专利名称：新型脱氧核苷激酶多底物变体的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及新型多底物脱氧核糖核苷激酶的变体。更具体地，本发明提供来源于昆虫或低等脊椎动物，特别是来自黑腹果蝇(Drosphila melanogaster)，来自家蚕(Bombyx mori)，或者来自滑爪蟾(Xenopus laevis)的新型脱氧核糖核苷激酶变体，编码多底物脱氧核糖核苷激酶变体的新型多核苷酸，含有该多核苷酸的载体构建体，含有该多核苷酸或载体的宿主细胞，使细胞对前体药物敏感的方法，抑制恒温动物中病原体的方法，以及含有本发明的脱氧核糖核苷激酶变体的药物组合物。
来自各种生物的脱氧核糖核苷激酶的不同之处在于其底物特异性，基因表达的调控以及细胞定位。在哺乳动物细胞中，具有四种酶，这四种酶的特异性相互重叠，胸腺嘧啶脱氧核苷激酶1(TK1)和2(TK2)，脱氧胞嘧啶核苷激酶(dCK)和脱氧鸟嘌呤核苷激酶(dGK)，磷酸化嘌呤以及嘧啶脱氧核糖核苷。TK1和TK2是嘧啶特异性并且能够使脱氧尿嘧啶核苷(dUrd)和胸腺嘧啶核苷(dThd)磷酸化，并且TK2还能够使脱氧胞嘧啶核苷(dCyd)磷酸化。dCK使dCyd，脱氧腺嘌呤核苷(dAdo)以及脱氧鸟嘌呤核苷(dGuo)磷酸化，但不能使dThd磷酸化。dGK使dGuo以及dAdo磷酸化。TK1是细胞液酶，而TK2和dGK存在于线粒体中，尽管最近有报道显示TK2也存在于胞液中。
在原核生物细胞中，脱氧核糖核苷激酶的模式并不十分清楚。在大肠杆菌(E.coli)中，似乎只存在一种脱氧核糖核苷激酶，其与哺乳动物的TK1相似，具有TK的特征。似乎缺乏结合dCyd，dAdo以及dGuo的能力。在嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)中，其缺乏核糖核苷酸还原酶，这四种脱氧核糖核苷是通过三种酶磷酸化。除了类似于大肠杆菌TK的TK，还存在两种激酶复合物，其能够使dCyd，dAdo以及dGuo磷酸化。复合物I是dCK/dAK，复合物II是dGK/dAK。
有几种病毒携带TK基因。疱疹(Herpes)病毒具有TK，其能够使dCyd以及TMP和dCMP磷酸化。底物特异性相对广泛的疱疹激酶与哺乳动物TK2，dCK和dGK具有许多共同的特征。痘病毒编码的TK与哺乳动物TK1非常相似。
但是，到目前为止，没有任何已知的病毒，细菌或真核脱氧核糖核苷激酶显示出能够使所有的四种脱氧核糖核苷磷酸化的能力。
最近，从黑腹果蝇(Drosophila melnogaster)中分离出了一种脱氧核糖核苷激酶，并命名为黑腹果蝇脱氧核糖核苷激酶Dm-dNK[Munch-Petersen B，Piskur J，和Sondergaard LFourDeoxynucleoside kinase Activities from Drosophilamelanogaster Are Contained within a Single Monomeric Enzyme，a New Multifunctional Deoxynucleoside Kinase；J.Biol.Chem.(生物学化学杂志)1998 273(7)3926-3931]。接下来克隆了相应的基因并过表达[Munch-Pertersen B，Knecht W，Lenz C，Sondergaard L和Piskur J；Functional expression of amulti-substrate deoxyribonuceoside kinase from Drosophilamelanogaster and its C-terminal deletion mutants；J.Biol.Chem.2000 275(9)6673-6679]。
果蝇激酶具有使四种脱氧核糖核苷磷酸化的能力。这与所有已知的具有尽管部分重叠但不相同的底物特异性的脱氧核糖核苷激酶形成鲜明对比。
Dm-dNK催化的脱氧核糖核苷磷酸化的催化率依赖于底物，比报道的任何一种哺乳动物脱氧核糖核苷激酶要高4-20,000倍。胸腺嘧啶脱氧核苷的转化率比单纯疱疹病毒1(HSV1)胸腺嘧啶核苷激酶(TK)催化的高70倍。进一步地，Dm-dNK还能够使很大范围的核苷类似物磷酸化，这些核苷类似物用于癌症的化学疗法或对抗病毒感染。Dm-dNK独特的动力学属性使得该酶在生物技术和药物应用中倍受瞩目。
例如，测序中所用的ddNTPs以及PCR反应所用的dNTPs是利用有毒的化学物质通过化学合成产生的，导致大量副产品。有效酶促合成(双)脱氧核糖核苷的单磷酸会成为酶法生产核苷酸产品中一个关键的步骤，Dm-dNK广泛的底物可接受性以及高催化率使其成为该项任务的明显备选物质。
另外一个例子是在癌症的基因治疗中或者病毒感染的基因药物调整治疗中将脱氧核糖核苷激酶作为自杀基因。这里的基本概念就是利用编码HSV1-TK的基因转导癌症或病毒感染的细胞并继而将其暴露于核苷类似物。转导的激酶将会增强核苷类似物对于细胞毒性的或者抗病毒化合物的活化作用。这个概念说明了与HSV1-TK，人类脱氧胞嘧啶核苷激酶(dCK)和人类脱氧鸟嘌呤核苷激酶(dGK)相结合，增强细胞毒的或抗病毒的核苷类似物的效果。多数核苷类似物的活化关键步骤是转化为单磷酸形式。
