺的性类固醇介导的信号。但是，并不因此限制发明的范围。
实施例1性类固醇消融治疗通过使用LHRH激动剂来给予患者性类固醇治疗。使用Leucrin(贮存式注射，22.5mg)或醋酸性瑞林(植入，10.8mg)，任何一种单次剂量可维持疗效3个月。其效果为使性类固醇的水平低至足以重新激活胸腺。有些情况下也需要给予肾上腺产生的性类固醇的抑制剂，例如每天服用一片Cosudex(5mg/天)，在性类固醇消融治疗期间使用。肾上腺产生的性类固醇占人体类固醇的约10-15％。
血液中性类固醇降低到最低水平约需1-3周，与此一致的是胸腺的重新激活。有些情况下需要将治疗时间延长，进行第二个3个月的注射/植入疗程。
实施例2其他给药方法除了贮存式或植入式使用LHRH激动剂3个月外，也可以使用其他方法。在一个实施例中，患者的皮肤用激光器进行辐照(如铒:钇铝石榴石激光器)，使皮肤消融或蚀变，以降低角质层的阻碍效应(impeding effect)。
A.激光消融或蚀变使用固相的、脉冲铒:钇铝石榴石激光器形成红外激光辐射脉冲，该激光器由两个平面共振腔反射镜、作为激活介质的铒:钇铝石榴石晶体、电源、和一聚焦激光束的装置构成。激光束的波长为2.94μm。使用单脉冲。
操作参数如下每次脉冲的能量为40、80、或120mJ，焦点位置的光束大小为2mm，产生1.27、2.25、或3.82J/cm2的能注量。脉冲时间宽度为300μs，产生能注量率为0.42、0.85、或1.27×104W/cm2。
继而，将LHRH激动剂用于皮肤，涂布于辐照部位。LHRH激动剂可为膏剂形式，这样可以存留于辐照部位。可选地，在激动剂上盖上密封贴片，使得其存留于辐照部位。
可选择地，使用光束分裂器，将激光束分裂，产生多个消融或蚀变位点。这使得LHRH激动剂更快地经皮肤进入血液。位点的数目可以事先确定，使得激动剂在患者系统内保持所需要的大约30天时间。
B.压力波将一定剂量的LHRH激动剂放在适当容器中，例如一塑料的、柔软的垫圈(约直径1英寸(25.4mm)和1/16英寸(1.5875mm)厚)，放在皮肤上将要产生压力波的位置。该位点随后用靶材料覆盖，例如约1mm厚的黑色聚苯乙烯片。使用Q-开关的固态红宝石激光器(20ns脉冲持续时间，每次脉冲能产生2焦耳)，以产生激光束，光束击中靶材料，并产生单一短暂脉冲。黑色聚苯乙烯靶材料完全吸收激光辐射，使得皮肤只暴露于短暂脉冲，而不暴露于激光辐射。这一过程无痛。这一过程可以每日重复，也可按需要多次进行，以维持激动剂的血循环水平。
实施例3选择性给予HSC在一个实施例中，给予患者造血干细胞(HSC)以加速胸腺的激活。这些HSC优选是自体或同基因的，但来自错配供体(异体或异基因)的HSC也可以使用。在实际应用中，患者或供体血中HSC水平可用于给患者或供体注射粒细胞集落刺激因子(G-CSF，10μg/kg，采集细胞前2-5天注射)的方法得以升高。从患者或供体血或骨髓中纯化CD34+细胞，优选使用流式细胞仪或免疫磁珠。HSC用流式细胞仪确认为CD34+。可选地，这些HSC用干细胞因子在体外进行扩增。给予LHRH激动剂后大约1-3周，此时胸腺恰巧开始再生，给患者注射HSC，最佳剂量为约2-4×106细胞/kg。可选地，可以给受体注射G-CSF，以协助HSC的扩增。
当HSC来自错配供体时，可以给受体施用T细胞消融和免疫抑制疗法，以防止对外来HSC的排斥。在这种治疗的一个例子中，抗T细胞抗体以每日注射15mg/kgAtgam(异抗T细胞球蛋白，Pharmacia Upjohn)的形式施用10天，与T细胞激活的抑制剂环孢菌素A(3mg/kg)共同使用，连续灌注3-4周，随后视需要每日服片剂9mg/kg。防止T细胞反应性也可以与第二水平信号例如白胞介素或细胞粘附因子的抑制剂共同使用，以增强T细胞消融。这一治疗在性类固醇消融治疗开始之前或同时使用。
重新激活的胸腺摄取纯化的HSC，并将其转化为新T细胞。在使用非配对供体HSC时，供体的树突状细胞将通过细胞死亡诱导缺失，或通过免疫调节细胞诱导耐受性，将对与患者有潜在反应性的任何T细胞产生耐受性。
由于新T细胞中已除去了可能自身反应和宿主反应性的细胞，其已被宿主胸腺上皮正面选择过，它们能够通过识别外周的宿主APC所呈递的可识别肽来对正常感染作出应答。患者和供体的CD34+HSC都发育成树突状细胞，并进而进入患者的淋巴系统器官，建立与患者的免疫系统实质上相同的免疫系统，虽然其幼稚T细胞的量增加了。正常的免疫调节机制便会出现。
实施例4胸腺的再生重新激活的胸腺摄取HSC，将其转化成新T细胞，后者迁移入血流，重建病人的最优外周T细胞库。新生T细胞的水平和比例尤见显著上升，大大提高了免疫计划中应答细胞的数量。Th∶Tc和Th1∶Th2细胞的正确比值保证了应答的最优类型。
当新的一群成熟T细胞开始离开胸腺时，从患者取血，并且检查T细胞(以及所有血细胞)的情况。尤其要检查T细胞是Th1或Th2细胞，以及是幼稚细胞或记忆细胞。此外，它们所产生了细胞因子的类型(Th1或Th2)也要进行检测。
如果由于施用错配HSC以使免疫抑制治疗逐渐减量，以对抗感染，并在没有排斥反应迹象时完全停用，排斥反应的迹象部分在于在血中有激活的T细胞存在。由于HSC有强的自我更新能力，所形成的造血嵌合体将会很稳定，理论上可以维持患者的一生，就如同未使用错配HSC时的情形一样。
实施例5使用LHRH激活剂来重激活人类胸腺为了证明人类胸腺可以用本发明的方法加以重新激活，将这些方法用于因患前列腺癌而曾接受化疗的患者。性类固醇消融治疗开始前和4个月后对前列腺癌患者进行评估。结果见图23-27。总的来说，这些数据显示了T细胞在许多患者身上从定性上和定量上的改善，以及LHRH治疗对总淋巴细胞数和T细胞亚群总数的影响。
