专利名称：干扰素受体2c多肽链在增强I型干扰素的抗生长作用中的应用的利记博彩app
背景技术：
自从1957年初次揭示以来，干扰素最初是以干扰病毒感染的因子加以阐述的，对其已经进行了广泛研究。目前意识到干扰素(IFN)是机体天然防御系统的一个完整部分，而且其成功用作治疗剂以治疗许多人体疾病。IFN分为两种类型I型或II型。I型IFN包括相关蛋白的一个家族，IFN，IFN，IFN，IFN和IFN，而II型IFN只由一种蛋白质组成，IFN，其与I型IFN具有有限的同源性。
两种受体蛋白，IFNAR1和IFNAR2已知参与I型IFN结合。
一方面，本发明涉及一种增强包含肿瘤细胞的靶细胞群上效应配体的作用的方法，其是通过提高针对靶细胞群内修饰的细胞的细胞表面上效应配体的功能受体的数目，然后用治疗有效量效应配体处理修饰的细胞而进行。如本文所用，靶细胞群可以包含一或多种细胞，靶细胞群内的修饰的细胞可包含所述靶细胞群的一或多种细胞。
另一方面，本发明涉及一种增强IFN对靶细胞群作用的方法，其通过提高靶细胞群内修饰的细胞的细胞表面上IFN的功能受体的数目，然后用治疗有效量IFN处理修饰的细胞而进行。IFN的作用例如包括抗病毒作用，抗生长作用及免疫调节作用。例如，已经发现提高靶细胞群内细胞表面上的IFNAR2c多肽的表达，可以增强I型IFN对靶细胞群细胞的作用。特别地，提高靶细胞群内修饰的细胞的细胞表面上I型IFN的功能受体的数目，可以增强I型IFN对靶细胞群的抗生长作用。
如本文所用，抗生长作用包括抗增殖和细胞程序死亡作用，以及导致细胞死亡，中止细胞生长，或减慢细胞生长的任何其它作用。抗增殖作用例如包括细胞周期停滞，或细胞周期时间增加，以及细胞程序死亡的诱导因子的诱导产生，负调节蛋白质合成、DNA合成或RNA合成的因子的诱导产生，或代谢途径抑制因子的激活。
不希望限于本发明的任何理论，本发明人相信I型IFN直接作用于IFNAR2c表达提高的细胞，以激发这些抗生长作用。然而，代替所述直接作用或除了所述直接作用之外，I型IFN还可以通过旁观作用呈现抗生长作用，其中I型IFN作用于IFNAR2c表达提高的细胞，以激发对相邻细胞具有抗生长作用的因子的分泌，这也是本发明的一部分。
因此，本发明涉及增强I型IFN对靶细胞群的抗生长作用的方法，其包括提高在靶细胞群内修饰的细胞的细胞表面上表达的功能性IFNAR2c受体链的数目，然后用治疗有效量的结合I型IFN受体的至少一种效应配体处理修饰的细胞。提高细胞表面功能性IFNAR1受体链的数目，也是本发明的一部分。结合I型IFN受体的一种优选的效应配体是I型IFN。
本文所用术语“修饰的细胞”意味着已经修饰的以高水平表达针对细胞表面上效应配体的功能受体的细胞。修饰的细胞可以包括在体内或源于体内修饰的，以高水平表达针对受体配体的功能受体的细胞。源于体内修饰的细胞可以在源于体内修饰后随后移至靶细胞群。修饰的细胞还可以包括天然发生的细胞，其相对高水平表达效应配体受体，而且可以加入靶细胞群中。
如本文所用，效应配体是指结合效应配体受体并实现至少一部分激活效应配体受体的任何分子。效应配体包括但不限于天然发生的效应配体，修饰的效应配体，嵌合的效应配体，效应配体模拟物，或效应配体受体的抗体。
优选的效应配体包括例如生长因子，细胞因子，趋化因子，和造血因子。特别优选的效应配体包括但不限于以下因子IFN；肿瘤坏死因子(TNF)，例如TNF和TNF；白细胞介素(IL)，例如IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-1 1，IL-12和IL-13；集落刺激因子(CSF)，例如粒细胞—巨噬细胞—CSF(GM-CSF)，单核细胞—CSF(M-CSF)，粒细胞—CSF(G-CSF)；促红细胞生成素(EPO)；干细胞因子(SCF)；白血病抑制因子(LIF)；表皮生长因子(EGF)；制癌蛋白M(OSM)；趋化因子受体1或5(CCR1或CCR5)等。