所以，催化这个步骤的该酶的动力学属性对于这些药物的效力和选择性是十分重要的，为进一步完善该治疗概念有必要鉴定出更好的酶。具有这个独特动力学属性的Dm-dNK已经被设想为用作该目的的备选物[Johansson M，Van Rompay A R，Degreves B，Balzarini J和Karlsson ACloning and characterization of the multisubstratedeoxynuceloside kinase of Drosophila melanogaster，J.Biol.Chem.1999 274(34)23814-23819；以及Munch-Petersen等；J.Biol.Chem.2000 275(9)6673-6679]。
最近，在一项寻找更好的用于基因治疗的自杀基因-前体药物组合的研究中，通过引物介导的随机诱变或DNA家族改组(shuffling)而对HSV1-TK突变体进行了基因操作，其对核苷类似物3’-叠氮-2’，3’-双脱氧胸腺嘧啶核苷(齐多夫定，Retrovir，AZT)，更昔洛韦(Cytovene，GCV)以及阿昔洛韦(Zivirax，ACV)的特异性有所改进[Black M E，Newcomb T G，Wilson H M P以及Loeb L ACreationof drug-spacific herpes simplex Virus type 1 thymidine kinasemutants for gene therapy；Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院院刊)1996 93 3523529；Christians F C，Scapozza L，Crameri A，Folkers G和Stemmer W P CDirected evolution ofthymidine kinase for AZT phosphorylation using DNA familyshuffling；Nat.Biotechnol.1999 17 259-264；以及Kokoris M S，Sabo P，Adman E T和Black M EEnhancement of tumor ablationby a selected HSV-1 thymidine kinase mutant；Gene Therapy(基因治疗)1999 6 1415-1426]。
在2’-脱氧核糖部分有所改变的核苷类似物是医学中很重要的药物并且是生物技术中频繁使用的核苷酸前体。
相应地，在其第一个方面，本发明提供分离的，突变的多核苷酸，其编码多底物脱氧核糖核苷激酶，该突变的多核苷酸，当其相较于不突变的多核苷酸时，在转化到细菌或真核细胞中之后，使至少一种核苷类似物的致死剂量(LD100)降低了至少4倍。
本发明另一方面提供分离的脱氧核糖核苷激酶变体，该变体由本发明的多核苷酸编码。
本发明的第三个方面提供含有本发明多核苷酸的载体构建体。
本发明的第四个方面提供能够产生含有本发明病毒载体的传染性毒粒的包装细胞系。
本发明的第五个方面提供含有本发明突变多核苷酸或本发明载体的宿主细胞。
本发明的第六个方面提供使细胞对药物敏感的方法，该方法包括用本发明多核苷酸序列转染所述细胞的步骤，该序列编码一种促进所述前体药物转化为(细胞毒性)药物的酶；以及递送所述前体药物到所述细胞的步骤；其中所述细胞对于所述(细胞毒性)药物比所述前体药物更为敏感。
本发明的第七个方面，本发明提供抑制恒温动物中病原体的方法，该方法包括向所述动物施用本发明的突变多核苷酸，或者本发明的载体。
本发明的第八个方面提供含有本发明突变多核苷酸或者本发明载体的药物组合物。
本发明的第九个方面提供含有本发明酶变体以及药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
通过下述详细的说明以及实施例，本发明的其他目的对于本领域技术人员是显而易见的。发明详述突变多核苷酸本发明首先提供分离的，突变的多核苷酸，其编码昆虫或低等脊椎动物脱氧核糖核苷激酶。
本发明突变的多核苷酸包括DNA，cDNA和RNA序列，以及反义序列，包括天然存在的，合成的以及有意操作的多核苷酸。本发明的突变多核苷酸还包括遗传密码简并性的序列。
此处所定义的，术语“多核苷酸”指长度上至少有10个碱基的核苷酸多聚形式，优选15个核苷酸长度。“分离的多核苷酸”是指与两个编码序列未直接相连的多核苷酸，而在其所来自的有机体的天然基因组中，该多核苷酸与这两个编码序列是直接相连的(一个在5’端，一个在3’端)。所以该术语包括被并入了表达载体，或自主复制的质粒或病毒，或者原核生物或真核生物基因组DNA中的重组DNA，或者独立于其他序列作为分离的分子如cDNA存在的重组DNA。
此处所定义的突变多核苷酸是相较于未突变的(天然，野生型或亲本)核苷酸序列在一个或多个核苷酸位点有所区别的核苷酸序列。本发明的突变多核苷酸还可以特别含有编码核苷激酶变体的核苷酸序列，该激酶变体相较于天然的，野生型或者亲本激酶，具有在一个或多个位点有所改变的氨基酸序列。
在一个优选的实施方案中，该突变多核苷酸含有编码核苷激酶变体的核苷酸序列，该变体具有在非基序区域，和/或仅在一个基序区域的一个或多个位点改变了的氨基酸序列，如下面表1中所详细说明的。