对患者(全部超过60岁)的外周血淋巴细胞表型组成进行了分析，这些患者接受了前列腺癌的LHRH激动剂治疗(图23)。在LHRH激动剂治疗前和开始后4个月对患者样品进行分析。治疗前，在所有患者中，每毫升血中总淋巴细胞数在对照值的低水平。治疗后，6/9的患者总淋巴细胞计数显著上升(有些病例的总淋巴细胞数翻番)。与此对应的是6/9的患者的总T细胞数量的上升。在CD4+亚群中，这一升高甚至更为显著，8/9的患者表现出CD4+T细胞水平升高。另一不太明显的趋势是4/9患者的CD8+亚群水平有所升高，其程度一般小于CD4+T细胞。
LHRH治疗对T细胞亚群比例的影响对患者血液在LHRH激动剂治疗前和治疗后进行分析显示，在T细胞CD4+或CD8+细胞总体比例上并无显著改变，在CD4+∶CD8+比例上也无明显改变(图24)。这显示治疗对T细胞亚群的内环境稳定的维持上并无影响，虽然治疗使得总T细胞数目显著上升。所有值均与对照值进行比较。
LHRH治疗对B细胞和骨髓性细胞比例的影响对进行LHRH激动剂治疗的患者外周血中B细胞和骨髓性细胞(NK、NKT、和巨噬细胞)的比例进行分析，显示不同亚群内的变化程度有所差别(图25)。虽然在治疗后NK、NKT、和巨噬细胞的比例相对恒定，但B细胞的比例在4/9的患者中有所降低。
LHRH激动剂治疗对B细胞和骨髓性细胞总数的影响对治疗后外周血中B细胞和骨髓性细胞总数进行分析显示，NK(5/9患者)、NKT(4/9患者)、和巨噬细胞(3/9患者)的细胞数量在治疗后明显上升(图26)。B细胞数目未见明显变化趋势2/9患者水平上升，4/9患者不变，3/9患者降低。
LHRH治疗对相对于记忆细胞的幼稚细胞水平的影响LHRH激动剂治疗后所见到的主要变化在于外周血的T细胞群体。幼稚(CD45RA+)CD4+细胞的比例尤见选择性增高，同时CD4+T细胞亚群中幼稚细胞(CD45RA+)对记忆细胞(CD45RO+)的比例在6/9患者中有所上升(图27)。
结论因此可以得出这样的结论，用LHRH激动剂治疗动物(如具有萎缩胸腺的人类)，可以诱导胸腺的重新激活。在接受性类固醇消融治疗的前列腺癌患者中，已见到血液T淋巴细胞状况的显著改善。虽然很难确定这些细胞是否只来自胸腺，但这似乎是唯一合乎逻辑的结论，因为未见到其他来源的主流(CDαβ链)T细胞的描述。胃肠道T细胞主要是TCRγδ或CD8αα链。
参考文献Aspinall，R.，1997，″Age-associated thymic atrophy in the mouse is due to adeficiencyaffecting rearrangement of the TCR during intrathymic T cell development，″J.Immunol.1583037.Bahnson，A.B.，et al，1997，“Method for Retrovirus-Mediated Gene Transfer to CD34+-Enriched Cells，”in GENE THERAPY PROTOCOLS(P.D.Robbins，ed.)，Humana Press，pp.249-263.Baueer，G.，et al.，1997，“Inhibition of Human Immunodeficiency Virus-1(HIV-1)ReplicationAfter Transduction of Granulocyte Colony-Stimulating Factor-Mobilized CD34+Cells FromHIV-1-Infected Donors Using Retroviral Vectors Containing Anti-HIV-1 Genes，”Blood892259-2267.Belmont，J.W.and R.Jurecic，1997，“Methods for Efficient Retrovims-Mediated GeneTransfer to Mouse Hematopoietic Stem Cells，”in GENE THERAPY PROTOCOLS(P.D.Robbins，ed.)，Humana Press，pp.223-240.Berzins，S.P.，Boyd，R.L.and Miller，J.F.A.P.，1998，″The role ofthe thymus and recemthymic migrants in the maintenance of the adult peripheral lymphocyte pool，″J Exp.Med.1871839.Bonyhadi，M.L.，et al.，1997，“RevM10-Expressing T Cells Derived In Vivo FromTransduced Human Hematopoietic Stem-Progenitor Cells Inhibit Human ImmunodeficiencyVirus Replication，”J.Virology 714707-4716.Boyd，R.L.，Tucek，C.L.，Godfrey，D.I.，Wilson，T.J，Davidson，N.J.，Bean，A.G.D.，Ladyman，H.M.，Ritter，M.A.and Hugo，P.，1993，″The thymic microenvironment，″Immunology Today14445.Bruijntjes，J.P.，Kuper，C.J.，Robinson，J.E.and Schutirman，H.J.