一种特别优选的效应配体是结合I型IFN受体的一种效应配体，包括I型IFN。如本文所用，I型IFN包括IFN，IFN，IFN，IFN和IFN，或任何新发现的I型IFN，所有这些根据本发明均可以使用。根据本发明，应用的I型IFN可以是例如具有抗生长活性，抗病毒活性，或免疫调节活性的任何亚型。所述亚型可以是天然发生的或重组的亚型，包括两或多个亚型的杂交体，或其类似物。抗生长活性可以通过本领域熟知的任何方法确定，包括以下实施例中所述那些技术。酶学方法，第119卷，Sidney Pestka编辑。根据本发明使用的已知I型IFN优选具有抗生长活性，这样掺入HT1080细胞中的胸苷，在最佳浓度的IFN中温育24小时后，被抑制5％，优选10％，更优选15％。也可以使用不同亚型的混合物。优选地，根据本发明可以使用的I型IFN包括IFN和IFN，包括但不限于以下亚型IFN亚型，包括但不限于IFN 1b和IFN 1a；IFN亚型包括但非限于IFN 2，IFN 5，IFN 13，IFN 6，IFN 14，IFN 16，IFN 21，IFN 10，IFN 46，IFN 46，IFN 7，和共有的αIFN。本发明可以使用的IFN例如包括但不限于以下因子。对于IFN 1b，可以应用“Betaseron”，这是一种重组产生的人IFN，其中在第17位的半胱氨酸残基已经由丝氨酸取代，如美国专利No4588585所揭示。另外，也可以应用一种重组产生的IFN 1a，其是在中国仓鼠卵巢(细胞)中产生的。对于IFN，可以应用人α-IFN产物Intron(Schering-Plough)，Roferon(Hoffman-LaRoche)和Infergen。可以应用的其它IFN包括共有的I型αIFN，例如美国专利No4695623，4897471和5541293所述。作为本发明一部分应用的干扰素还可以通过与其它分子缀合而修饰，例如美国专利No5981709所述。
修饰的细胞表面的功能性效应配体受体的数目可以以各种不同方式增加，这也是本发明的一部分。例如，可以正调节IFNAR2c基因的基因表达以提高细胞上IFNAR2c受体蛋白的数目。正调节基因表达可以例如通过将编码IFNAR2c多肽的一种外源多核苷酸导入修饰的细胞中，或通过正面影响内源IFNAR2c基因或外源IFNAR2c基因在修饰的细胞中的基因转录。例如，实现正调节基因表达可以通过直接或间接刺激启动子或其它调节序列，或通过激活刺激IFNAR2c多肽产生的基因。例如，可以应用小分子刺激IFNAR2c基因的启动子。正调节转录的小分子可以使用本领域熟知的方法鉴别。另外，可以应用本领域熟知的各种方法提高编码IFNAR2c蛋白的信使RNA的稳定性，或提高IFNAR2c多肽的稳定性。
一种优选的提高修饰的细胞的表面上功能IFNAR2c多肽数目的方法，是将编码IFNAR2c多肽的至少一种外源多核苷酸导入修饰的细胞中。根据本发明可以使用任何外源的IFNAR2c基因，包括例如人IFNAR2c基因或任何其它哺乳动物如小鼠，大鼠等的IFNAR2c基因。编码全长人IFNAR2c多肽的基因的DNA序列，及相应的氨基酸序列，见Lutfalla等，1995，EMBO杂志14(20)5100-5108；Domanski等，1995，生物化学杂志27021606-21611所述；并以SEQID NO3和4表示。编码全长小鼠IFNAR2c多肽的基因的DNA序列，及相应的氨基酸序列见Owczarek等，1997，生物化学杂志27223865-23870所示，并以SEQ ID NO1和2表示。编码人IFNAR2c多肽的基因的部分DNA序列也见于Novick，美国专利No5821078，EP 0588177 A2和EP 0676413 A2所揭示。如本文所用，外源IFNAR2c基因是指加入所述细胞中的任何IFNAR2c基因，包括在所述细胞中加入另一拷贝的任何内源IFNAR2c基因。
本发明不仅涉及提高靶细胞表面上天然发生的IFNAR2c多肽的数目，也涉及提高细胞表面突变的IFNAR2c多肽的数目。例如，IFNAR2c的氨基酸序列变化涵盖在本发明内。所述IFNAR2c多肽可以通过改变所述蛋白质的DNA而变化。使用具有相同或相似性质的氨基酸进行的保守氨基酸序列变化是优选的。氨基酸取代例如包括以下变化丙氨酸置换为丝氨酸；精氨酸置换为赖氨酸；天冬酰胺置换为谷氨酰胺或组氨酸；天冬氨酸置换为谷氨酸；半胱氨酸置换为丝氨酸；谷氨酰胺置换为天冬酰胺；谷氨酸置换为天冬氨酸；甘氨酸置换为脯氨酸；组氨酸置换为天冬酰胺或谷氨酰胺；异亮氨酸置换为亮氨酸或缬氨酸；亮氨酸置换为缬氨酸或异亮氨酸；赖氨酸置换为精氨酸，谷氨酰胺或谷氨酸；甲硫氨酸置换为亮氨酸或异亮氨酸；苯丙氨酸置换为酪氨酸，亮氨酸或甲硫氨酸；丝氨酸置换为苏氨酸；苏氨酸置换为丝氨酸；色氨酸置换为酪氨酸；酪氨酸置换为色氨酸或苯丙氨酸；缬氨酸置换为异亮氨酸或亮氨酸。