在另一优选实施方案中，本发明的突变多核苷酸在转化到细菌或真核生物细胞中之后，相较于未突变的(野生型)多核苷酸，能够使至少一种核苷类似物的致死剂量降低至少4倍，更优选至少8倍，最优选至少10倍。在一个更优选的实施方案中，该核苷类似物是阿昔洛韦(9-[2-羟基-乙氧基]-甲基-鸟嘌呤核苷)，布昔洛韦，泛昔洛韦，更昔洛韦(9-[2-羟基-1-(羟甲基)乙氧基甲基]-鸟嘌呤核苷)，喷昔洛韦，伐昔洛韦(valciclovir)，三氟胸苷，AZT(3’-叠氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-双脱氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷(adenosine-arabinoside)；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷(cytidine-arabinoside))，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鸟嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脱氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-双脱氧尿苷，1-[2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脱氧尿苷)，氟达拉滨(2-氟腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他滨(gencitabine)，2’，3’-双脱氧次黄嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-双脱氧胞苷(ddC)，2’，3’-双脱氧胸苷(ddT)，2’，3’-双脱氧腺苷(ddA)，2’，3’-双脱氧鸟苷(ddG)，2-氯-2’-脱氧腺苷(2CdA)，5-氟脱氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脱氧尿苷)，FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脱氧-3’-硫杂胞苷(thiacytidine))，dFdC吉西他滨(2’，2’-双氟脱氧胞苷)，dFdG(2’，2’-双氟脱氧鸟苷)或者d4T(2’，3’-双脱氢-3’-脱氧胸苷)。
在另一个优选的实施方案中，本发明的突变多核苷酸在转化到细菌或真核细胞中之后，能够使至少两种不同的核苷类似物的致死剂量(LD100)降低至少4倍，优选至少8倍，最优选至少10倍，该类似物是基于两种不同的糖部分以及两种不同的碱基部分。
在一个优选的实施方案中，本发明的突变多核苷酸具有SEQ IDNOS9或11所显示的DNA序列。
酶变体本发明的另一方面提供基本上纯的脱氧核糖核苷激酶变体。
在本发明中，术语“酶变体”包括具有在一个或多个氨基酸位点不同于天然，亲本或野生型酶的氨基酸序列的多肽(或蛋白)，即，其一级氨基酸序列是被修饰的。这种酶变体包括下面更加详细描述的变体，和保守替换，拼接变体，同I型，来源于其他物种的同系物以及多态性。
本发明的新型酶变体特别可使用标准重组DNA技术，从本发明的突变多核苷酸来制备。
在一个优选的实施方案中，本发明的酶变体来自多底物激酶。此处定义，术语“多底物”指能够使所有四种天然核苷dC，dA，dG和dT(Thd)磷酸化的脱氧核糖核苷激酶。使所有四种天然核苷磷酸化的能力可以通过对dT的最大酶比活(酶活性/酶量)和对这些核苷的任一种的最大酶比活之比(对dT的最大酶比活/对dC，dG或dA的最大酶比活)进行鉴定。该比率范围优选0.01-100。
在一个优选实施方案中，与野生型酶相比，本发明酶变体在下列方面被改变(i) 比率“kcat/Km(底物)/kcat/Km(核苷类似物)”(即两边之间的比率，其中一边是至少一种天然底物的“kcat/Km”，另一边是至少一种核苷类似物的“kcat/Km”)被降低了至少5倍，更优选至少10倍，最优选至少20倍；和/或(ii)如使用2或10μM胸苷(dThd)作为底物通过其IC50值所检测到的，脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)特别是胸苷三磷酸(TTP)的反馈抑制，被降低了至少1.5倍，更优选至少2倍。
在一个优选实施方案中，本发明的酶变体相较于野生型酶，使至少2种不同核苷类似物的的致死剂量(LD100)降低了至少4倍，优选至少8倍，最优选至少10倍，该类似物类似性基于两种不同的糖部分和两种不同的碱基部分。
dNK编号系统(Numbering system)在本发明中，使用已建立的单字母符号指代氨基酸残基(还有核酸碱基)。
通过比对已知的脱氧核糖核苷激酶的氨基酸序列，可以利用特定的氨基酸编号系统，通过该系统可以清楚地给任何已知氨基酸序列的核苷激酶的任意氨基酸残基分派一个氨基酸位置号码。
这种比对如下面表1所示。该表中，Dm-dNK的最初N-末端氨基酸残基(即蛋氨酸；M)对应号码51，而Dm-dNK的最后C-末端氨基酸残基(即精氨酸；R)对应号码358。
在本发明中，该编号系统被命名为dNK编号系统。
在对各种本发明产生的或期望的酶变体描述中，为简化引用而改编下述命名原始氨基酸/位置/替代的氨基酸根据这个命名，在167号位置由缬氨酸变为丙氨酸的替换被标明为“V167A”。
在51位置蛋氨酸的缺失被标明为“M51*”。