，1993，″Epithelium-free areain the thymic cortex of rats，″Dev.Immunol.3113.Capecchi，M.R.，1980，“High Efficiency Transformation by Direct Microinjection of DNAInto Cultured Mammalian Cells，”Cell 22479-488.Carayon，P.，and Bord，A.，1992，″Identification of DNA-replicating lymphocyte subsets usinga new method to label the bromo-deoxyuridine incorporated into the DNA，″J.Imm.Methods147225.Douek，D.C.，McFarland，R.D.，Keiser，P.H.，Gage，E.A.，Massey，J.M.，Haynes，B.F.，Polis，M.A.，Haase，A.T.，Feinberg，M.B.，Sullivan，J.L.，Jamieson，B.D.，Zack，J.A.，Picker，L.J.and Koup，R.A.，1998，″Changes in thymic function with age and during the treatment of HIVinfection，“Nature 396690.Fredrickson，G.G.and Basch，R.S.，1994，″Early thymic regeneration after irradiation，″Development and Comparative Immunology 18251.George，A.J.and Ritter，M.A.，1996，″Thymic involution with ageingobsolescence or goodhousekeeping？，″Immunol.Today 17267.Godfrey，D.I，Izon，D.J.，Tucek，C.L.，Wilson，T.J.and Boyd，R.L.，1990，″Thephenotypicheterogeneity of mouse thymic stromal cells，″Immunol.7066.Godfrey，D.I，and Zlotnik，A.，1993，″Control points in early T-cell development，″Immunol.Today 14547.Graham，F.L.and Van Der Eb，A.J.，1973，“A New Technique for the Assay of Infectivjty ofHuman Adenovirus 5 DNA，”Virology 52456-457.Hirokawa，K.，1998，″Immunity and Ageing，″in PRINCIPLESANDPRACTICEOFGERIATRICMEDICINE，(M.Pathy，ed.)John Wiley and Sons Ltd.Hirokawa，K.and Makinodan，T.，1975，″Thymic involutionthe effect on T celldifferentiation，″J.Immunol.1141659.Hirokawa，K.，Utsuyama M.，Kasai，M.，Kurashima，C.，Ishijima，S.and Zeng，Y.-X.，1994，″Understanding the mechanism of the age-change of thymic function to promote T celldifferentiation，″Immunology Letters 40269.Hobbs，M.V.，Weigle，W.O.，Noonan，D.J.，Torbett，B.E.，McEvilly，R.J.，Koch，R.J.，Cardenas，G.J.and Ernst，D.N.，1993，″Patterns of cytokine gene expression by CD4+T cellsfrom young and old mice，″J.Immunol.1503602.Homo-Delarche，R.and Dardenne，M.，1991，″The neuroendocrine-immune axis，″Seminarsin Immunopathology.Huiskamp，R.，Davids，J.A.G.and Vos，O.，1983，″Short-and long-term effects of wholebody irradiation with fission neutrons or x-rays on the thymus in CBA mice，″RadiationResearch 95370.Kendall，M.D.，1988，″Anatomical and physiological factors influencing the thymicmicroenvironment，″in THYMUS UPDATE I，Vol.1.(M.D.Kendall，and M.A.Ritter，eds.)Harwood Academic Publishers，p.27.Kohn，D.B.，et al.