本发明的多核苷酸序列包括编码IFNAR2c多肽的DNA，cDNA和RNA序列。这种多核苷酸包括天然发生的，合成的，和有意操作的多核苷酸。例如，通过可变RNA剪接模式或使用RNA转录的可变启动子可以改变mRNA序列的一部分。另外，例如IFNAR2c多核苷酸可以进行定点诱变。本发明包括编码具有生物活性的IFNAR2c多肽的任何多核苷酸。IFNAR2c的生物活性是指一种多肽，当其在细胞表面表达时，具有以下之一活性(1)结合I型IFN；(2)当与IFNAR1二聚体化时，能增强至少一些IFN-介导的活性；(3)抗体结合活性，其中抗IFNAR2c的抗体抑制或阻断至少一种IFN介导的活性。
本发明的适当靶细胞群包括受益于增强IFN介导的活性的任何细胞群。例如，增殖性细胞病变可以根据本发明进行治疗。增殖性细胞病变包括需要限制细胞增殖的任何病变，包括癌症和致瘤病变。癌细胞包括但非限于多毛细胞白血病，多发性骨髓瘤，Kaposi’s肉瘤，宫颈瘤形成，基底细胞癌，鳞状细胞癌，黑素瘤，肾细胞癌，癌性肿瘤，皮肤T细胞淋巴瘤，非Hodgkins’s淋巴瘤，头颈部肿瘤，和乳腺、肺和前列腺肿瘤，胰腺肿瘤和腺癌中的细胞。作为实体肿瘤一部分的癌细胞群是本发明特别涵盖的一部分。另外，不宜动手术的癌如脑癌，胰腺癌，和晚期转移癌是本发明特别涵盖的一部分。
增殖性细胞病变中的细胞包括骨髓增殖性疾病中的细胞类型。骨髓增殖性疾病包括例如慢性骨髓性白血病，真性红细胞增多症，原因不明髓样化生和先天性血小板增多症。增殖性细胞病变还包括例如冠状再狭窄。使用I型IFN治疗冠状再狭窄见例如美国专利No5681558所述。
本发明还涵盖了本发明的方法可以与其它生长调节肽组合施用于靶细胞群。例如，根据本发明方法，可以将IFN组合其它生长调节多肽施用于含有修饰的高水平表达IFNAR2c多肽的细胞的靶细胞群，所述其它生长调节多肽如是生长因子或细胞因子，包括例如白细胞介素。另外，根据本发明，靶细胞群的细胞可以修饰为在靶细胞群内相同的修饰细胞或不同的修饰细胞上高水平表达一种以上的效应配体受体，例如I型IFN受体和白细胞介素受体，随后用相应的效应配体处理。
本发明还提供了治疗增殖性细胞病变的基因疗法。这种疗法例如可以通过将IFNAR2c基因导入靶细胞群的修饰的细胞中，随后用I型IFN或IFN受体的任何其它有效配体处理修饰的细胞而达到治疗作用。IFN受体的配体可以是外源加入的或内源产生的。所述IFNAR2c基因可以以任何有效的方式输送至机体，例如使用载体或其它输送载体，或者作为裸DNA输送。DNA输送载体可以包括病毒载体如腺病毒，腺伴随病毒，和逆转录病毒载体。见例如Bilbao等，1998，肿瘤定向359-79；Yia-Herttuala和Martin，2000，Lancet355213-222；Chu等，1994，基因治疗1292-299；Couture等，1994，人体基因治疗5667-677；Eiverhand等，1995，基因治疗2336-343。非病毒载体也是适当的，包括DNA-脂质复合物，例如脂质体介导的或配体/聚L赖氨酸缀合物，如脱唾液酸糖蛋白介导的输送系统。见例如Feigner等，1994，生物化学杂志2692550-2561；Derossi等，1995，Restor.Neurol.Neuros.87-10；和Abcallah等，1995，生物细胞851-7。可以产生逆转录病毒载体的逆转录病毒包括但非限于Moloney鼠白血病病毒(MoMuLV)，Harvey鼠肉瘤病毒(HaMuSV)，鼠乳腺肿瘤病毒(MuMTV)，和Rous肉瘤病毒(RSV)。本发明还涵盖了所述配体或编码所述配体的基因可以与编码IFNAR2c多肽的基因一起包含于基因治疗的输送载体中。
所述载体是局部或全身地施用于所述宿主。典型地，所述载体是通过静脉注射全身施用的。适当的病毒效价依赖于许多因素，如选择的特殊载体，所述宿主，施用模式，所用启动子的浓度，及所治疗疾病的病情。针对小鼠，腺病毒载体优选注射施用，剂量范围是大约5.0×106-10×106个噬斑形成单位(PFU)/g体重。优选的剂量范围是至少大约6-9×106PFU/g体重，更优选是至少大约6.7-8.6×106PFU/g体重。
含有高水平表达IFNAR2c基因的修饰的细胞的动物，是研究I型IFN对含有修饰的细胞的靶细胞群作用的有效模型。本发明特别涉及在人体进行的基因治疗。本发明还涵盖了在动物包括家养宠物和农场动物中进行基因治疗。