一个额外氨基酸例如精氨酸插入到，例如邻接62的位置，可以被标明为“T62TR”或者“*63R”(假设为建立编号系统所使用的氨基酸序列中并没有该位点的位置)。
一个氨基酸残基例如谷氨酰胺插入到已建立的编号系统中的一个位置，但是事实上该位置不存在氨基酸残基，可以标明为“-116Q”。
通过这种方法“Dm-dNK/I199M/N216S/M217V/D316N”限定了这个特定的变体，其可以是来自黑腹果蝇脱氧核糖核苷激酶，其中在199位由蛋氨酸替换了异亮氨酸，在216位由丝氨酸替换了天冬酰胺，在217位由缬氨酸替换了蛋氨酸，在316位由天冬酰胺替换了天冬氨酸，这些位置依据下面的表1来确定。表1多序列比对dNK编号Dm-dNK---------- ---------- ---------- ---------- ---------- MAEAASCARK 060BmK ---------- ---------- ---------- ---------- ---------- ----------XenK MSVLLAARTC IRLCCTEHKT GALARFNLGA NTALTVRRIA SALCG-RCNI MRRGILPSGShu-TK2---------- ---------- ---------- ---------- ---------- --MGAFCQRPhu-dGK---------- ---------- ---------- --MAAGRLFL SRLRA-PFSS MAKSPLEGVShu-dCK---------- ---------- ---------- ---------- ---------- MATPPKRSCPHSV1-TK ---------- ---------- ----MASYPG HQHASAFDQA ARSRGHSNRR TALRPRRQQEDm-dNKGT-KYAEGTQ P--FTVLIEG NIGSGKTTYL NHFEKY--KN DICLLTEPVE KWRNV----- 120BmK ---MSANNVK P--FTVFVEG NIGSGKTTFL EHFRQF--E- DITLLTEPVE MWRDL-----XenK TGNGLKSREK S--TVICVEG NIASGKTSCL DYFSNT--P- DLEVFKEPVA KWRNV-----hu-TK2SSDKEQEKEK K--SVICVEG NIAGGKTTCL EFFSNA--T- DVEVLTEPVS KWRNV-----hu-dGKSSRGLHAGRG P--RRLSIEG NIAVGKSTFV KLLTKT--YP EWHVATEPVA TWQNIQAAGNhu-dCKSFSASSEGTR I--KKISIEG NIAAGKSTFV NILKQL--CE DWEVVPEPVA RWCNVQSTQDHSV1-TK ATEVRPEQKM PTLLRVYIDG PHGMGKTTTT QLLVALGSRD DIVYVPEPMT YWRVLGAS--. ..* **.. . **. * .
基序1 基序2Dm-dNK---------- NGVNLLELMY K-DP------ ------KKWA MPFQSYVTLT M--LQSHTAP 180Bm-dNK---------- KGCNLLELMY K-DP------ ------EKWA MTFQSYVSLT M--LDMHRRPXen-dNK ---------- CGHNPLGLMY Q-DP------ ------NKWG LTLQTYVQLT M--LDIHTKPhu-TK2---------- RGHNPLGLMY H-DA------ ------SRWG LTLQTYVQLT M--LDRHTRPhu-dGK---QKACTAQ SLGNLLDMMY R-EP------ ------ARWS YTFQTFSFLS R--LKVQLEPhu-dCKEFEELTMSQK NGGNVLQMMY E-KP------ ------ERWS FTFQTYACLS R--IRAQLASHSV1-TK ---------- ---ETIANIY TTQHRLDQGE ISAGDAAVVM TSAQITMGMP YAVTDAVLAP. . .* *.Dm-dNKTNKKLK---- --------IMERSIFSAR--YCFVENMRRN GSLEQGMYNT LEEWYKFIEE 240Bm-dNKAPTPVK---- --------LMERSLFSAR--YCFVEHIMRN NTLHPAQFAV LDEWFRFIQHXen-dNK SISPVK---- --------MMERSIYSAK--YIFVENLYQS GKMPAVDYAI LTEWFKWIVKhu-TK2QVSSVR---- --------LMERSIHSAR--YIFVENLYRS GKMPEVDYVV LSEWFDWILRhu-dGKFPEKLLQ--- ARKPVQ--IFERSVYSDR--YIFAKNLFEN GSLSDIEWHI YQDWHSFLLWhu-dCKLNGKLKD--- AEKPVL--FFERSVYSDR--YIFASNLYES ECMNETEWTI YQDWHDWMNNHSV1-TK HIGGEAGSSH APPPALTLIFDRHPIAALLCYPAARYLMGS MTPQAVLAFV ALIPPTLPGT.. .* . * .