，1999，“A Clinical Trial of Retroviral-Mediated Transfer of a rev-Responsive Element Decoy Gene Into CD34+Cells From the Bone Marrow of HumanImmunodeficieney Virus-1 Infected Children，”Blood 94368-371.Kurashima，C，Utsuyama，M.，Kasai，M.，Ishijima，S.A.，Konno，A.and Hirokawa，A.，1995，″The role of thymus in the aging of Th cell subpopulations and age-associated alteration ofcytokine production by these cells，″Int. Immunol.797.Mackall，C.L.et.al.，1995，″Age，thymopoiesis and CD4+T-lymphocyte regeneration afterintensive chemotherapy，″New England J.Med.332143.Mackall，C.L.and Gress，R.E.，1997，″Thymic aging and T-cell regeneration，″Immunol.Rev.16091.Nabel，E.G.，et al.，1992，“Gene Transfer In Vivo With DNA-Liposome ComplexesLack ofAutoimmunity and Gonadal Localization，”Hum.Gene Ther.3649-656.Panoskaltsis，N，and C.N.Abboud，1999，“Human Immunodeficiency Virus and theHematopoietic RepertoireImplications For Gene Therapy，”Frontiers in Bioscience 4457.Penit，C.and Ezine，S.，1989，″Cell proliferation and thymocyte subset reconstitution insublethally irradiated micecompared kinetics of endogenous and intrathymically transferredprogenitors，″Proc.Natl.Acad.Sci，U.S.A.865547.Penit，C.，Lucas，B.，Vasseur，F.，Rieker，T.and Boyd，R.L.，1996，″Thymic medulla epithelialcells acquire specific markers by post-mitotic maturation，″Dev.Immunol.525.Plosker，G.L.and Brogden，R.N.，1994，″Leuprorelin.A review of its pharmacology andtherapeutic use in prostatic cancer，endometriosis and other sex hormone-related disorders，″Drugs 48930.Potter，H.，Weir，L.，and Leder，P.，1984，“Enhancer-dependent expression of Human KappaImmunoglobulin Genes Introduced Into Mouse pre-B Lymphocytes by Electroporation，”Proc.Natl.Acad.Sci.USA 817161-7165.Randle-Barrett，E.S.and Boyd，R.L.，1994，″Thymic microenvironment and lymphoidresponses to sublethal irradiation，″Dev.Immunol.41.Scollay，R.G.，Butcher，E.C.and Weissman，I.L.，1980，″Thymus cell migration.Quantitativeaspects of cellular traffic from the thymus to the Periphery in mice，″Eur.J.Immunol.10210.Shortman，K.，Egerton，M.，Spangrude，G.J.and Scollay，R.，1990，″The generation and fateof thymocytes，″Seminars in Immuno.23.Starzl，T.E.，Demetris，A.J.，Murase，N.，Ricardi，C.and Truce，M.，1992，″Cell migration，chimerism，and graft acceptance，″Lancet 3391579.Suda，T.，and Zlotnik，A.，1991，″IL-7 maintains the T cell precursor potential of CD3-CD4-CD8-thymocytes，″J.Immunol.1463068.Timm，J.A.and Thoman，M.L.，1999，″Maturation of CD4+lymphocytes in the agedmicroenviroment results in a memory-enriched population，″J.Immunol.162711.Thomson，A.W.and Lu，L.