以纯化形式或以适当药物组合物施用I型IFN或其它配体，可以通过任何适当的施用模式进行。I型IFN可以局部或全身施用。因此所述施用可以例如经口，鼻，非肠道，局部，经皮或直肠施用。I型IFN可以作为固体或半固体剂型，冻干的粉末或液态剂型，包括例如片剂，栓剂，丸剂，软弹性和硬明胶胶囊，粉末，溶液，悬浮液，或气溶胶等，优选是适于简便施用的精确剂量的单位剂型。制药条件典型包括一种常规药物载体或赋形剂和I型IFN。所述组合物还可以包括其它医药制剂，药剂，载体，佐剂等。药物输送的方法见于Langer，1990，科学2491527-1533所述，在此将其并入参考。
施用I型IFN的优选途径是非肠道途径，使用常规日剂量方案。针对这样的非肠道施用，例如一种含有人IFN的药学适当组合物可以通过美国专利No4462940，4588585和4992271所述方法配制。
“治疗有效量”是指在靶细胞群中足以产生抗增殖作用的I型IFN的数量。这种使用数量的效力当然依赖于治疗的病变，和治疗对象的体重和一般状态。已经阐述了各种意见，例如Gilman等编辑，(1990)Goodman和Gilman’s治疗的药物学基础，第8版，Pergamon出版社；和Remington’s药物科学，第17版(1990)，Mack出版公司，Easton，PA，在此均并入参考。
在人体，I型IFN的治疗有效量典型是每天皮下施用大约0.05mgBetaseron至大约0.25mg Betaseron。其它干扰素产物包括其它-IFN产物的治疗有效量，可以由本领域技术人员常规确定。
本发明还涵盖了编码IFNAR2c多肽的基因与编码I型IFN的基因组合输送于靶细胞群中。所述IFNAR2c基因和I型IFN基因可以输送于靶细胞群的相同细胞或不同细胞。所述IFNAR2c基因可以在与I型IFN基因相同的组合物和/或相同载体中输送。例如，I型IFN基因和IFNAR2c基因可以作为相同病毒载体例如腺病毒载体的一部分而输送。另外，本发明还涵盖了IFN基因可以输送于与靶细胞群细胞相邻的细胞。另外，通过将表达I型IFN的细胞植入靶细胞群中或附近，将I型IFN输送于靶细胞。
图2是一个直方图，示出与未转染的HT1080细胞相比，通过用功能性IFNAR2c基因转染而拯救的U5A细胞对IFN 1b的抗增殖活性非常敏感。数据示出3个独立点的平均值，标准误差小于平均值的15％。
图3是一个直方图，示出HT1080细胞和用IFNAR2c基因转染的HT1080细胞(HTβL.2)对用IFN 1b的温育时间和IFN 1b的浓度均敏感，HTβL.2细胞示出敏感性增强。
图4是一个直方图，示出使用胸苷掺入分析，5000国际单位(IU)/ml的人IFN 1b(Betaseron)或人IFN 2对HT1080细胞和用IFNAR2c基因转染的HT1080细胞的抗生长作用的对比。数据是以细胞生长抑制倍数表示的。
图5是一个直方图，示出使用Alamar Blue分析，IFN 1b和IFN 2对HT1080细胞和用IFNAR2c基因转染的HT1080细胞的抗生长作用的对比。
图6示出在用IFN 1b处理细胞后，IFNAR2c转染的HT1080(HTβL.2)细胞的照片。A-D组如下A，未处理的细胞(10×放大)；B，处理的细胞(10×放大)；C，处理的细胞(20×放大)；和D，处理的细胞(40×放大)。用500IU/ml的IFN 1b处理细胞。
图7示出在用IFN 1b处理细胞后，IFNAR2c转染的MDA231细胞的相片。A和B分别示出未处理的和处理的MDA231细胞，10×放大。C和D分别示出处理的和未处理的IFNAR2c转染的MDA231细胞，10×放大。用500IU/ml的IFN 1b处理细胞。
图8是一系列显微图片，示出IFN 1b处理用编码IFNAR2c受体蛋白的基因转染的HT1080细胞(HTβL.2细胞)的作用的细胞程序死亡分析结果(TUNEL分析)。A-D如下A和B，未处理的HTβL.2细胞，分别为明视场显微镜观察和荧光显微镜观察；C和D，IFN 1b处理的HTβL.2细胞，分别为明视场显微镜观察和荧光显微镜观察；E和F，亲代HT1080细胞，分别为明视场显微镜观察和荧光显微镜观察。明视场图像A，C和E表示高于80％铺满细胞层。FITC标记的核苷酸用于标记具有细胞程序死亡特点的细胞的DNA片段(B，D和F)。细胞用500IU/ml的IFN 1b处理。A-F的放大倍数为10×。