基序3 基序4Dm-dNKSIHVQADL-- IIYLRTSPEV AY-ERIRQRA RSEESCVPLK YLQELHELHE DWLIHQRR-- 300Bm-dNKNIPIDADL-- IVYLKTSPSI VY-QRIKKRA RSEEQCVPLS YIEELHRLHE DWLINRIH--Xen-dNK NTDTSVDL-- IVYLQTSPEI CY-QRLKKRC REEESVIPLE YLCAIHNLYE DWLVKQTS--hu-TK2NMDVSVDL-- IVYLRTNPET CY-QRLKKRC REEEKVIPLE YLEAIHHLHE EWLIKGSL--hu-dGKEFASRITLHG FIYLQASPQV CL-KRLYQRA REEEKGIELA YLEQLHGQHE AWLIHKTTKLhu-dCKQFGQSLELDG IIYLQATPET CL-HRIYLRG RNEEQGIPLE YLEKLHYKHE SWLLHRTLKTHSV1-TK NIVLGAL--- -------PED RHIDRLAKRQ RPGER-LDLA MLAAIRRVYG --LLANTVRY* *. * * * . * * .. .*.
基序5Dm-dNK----PQSCKV LVLDADLNLE NIGTEYQRSE SSIFDAISSN QQPSPVLVSP SKRQRVAR-- 360Bm-dNK---AECPAPV LVLDADLDLS QITDEYKRSE HQILRKAVNV VMSSPNKHSP KKPISTTPIKXen-dNK ---FSVPAPV LVIDGNKELE ELTQHYEENR TSILSL---- ---------- ----------hu-TK2---FPMAAPV LVIEADHHME RMLELFEQNR DRILTPENRK HCP------- ----------hu-dGKHFEALMNIPV LVLDVNDDFS EE-VTKQEDL MREVNTFVKNL --------- ----------hu-dCKNFDYLQEVPI LTLDVNEDFK D----KYESL VEKVKEFLSTL --------- ----------HSV1-TK LQCGGSWRED WGQLSGTAVP PQGAEPQSNA GPRPHIGDTLF TLFRAPEL LAPNGDLYNV
Dm-dNK-------- 370Bm-dNKITPHMRILXen-dNK --------hu-TK2--------hu-dGK--------hu-dCK--------HSV1-TK FAWALDVL(…延续的)Dm-dNK 黑腹果蝇脱氧核糖核苷激酶[Munch-Petersen B，KnechtW，Lenz C，Sendergaard L和Piskur J；J.Bio1.Chem.2000 275(9)6673-6679]；GenBank ACCN AF226281；如SEQ ID NO1所示]Bm-dNK 家蚕(Bombyx mori)脱氧核糖核苷激酶[GenBank ACCNAF226281；如SEQ ID NO3所示，其制备如实施例3所述]Xen-dNK 滑爪蟾(Xenopus laevis)脱氧核糖核苷激酶[GenBankACCN AF250861；如SEQ ID NO5所示，其制备如实施例3所述]hu-TK2 人类胸苷激酶[GenBank ACCN 000142；Johansson M和Karisson A；J.Biol.Chem.1997 272(13)8454-8458]hu-dGK 人类脱氧鸟苷激酶[GenBank ACCN Q16854；Johansson M和Karisson A；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1996 93(14)7258-7262]hu-dCK 人类脱氧胞苷激酶[GenBank ACCN P27707；Chottiner，E.G.等；Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.1991 88(4)1531-1535]HSV1-TK 单纯性疱疹病毒胸苷激酶[GenBank ACCN CAA23742；McKnight SL；Nucleic Acids Res.(核酸研究)1980 8(24)5949-5964]“基序”标明一段保守的氨基酸基序- 表明在这个位置上缺乏(没有)氨基酸。
* 表明这个位置具有单一的完全保守的残基。
· 表明下列的“保守物”组之一是完全保守的-STA，NEQK，NHQK，NDEQ，QHRK，MILV，MILF，HY或FYW。
在另一优选的实施方案中，本发明的酶变体相较于野生型酶，在下述区域有突变(i)在非基序和/或非保守区域；和/或(ii)只在一个基序和/或保守的区域；和/或(iii)在任何保守的位置。
在更优选的实施方案中，本发明的酶变体相较于野生型酶，在下述位置有突变(i)在非基序中；和/或(ii)仅在一个基序区域；和/或(iii)在任何保守的位置。
此处定义，基序区域表明位于上面表1所鉴定的5个基序区域任何区域中的任何位置。非基序区域是含有不属于上述定义的基序区域的氨基酸残基的任何区域。
此处定义的保守位置是指表1中那些含有用星号(*)或句号(.)标记的氨基酸残基的位置和区域。在一个优选的实施方式中，保守的区域选自那些仅含有用星号标记的氨基酸残基的区域，即那些具有单一的、完全保守的残基的区域。非保守区域是含有不属于如上所定义的保守位置的氨基酸残基的区域。
在另一优选实施方式中，本发明的酶变体，相较于野生型酶，在下述位置中的一个或多个位置上有突变(包括替换，增加和缺失)51，62，82，91，100，102，107，112，114，134，138，139，140，164，167，168，171，199，202，207，211，213，214，216，217，220，222，228，229，274，277，281，283，284，307，309，316，318，321，334，347，和352(dNK编号)。