，1999，″Are dendritic cells the key to livet transplant？，″Immunology Today 2020.Tosi，R.，Kraft，R.，Luzi，P.，Cintorino，M.，Fankhause，G.，Hess，M.W.and Cottier，H.，1982，″Involution pattern of the human thymus.1.Size of the conical area as a function of age，″Clin.Exp.Immunol.47497.van Ewijk，W.，Rouse，R.V.and Weissman，I.L.，1980，″Distribution of H-2microenvironments in the mouse thymus，″J.Histochem.Cytochem.281089.Vickery，B.H.，et al.，eds.，1984，LHRH AND ITS ANALOGSCONTRACEPTIVE & THERAPEUTICAPPLICATIONS，MTP Press Ltd.，Lancaster，PAvon Freeden-Jeffry，U.，Vieira，P.，Lucian，L.A.，McNeil，T.，Burdach，E.G.and Murray，R.，1995，″Lymphopenia in interleukin(IL)-7 gene-deleted mice identifies IL-7 as anonredundant cytokine，″J.Exp.Med.1811519.Wiles，M.V.，Ruiz，P.and Imhof，B.A.，1992，″Interleukin-7 expression during mouse thymusdevelopment，″Eur.J.Immunol.221037.Yang，N.-S.and P.Ziegelhoffer，1994，“The Particle Bombardment System for MammalianGene Transfer，”In PARTICLEBOMBARDMENTTECHNOLOGY FORGENETRANSFER(Yang，N.-S.and Christou，P.，eds.)，Oxford University Press，New York，pp.117-141.Zlotnik，A.and Moore，T.A.，1995，″Cytokine production and requirements during T-celldevelopment，″Curr.Opin.Immunol.7206.
权利要求
1.改善免疫的方法，包括重新激活所述患者的胸腺。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述患者的胸腺已经至少部分失活。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述患者是青春期后的。
4.根据权利要求1所述的方法，进一步包括给予所述患者造血干细胞的步骤。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述造血干细胞为CD34+。
6.根据权利要求4所述的方法，其中所述造血干细胞是自体或同种同基因的。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述造血干细胞是同种异基因的、或异种异基因的。
8.根据权利要求4所述的方法，其中所述造血干细胞是大约在所述胸腺开始再生时或其后不久给予。
9.根据权利要求4所述的方法，其中所述造血干细胞是在传向所述胸腺的性类固醇介导的信号开始被阻断时提供。
10.根据权利要求1所述的方法，其中阻断传向所述胸腺的性类固醇介导的信号的所述方法是通过外科阉割以切除所述患者的性腺。
11.根据权利要求1所述的方法，其中阻断传向所述胸腺的所述性类固醇介导的信号的所述方法是通过给予一种或多种药物。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述药物是选自由LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、抗LHRH疫苗、及其组合组成的组。
13.根据权利要求12所述的方法，其中所述LHRH激动剂是选自由氟他胺、戈舍瑞林、亮丙立德、Dioxalan衍生物、曲普瑞林、美替瑞林、布舍瑞林、组胺瑞林、那法瑞林、黄体瑞林、亮丙瑞林、和地洛瑞林组成的组。
14.根据权利要求1所述的方法，导致所述患者免疫系统产生与青春期前患者的应答可比的疫苗应答。
全文摘要
本发明披露了一种增强患者免疫系统对免疫应答的方法。该方法是通过重新激活胸腺来完成的。可选择地，输入自体的、同种同基因的、同种异基因的、或异种异基因的造血干细胞，来增加患者免疫系统重建的速度。在优选的具体实施例中，造血干细胞是CD34+。通过阻断传向胸腺的性类固醇介导的信号来重新激活患者的胸腺。在优选的具体实施例中，这种阻断是通过给予LHRH激动剂、LHRH拮抗剂、抗LHRH受体抗体、抗LHRH疫苗、或其组合来实现。
文档编号A61K39/00GK1505522SQ01820291
公开日2004年6月16日 申请日期2001年10月12日 优先权日2000年10月13日
发明者理查德·博伊德, 理查德 博伊德 申请人:莫纳什大学