图9是一系列显微图片，示出IFN 1b处理用编码IFNAR2c受体蛋白的基因转染的MDA231细胞(MDAβL.2细胞)的作用的细胞程序死亡分析结果(TUNEL分析)。A-F如下A和B，未处理的MDAβL.2细胞，分别为明视场显微镜观察和荧光显微镜观察；C和D，IFN 1b处理的MDAβL.2细胞，分别为明视场显微镜观察和荧光显微镜观察；E和F，亲代MDA231细胞，分别为明视场显微镜观察和荧光显微镜观察。明视场图像A，C和E表示高于80％铺满细胞层。FITC标记的核苷酸用于标记细胞程序死亡细胞中的DNA片段(B，D和F)。细胞用500IU/ml的IFN 1b处理。A-F的放大倍数为10×。
图10是一个直方图，示出使用一个小鼠肺部植入模型，IFN 1b(Betaseron)对LOX人黑素瘤细胞和对LOX-IFNAR2c细胞(用功能IFNAR2c基因转染的LOX细胞)的体内抗生长作用。LOX-IFNAR2c细胞示出对每隔一天腹膜内给予200μg的Betaseron敏感性增强。
不用进一步精确阐述，相信本领域技术人员通过前述内容可以最大程度利用本发明。以下优选的特异实施方案只是例证了本发明，而无以任何方式限制之意。
在以下实施例中，所有的温度均为摄氏度；而且除非特别说明，所有部分和百分率均是重量单位。
以上或以下引用的所有专利，专利申请和出版物均以其全文并入参考。
(i)HT1080细胞，人肺纤维肉瘤细胞系(ATCC No.CCL-121)。
(ii) U5A细胞，U5A细胞产生于HT1080细胞，并且是选择的没有IFNAR2c蛋白表达的HT1080细胞。U5A细胞不能应答I型IFN(Pellegrini等，1989，分子细胞生物学94605-4612；Lutfalla等，1996，EMBO杂志145100-5108)。
(iii) MDA231细胞，一种人乳腺上皮腺癌细胞系(ATCCNo.HTB-26)。
HT1080细胞和MDA231细胞购自美国典型培养物保藏中心(ATCC)，所有细胞系均在37℃在5％CO2中生长。
用Superfect(Qiagen公司)将细胞用含有全长或突变形式人IFNAR2c的表达质粒转染。如前所述构建含有编码IFNAR2c截短突变体或酪氨酸突变为苯丙氨酸突变体的基因的质粒(Domanski等，1997，生物化学杂志27226388-26393；Nadeau等，1999，生物化学杂志2744045-4052)。在G418中(1.0mg/ml)选择适当转染的细胞系。在选择后，挑取各个克隆并扩展，使用特异于IFNAR2ccDNA的内含子跨越引物，通过PCR分析证实IFNAR2c基因整合。将阳性克隆进一步扩展并测试其结合I型IFN的能力。
基本如Croze等所述进行配体结合分析(1996，生物化学杂志27133165-33168)。具有特异活性的3.0×108IU/mg的IFN得自PeproTech公司(Rocky Hill，NJ)，并将IFN 2配体磷酸化为60-62μCi/μg的特异活性(Croze等，1996，生物化学杂志27133165-33168)。通过在200000个细胞中加入磷酸化的IFN 2(浓度为176pM)进行90分钟，分析配体结合情况。非特异性结合通过加入100倍的未标记的IFN 2加以确定。结合数据通过Scatchard分析加以分析。
亲代HT1080细胞相对高亲和性结合IFN 2(Kd约为290pM)，并通过Scatchard分析测定每个细胞有9000个受体位点。对用野生型IFNAR2c基因转染的HT1080细胞的3个适当克隆(HTβL.1，HTβL.2和HTβL.4)，分析IFN 2结合情况。其中有2个克隆，HTβL.1和HTβL.2，与亲代HT1080细胞相比，结合约8倍多的配体(结合34-37pM)，而另一个克隆(HTβL.4)结合约2倍多的配体(结合11-12pM)(图1，A组)。
将人乳腺腺癌细胞系MDA231的细胞也用野生型IFNAR2c基因转染。分析两个稳定的克隆MDAβL.1和MDAβL.2的IFN 2结合情况。亲代MDA231细胞系相对低水平结合IFN 2(2-3pM)。与亲代MDA231细胞系相比，每个转染的克隆结合将近10倍多的IFN 2(图1，B组)。