在一个更优选的实施方式中，本发明的酶变体相较于野生型酶，包含相对于G80，N81，I82，G83，S84，G85，K86，T87，T88，E107，P108，V109，E110，K111，W112，Y140，Q164，E201，R202，S203，C210，Y211，C212，P258，R265，I266，R267，Q268，R269，A270，R271，E274，L279，L282，或者L293保守的替换(dNK编号)。
此处所定义术语“保守替换”指一个氨基酸残基被另一个生物学类似的残基所替换。保守替换的例子包括(i)非极性或疏水性残基如丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸，脯氨酸，蛋氨酸，苯丙氨酸，或色氨酸的相互替换，特别是丙氨酸，亮氨酸，异亮氨酸，缬氨酸或者脯氨酸相互之间的替换；或(ii)一个中性的(不带电荷的)极性残基如丝氨酸，苏氨酸，酪氨酸，天冬酰胺，谷氨酰胺或半胱氨酸替换另一个，特别是精氨酸替换赖氨酸，谷氨酸替换天冬氨酸，或者谷氨酰胺替换天冬酰胺；或(iii)带正电荷的残基如赖氨酸，精氨酸或组氨酸之间相互替换；或(iv)带负电荷的残基如天冬氨酸或谷氨酸之间相互替换。
如果替代后的多肽所产生的抗体与未取代的多肽也具有免疫反应性，术语保守替换还包括使用替换的氨基酸残基替代亲代氨基酸残基。
在另一更优选的实施方式中，本发明的酶变体相较于野生型酶，包含下述的一个或多个变异M51T；T62A；N91D；N100D；I102T；N114D；N134D；N134S；L138S；M139L；M139V；V167A；V167S；V167M；T168A；M171R；I199M；A207D；V214A；N216S；M217V；N220S；S222W；Y228C；N229S；V277A；Y281H；S307P；K309R；D316N；N318D；N321S；F334L；L347P；和K352N(dNK编号)。
在另一优选的实施方式中本发明的酶变体相较于野生型酶包含下述变异M51T/T168A/N220S；T62A/V167A/N321S；N91D/N134D；N100D/N134D；N100D/N134D/N318D/L347P；N100D/N134D/I199M/N216S/M217V/D316N；I102T/N318D；N114D/M217V/Y281H；N134S/L138S/M139L/K352N；M139V/N318D/L347P；V167A/M171R/A207D；V167S/M171R/A207D；V167A/I199M/N216S/M217V/D316N；
V167A/N318D/L347P；T168A/N318D/L347P；T168A/I199M/N216S/M217V/D316N；M171R/A207D；I199M/V214A/N216S/M217V/D316N；I199M/N216S/M217V/N229S/S307P/D316N；I199M/N216S/M217V/D316N；S222W/F334L；Y228C/V277A/K309R；或N318D/L347P(dNK编号).
在一个优选的实施方式中，本发明的酶变体来自人胸苷激酶2(hu-TK2)；或者人脱氧鸟苷激酶(hu-dGK)；或人脱氧胞苷激酶(hu-dCK)；或者单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK)。
在另一优选实施方式中本发明的酶变体来自昆虫或低等脊椎动物，特别是黑腹果蝇脱氧核糖核苷激酶(Dm-dNK)，或者家蚕脱氧核糖核苷激酶(Bm-dNK)，或者滑爪蟾脱氧核糖核苷激酶(Xen-dNK)，或者冈比亚按蚊(Anopheles gambia)脱氧核糖核苷激酶。
在一个优选的实施方式中，本发明的酶变体是Dm-dNK/M51T；Dm-dNK/M51T/T168A/N220S；Dm-dNK/T62A；Dm-dNK/T62A/V167A/N321S；Dm-dNK/N91D；Dm-dNK/N91D/N134D；Dm-dNK/N100D；Dm-dNK/N100D/N134D；Dm-dNK/N100D/N134D/N318D/L347P；Dm-dNK/N100D/N134D/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/I102T；Dm-dNK/I102T/N318D；Dm-dNK/N114D；Dm-dNK/N114D/M217V/Y281H；Dm-dNK/N134D；Dm-dNK/N134S；Dm-dNK/N134S/L138S/M139L/K352N；Dm-dNK/L138S；Dm-dNK/M139L；Dm-dNK/M139V；Dm-dNK/M139V/N318D/L347P；Dm-dNK/V167A；Dm-dNK/V167A/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/V167A/N318D/L347P；Dm-dNK/T168A；Dm-dNK/V167A/M171R/A207D，Dm-dNK/V167S/M171R/A207D，Dm-dNK/T168A/N318D/L347P；Dm-dNK/T168A/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/M171R/A207D Dm-dNK/I199M；Dm-dNK/I199M/V214A/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/I199M/N216S/M217V/N229S/S307P/D316N；Dm-dNK/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/V214A；Dm-dNK/N216S；Dm-dNK/M217V；Dm-dNK/N220S；Dm-dNK/S222W；Dm-dNK/S222W/F334L；Dm-dNK/Y228C；Dm-dNK/Y228C/V277A/K309R；Dm-dNK/N229S；Dm-dNK/V277A；Dm-dNK/Y281H；Dm-dNK/S307P；Dm-dNK/K309R；Dm-dNK/D316N；Dm-dNK/N318D；Dm-dNK/N318D/L347P；Dm-dNK/N321S；Dm-dNK/F334L；Dm-dNK/L347P；或Dm-dNK/K352N(dNK编号).
在另一优选实施方式中本发明的酶变体是Bm-dNK/E91D；Bm-dNK/E91D/N134D；Bm-dNK/-100D；Bm-dNK/-100D/N134D；Bm-dNK/-100D/N134D/K347P；Bm-dNK/-100D/N134D/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/I102T；Bm-dNK/N114D；Bm-dNK/N114D/I217V/Y281H；Bm-dNK/N134D；Bm-dNK/N134S；Bm-dNK/N134S/L138S/M139L/K352N；Bm-dNK/L138S；Bm-dNK/M139L；Bm-dNK/M139V；Bm-dNK/M139V/K347P；Bm-dNK/V167A；Bm-dNK/V167A/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/V167A/Q321S；Bm-dNK/V167A/K347P；Bm-dNK/V167A/M171R/A207D，Bm-dNK/V167S/M171R/A207D，Bm-dNK/S168A；Bm-dNK/S168A/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/S168A/N220S；Bm-dNK/S168A/K347P；Bm-dNK/M171R/A207D；Bm-dNK/L199M；Bm-dNK/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/L199M/V214A/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/I199M/H216S/I217V/A229S/D316N；Bm-dNK/V214A；Bm-dNK/H216S；Bm-dNK/I217V；Bm-dNK/N220S；Bm-dNK/T222W；Bm-dNK/F228C；Bm-dNK/F228C/V277A/P309R；Bm-dNK/V277A；Bm-dNK/A229S；Bm-dNK/Y281H；Bm-dNK/P309R；Bm-dNK/D316N；Bm-dNK/Q321S；Bm-dNK/L334L；Bm-dNK/K347P；或Bm-dNK/K352N(dNK编号).
在另一个优选的实施方式中，本发明的酶变体是Xen-dNK/M51T；Xen-dNK/M51T/Q168A；Xen-dNK/G62A；Xen-dNK/G62A/V167A/E321S；Xen-dNK/100D；Xen-dNK/-100D/N134D；Xen-dNK/-100D/N134D/E318D；Xen-dNK/-100D/N134D/N216S/L217V；Xen-dNK/L102T；Xen-dNK/L102T/E318D；Xen-dNK/N114D；Xen-dNK/N114D/L217V/Y281H；Xen-dNK/N134D；Xen-dNK/N134S；Xen-dNK/N134S/L138S/M139L；Xen-dNK/L138S；Xen-dNK/M139L；Xen-dNK/M139V；Xen-dNK/M139V/E318D/；Xen-dNK/V167A；Xen-dNK/V167A/N216S/L217V；Xen-dNK/V167A/E318D；Xen-dNK/V167A/M171R/A207D，Xen-dNK/V167S/M171R/A207D，Xen-dNK/Q168A；Xen-dNK/Q168A/N216S/L217V；Xen-dNK/Q168A/E318D；Xen-dNK/M171R/A207D；Xen-dNK/V214A；Xen-dNK/V214A/N216S/L217V；Xen-dNK/N216S；Xen-dNK/N216S/L217V；Xen-dNK/N216S/L217V/A229S；Xen-dNK/L217V；Xen-dNK/K222W；Xen-dNK/Y228C；Xen-dNK/Y228C/I277A/P309R；Xen-dNK/A229S；Xen-dNK/I277A；Xen-dNK/Y281H；Xen-dNK/P309R；Xen-dNK/E318D；或Xen-dNK/E321S(dNK编号)杂种酶在一个特别优选的实施方式中，本发明的脱氧核糖核苷激酶变体可以是源自两个或更多昆虫多底物脱氧核糖核苷激酶的杂种脱氧核糖核苷激酶。
本发明杂种的脱氧核糖核苷激酶将包含至少5个，优选至少10个，更优选至少15个，更加优选至少20个，最优选至少25个源自每种昆虫多底物脱氧核糖核苷激酶的连续氨基酸。
在一个优选的实施方式中，该杂种激酶源自黑腹果蝇脱氧核糖核苷激酶，和/或家蚕脱氧核糖核苷激酶，和/或滑爪蟾脱氧核糖核苷激酶，和/或冈比亚按蚊脱氧核糖核苷激酶。
在一个更优选的实施方式中，本发明的杂种激酶源自黑腹果蝇脱氧核糖核苷激酶和家蚕脱氧核糖核苷激酶，并包括SEQ ID NO10的氨基酸序列，或者SEQ ID NO12的氨基酸序列。
重组载体本发明另一方面提供包含本发明的突变多核苷酸的重组载体按此处的定义，重组载体是一种表达载体或重组表达构建体，用于向目的细胞中导入多核苷酸。该表达载体可以是病毒载体或质粒载体，本发明的多核苷酸可以被正向或反向插入其中。该载体还可以是合成的基因。
合适的表达载体包括，但不限于真核载体，原核载体，如细菌线状或环状质粒，病毒载体，DNA-蛋白复合物，如DNA-单克隆抗体复合物，以及受体介导的载体。该载体尤其可以是包含在脂质体内。