将不表达IFNAR2c受体蛋白的U5A细胞，用野生型IFNAR2c基因和4种突变基因转染，所述4种突变基因包括3种截短突变体(R2.462，R2.417，R2.346)，和1种全部酪氨酸突变为苯丙氨酸的取代突变体(R2.Y-F)(在SEQ ID NO3的第269，306，316，318，337，411和512位的酪氨酸用苯丙氨酸取代)。用野生型IFNAR2c基因转染的U5A细胞比亲代HT1080细胞多结合13倍的IFN(图1，C组)。表达R2.462或R2.346截短突变体，或(R2.Y-F)缺失突变体的适当的克隆，结合IFN 2的水平比亲代HT1080细胞高5-10倍(图1，C组)。表达R2.417截短突变体的适当克隆结合IFN 2的水平与HT1080细胞几乎相同(约9000个结合位点)。实施例2通过用IFNAR2c基因转染，增强U5A和HT1080细胞对IFN的抗增殖作用的敏感性测试用野生型和突变的IFNAR2c基因转染的U5A细胞，与U5A细胞相比对IFN 1b的抗增殖作用的敏感性。也测试用野生型IFNAR2c基因转染的HT1080细胞，与HT1080细胞相比对IFN和IFN的抗增殖作用的敏感性。使用胸苷掺入分析测试细胞对IFN 1b抗增殖作用的敏感性。
将细胞种植于24孔培养平板中，密度为2×104个细胞/ml，1ml/细胞，并用人IFN 1b以1000IU/ml的浓度温育24小时。人IFN 1b(比活性2.5×107IU/mg)是如(Russell-Harde，1995，干扰素细胞因子研究杂志1531-37)所述产生的。在0时间点，加入含有含氚胸苷(甲基-3H胸苷，比活性＝40-60Ci/mmol，Amersham LifeSciences)的完全培养基。含氚胸苷的掺入通过以下方法在10小时后测定。将细胞用磷酸盐缓冲盐水洗，随后用10％三氯乙酸(TCA)洗，然后用100％乙醇洗。在确定掺入的放射性之前，将细胞溶解于IM氢氧化钾中，并将溶解的细胞与Ecolume闪烁液混合，以测定含氚胸苷的掺入。
用野生型IFNAR2c基因转染的U5A细胞对IFN 1b的抗增殖作用非常敏感，而U5A细胞不敏感(图2)。用编码在第462残基位截短的蛋白质的突变IFNAR2c基因转染的U5A细胞，对IFN 1b的抗增殖作用也敏感。两个其它的截短突变体，R2.417和R2.246，和R2.Y-F突变体(见实施例1所述)，对I型IFN无应答。因此，在过了第417残基位而截短的IFNAR2c受体或除去位于IFNAR2c胞内区域中所有酪氨酸(R2.Y-F突变体)，使含有两种I型IFN受体蛋白的细胞对I型IFN的抗增殖作用不敏感。然而，除去IFNAR2c蛋白的远侧53个残基(R2.462)，对I型IFN的受体介导的抗增殖作用无作用。表达正常水平IFNAR2c受体蛋白的HT1080细胞，对IFN 1b的抗增殖作用只微弱敏感。
表1
1.抗增殖作用是通过胸苷掺入分析测定的。
2.细胞死亡是通过如以下实施例4所述目测测定的。
3.细胞程序死亡是通过TUNEL分析测定的，如以下实施例5所述。实施例3IFNAR2c转染的高水平表达IFNAR2c的HT1080细胞对I型IFN和I型IFN的作用均敏感使用Alamer BlueTM分析(Biosource#DAL1100)，对比不同温育时间和浓度的IFN 1b对HT1080细胞和用野生型IFNAR2c基因转染的HT1080细胞(HTβL.2细胞)的作用，以测定线粒体活性。将细胞以亚铺满密度铺板于6孔平皿中，并用0，50，500或5000IU/ml的IFN 1b温育0，24或48小时。在各种时间点，将Alamar Blue试剂加入细胞中(1∶10稀释)，并在细胞上温育30分钟。在30分钟，用荧光平板读数器检测还原的/荧光Alamar Blue。HT1080细胞和HTβL.2细胞均呈现对IFN 1b剂量和时间依赖性应答(图3)。然而，与HT1080细胞相反，HTβL.2细胞在24-48小时不持续生长。尽管HT1080细胞的增殖速度在经IFN 1b处理后下降，但细胞数目持续增加。相反，HTβL.2细胞经过一段时间以后细胞数目实际降低。这种降低可能是由于在HTβL.2细胞而非HT1080细胞中产生的细胞程序死亡。
利用实施例2所述胸苷掺入分析，使用5000IU/ml的人IFN 1b(Betaseron)和人IFN 2，进行IFN和IFN对用IFNAR2c基因转染的HT1080细胞的抗生长作用对比(图4)。这种对比表明两种测试的IFN均对转染的细胞具有抗生长作用。
使用Alamar Blue分析，进行不同浓度的人IFN 1b和IFN 2对用IFNAR2c基因转染的HT1080细胞(HTβL.2)的抗生长作用对比(图5)。这种对比也表明IFN比IFN具有更高的抗生长作用，而且这两种IFN之间的作用不同在更高浓度的IFN时更明显。实施例4IFNAR2c转染的HT1080和MDA231细胞与亲代细胞系相比，对I型IFN的抗增殖作用更敏感HT1080细胞是产生自人纤维肉瘤的上皮样细胞。对高水平表达IFNAR2c的一个衍生自HT1080的稳定转染的细胞系(HTβL.2)，在用IFN 1b处理后检测其形态学变化(表1)。将细胞铺板于6孔平皿中，然后用500IU/ml浓度的IFN 1b处理。两天后，未处理的细胞形成一层细胞铺满毯(图6，A组)。IFN 1b处理的细胞不生长，在处理后与处理前相比出现少量细胞(图6，B组)。在较高放大倍数，处理的细胞的形态学表明细胞经历了细胞程序死亡(图6，C组(20×)和D组(40×))。处理的细胞呈现是球形“细胞程序死亡体”形式的细胞蛋白和DNA脱落的剩余物。HT1080细胞对用IFN 1b处理与HTLβ.2细胞相比不是非常明显受影响，在IFN 1b处理的HT1080细胞中未观测到细胞程序死亡体(图6，B组)。
对高水平表达IFNAR2c的衍生自MDA231的两个稳定转染的细胞系(MDAβL.l和MDAβL.2)，测试其在用IFN 1b处理后的形态学变化(表1)。将细胞用500IU/ml的IFN 1b处理3天，之后进行观测。用IFN 1b处理的亲代MDA231细胞的生长只略为增强，如图7所示，A组(未处理的亲代细胞)和B组(处理的亲代细胞)。相反，MDAβL.2细胞当用500IU/ml的IFN 1b处理时，其生长明显受抑制，如图7所示，C组(未处理的细胞)和D组(处理的细胞)。与高水平表达IFNAR2c的HT1080细胞相似，当用IFN 1b处理时，MDAβL.2细胞也呈现为形态经历细胞程序死亡。在MDA231细胞中比在HT1080细胞中形态学变化更难以确定，因为正常的MDA231细胞趋于呈现球形，而HT1080细胞通常以扁三角形生长。然而，在用I型IFN处理MDAβL.2细胞后，观测到细胞程序死亡作用增强。实施例5通过TUNEL分析检测HT1080和MDA231细胞高水平表达IFNAR2c蛋白使用TdT介导的dUTP切口末端标记(TUNEL)分析以标记片段化的核DNA，在处理的细胞中测定细胞程序死亡，所述片段化的核DNA是细胞程序死亡的标志(原位细胞死亡检测试剂盒，Boehringer Mannheim)。在TUNEL分析中，将荧光FITC标记的UTP核苷酸移至产生的片段化的DNA末端，所述片段化DNA是在经历细胞程序死亡的细胞核中产生的。程序死亡的细胞在荧光显微镜下染色为淡绿色。在IFN处理4天后，将6孔细胞培养平板中的细胞在室温在含有4％低聚甲醛的1×PBS中固定1小时。然后将细胞在室温用甲醇中0.3％H2O2处理1小时。然后将细胞在室温在PBS中0.3％Triton-X100中透化30分钟，然后用PBS洗两次。将固定的和透化的细胞干燥，并用PAP笔(Biogenex)圈出细胞区域。然后将细胞程序死亡的细胞核如下用荧光标记(FITC)酶标记。将细胞在37℃用100μl染色剂温育45分钟，所述染色剂得自BoehringerMannheim(450μl标记溶液+50μl酶溶液)。将染色的细胞用PBS洗两次，然后在荧光显微镜下显影。
未处理的转染细胞示出有限量的TUNEL阳性核(图8A组，目测观察；B组，荧光显微镜检)。用IFN 1b处理的转染细胞示出一层绿色TUNEL阳性核，表示在细胞程序死亡的最后阶段有大量细胞组分(图8C组，目测观察；D组，荧光显微镜检)。在未处理的细胞中有少量TUNEL阳性细胞组分，可以反映低水平的I型IFN内源性产生。HT1080亲代细胞示出在IFN 1b处理后完全没有细胞程序死亡信号，表示完全没有TUNEL阳性核(图8E组，目测观察；F组，荧光显微镜检)。
用MDA231细胞进行TUNEL分析获得的结果与用HT1080细胞获得的那些结果相似。未处理的转染的MDA231细胞(MDAβL.2)示出有限量的TUNEL阳性核(图9A组，目测观察；B组，显微镜检)。用IFN 1b处理的转染的MDA231细胞(MDAβL.2)示出一层绿色TUNEL阳性核，表示在细胞程序死亡的最后阶段中有大量细胞组分(图9C组，目测观察；D组，显微镜检)。亲代MDA231细胞当用500IU/ml的IFN 1b处理4天时，只示出微弱细胞程序死亡信号(图8C组，目测观察；D组，显微镜检)。在未处理的MDAβL.2细胞中TUNEL阳性细胞的组分可以反映低水平I型IFN内源性产生。实施例6用IFNAR2c转染的人肿瘤细胞系比亲代细胞系对IFN 1b的体内抗生长活性更敏感将LOX人黑素瘤细胞注射入裸鼠的尾静脉中，在4周后导致在肺部发生所述肿瘤。将这个模型用于确定IFN 1b处理高水平表达IFNAR2c蛋白的肿瘤细胞的作用。将裸鼠(15个/组)用亲代LOX细胞或用编码IFNAR2c受体蛋白的基因转染的LOX细胞注射。从注射后第2天开始，每隔一天将小鼠腹膜内注射200μg Betaseron或等体积(200μl)盐水。在注射后28天，将小鼠处死，取出其肺部并均质。通过蛋白酶K消化提取DNA，随后通过Qiagen层析柱纯化。肺部中人DNA的数量，一种间接测定LOX亲代细胞或LOX-IFNAR2c肿瘤细胞数目的标志，是通过TaqManPCR确定的，使用特异于人CCR5基因的引物和探针。使用纯化的人基因组DNA制备标准曲线。
LOX亲代细胞和OX-IFNAR2c细胞对全身施用的Betaseron的体内抗生长活性均敏感，用IFNAR2c转染的LOX细胞呈现敏感性增强。
将MDA231细胞注入裸鼠的股肌中，导致在两周后所述肿瘤发生。这个模型可以用于确定IFN 1b处理高水平表达IFNAR2c蛋白的肿瘤细胞的作用。将裸鼠注射亲代MDA231细胞或用编码IFNAR2c受体蛋白的基因转染的MDA231细胞。在注射的小鼠中全身施用IFN1b抑制肿瘤增殖的作用是通过处死小鼠并测定肿瘤大小而确定的。
前述实施例通过改变本发明实施例中所用的一般或特别阐述的试剂和/或操作条件，可以获得相似结果。
从前面所述内容中，本领域技术人员可以易于理解本发明的基本特征，而且在不偏离本发明精神和范围的情况下，可以对本发明加以任何改变和修改，以使其适应各种用途和条件。
权利要求
1.一种增强I型IFN对靶细胞群作用的方法，包括提高靶细胞群内修饰的细胞的表面上功能性IFNAR2c受体链的数目，然后将修饰的细胞暴露于治疗有效量的I型IFN。
2.权利要求1的方法，其中所述作用包括抗生长作用。
3.权利要求2的方法，其中修饰的细胞表面上功能性IFNAR2c受体链的数目通过正调节IFNAR2c基因的表达而提高。
4.权利要求3的方法，其中正调节IFNAR2c基因的表达通过将一种编码IFNAR2c多肽的外源基因导入修饰的细胞中而实现。
5.权利要求3的方法，其中正调节IFNAR2c基因的表达通过将靶细胞群的修饰的细胞暴露于刺激IFNAR2c基因启动子的小分子而实现。
6.权利要求2的方法，其中I型IFN是I型-IFN，I型IFN，I型IFN，或共有的I型IFN。
7.权利要求2的方法，其中所述靶细胞群的细胞是增殖性细胞病变中的细胞。
8.权利要求7的方法，其中增殖性细胞病变中的细胞是癌细胞。
9.权利要求7的方法，其中增殖性细胞病变中的细胞是参与再狭窄的平滑肌细胞。
10.权利要求4的方法，其中使用一种病毒载体将编码IFNAR2c多肽的至少一个外源基因输送至修饰的细胞。
11.权利要求10的方法，其中所述病毒载体衍生自逆转录病毒或腺病毒。
12.权利要求2的方法，其中I型IFN对靶细胞群的抗生长作用提高至少5％。
13.权利要求2的方法，其中I型IFN的抗生长作用提高至少10％。
14.权利要求10的方法，其中所述编码IFNAR2c多肽的外源基因和编码I型IFN的基因作为相同病毒载体的一部分输送至靶细胞群。
15.一种增强效应分子对靶细胞群的抗生长作用的方法，包括提高靶细胞群内修饰的细胞的表面上功能性效应分子受体的数目，然后将修饰的细胞暴露于治疗有效量的效应分子。
16.权利要求15的方法，其中所述效应分子是一种生长因子或白细胞介素。
17.权利要求15的方法，其中效应分子受体的数目通过正调节编码效应分子受体的基因表达而提高。
18.权利要求17的方法，其中正调节编码效应分子受体的基因表达是通过将编码效应分子受体的一种外源基因导入修饰的细胞中而实现。
19.权利要求17的方法，其中正调节编码效应分子受体的基因表达是通过将靶细胞群的修饰的细胞暴露于一个小分子而实现，所述小分子刺激编码效应分子受体的基因的启动子。
20.权利要求15的方法，其中所述效应分子对靶细胞群的抗生长作用提高至少10％。
21.一种增强I型IFN对靶细胞群的作用的方法，包括提高靶细胞群内修饰的细胞的表面上功能性IFNAR2c受体链的数目，然后将修饰的细胞暴露于治疗有效量的I型IFN。
全文摘要
本发明涉及一种增强I型IFN对靶细胞群中的细胞的抗生长作用的方法，包括提高靶细胞群内修饰的细胞的表面上功能性IFNAR2c受体的数目，然后将修饰的细胞暴露于治疗有效量的I型IFN或暴露于内源性产生的IFN。
文档编号A61K38/22GK1444486SQ01813390
公开日2003年9月24日 申请日期2001年7月26日 优先权日2000年7月26日
发明者埃德·克罗兹, 戴维·沃格尔, 迪安·拉塞尔－哈尔德 申请人:舍林股份公司