优选的细菌载体包括pQE30，pQE70，pQE60，pQE-9(可获自Quigen)；pbs，pD10，phagescript，psiX174，pbluescript SK，pbsks，pNH8A，pNH16A，pNH18A，pNH46A(可获自Stratagene)，pGEX-2T，PKK223-3，pKK233-3，pDR540和pRIT5(可获自Pharmacia)；和pASK75(可获自Biometra)。
优选的真核载体包括pWLNEO，pSV2CAT，pOG44，pXT1，pSG(可获自Stratagene)；pSVK3，pBPV，pMSG，pSVL(可获自Phamacia)；和pTEJ-8[FEBS.Lett.1990 267 289-294]和pcDNA-3(可获自Invitrogen)。优选的酵母载体包括pYES2(可获自Invitrogen)。
优选的病毒载体包括单纯疱疹病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，痘病毒载体，细小病毒载体，杆状病毒载体和逆转录病毒载体。
但是，任何质粒或载体都可以使用，只要它们在生产宿主中可以复制和存活。
该表达载体还可以进一步含有与本发明的多核苷酸序列可操作性连接的调控序列。按此处的定义，术语“可操作性连接”是指可操作元件即基因和调控序列，是操作性地连接以实现所期望的表达。这种调节序列的一个实例是启动子。
在一个优选的实施方式中，本发明的载体包含与多核苷酸操作性连接的启动子。
调控元件可以选自任何期望的来源以及使用本领域标准技术例如Sambrook等所描述的技术而产生的载体[Sambrook等MolecularCloningA Laboratory Manual(分子克隆实验室手册)，Cold SpringHarbor Lab.，Cold Spring Harbor，NY 1989]。
在一个优选的实施方式中，该载体是病毒载体，特别是单纯疱疹病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体或者逆转录病毒载体。载体及其调控元件的选择当然依赖于表达的目的，本领域技术人员可以视情况决定。
本发明另一方面提供能够产生含有本发明病毒载体的感染性毒粒的包装细胞系。
宿主/生产细胞本发明的另一个方面提供一种经基因操作以使其含有本发明多核苷酸序列，和/或本发明的重组表达载体的生产细胞。本发明的细胞特别可以是被基因操作使本发明的多肽瞬时或稳定表达，过表达或者共表达。本领域公知产生瞬时以及稳定表达的方法。
本发明的多核苷酸可以被插入到表达载体中，例如质粒，病毒或其他表达载体，并且通过某种方式的连接与表达调控序列操作性连接，该连接方式使编码序列在表达调控序列相匹配的条件下可实现表达。合适的表达控制序列包括启动子，增强子，转录终止子，起始密码子，内含子的剪接信号以及终止密码子，都包含在本发明多核苷酸的正确阅读框架中，使得mRNA正确翻译。表达调控序列还可以包括额外的组份例如前导序列和融合伙伴序列。
启动子尤其可以是组成型或诱导型启动子。当在细菌系统中克隆时，可使用诱导型启动子如λ噬菌体pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac杂合启动子)。当在哺乳动物系统中克隆时，可使用来自哺乳动物细胞的启动子如泛素启动子，TK启动子，或金属硫蛋白启动子，或来自哺乳动物病毒的启动子，如逆转录病毒的长末端重复区，腺病毒晚期启动子或痘苗病毒7.5K启动子。还可以使用通过重组DNA或合成技术得到的启动子来转录本发明多核苷酸。
合适的表达载体典型地包含表达起点，启动子以及允许对转化细胞表型选择的特定基因，包括象T7-based表达载体的载体用来在细菌中表达[Rosenberg等，Gene(基因)1987 56 125]，pTEJ-8，pUbilZ，pcDNA-3和pMSXND表达载体在哺乳动物细胞中表达[Lee和Nathans，J.Biol.Chem.1988 263 3521]，来自杆状病毒载体在昆虫细胞中表达，以及卵母细胞表达载体PTLN[Lorenz D，Pusch M & Jentsch T JHeteromultimeric CLC chloride channels with novel properties；Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996 93 13362-13366]。
在一个优选实施方式中，本发明的细胞是真核细胞，如哺乳动物细胞，如人细胞，狗细胞，猴细胞，大鼠细胞或小鼠细胞，卵母细胞，或酵母细胞。本发明细胞可以不限制地是人胚胎肾(HEK)细胞，如HEK293细胞，BHK21细胞，中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，滑爪蟾卵母(XLO)细胞。在另一实施方式中，本发明的细胞是真菌细胞，如丝状真菌细胞。在另一优选实施方式中该细胞是昆虫细胞，最优选Sf9细胞。额外优选的本发明哺乳动物细胞是PC12，HiB5，RN33b细胞系和人神经祖细胞。最优选人细胞。
当本发明的细胞是真核细胞，引入本发明的异源多核苷酸尤其可通过感染(利用病毒载体)，转染(利用质粒载体)，使用磷酸钙沉淀，显微注射，电穿孔，脂质转染或者其他本领域公知的物理-化学方法来实施。
在一个更优选的实施方式中，本发明的分离多核苷酸序列，和/或本发明的重组表达载体被转染到哺乳动物宿主细胞，神经祖细胞，星形胶质细胞，T细胞，造血干细胞，未分化的细胞或者脑内皮细胞，其含有至少一个能够介导细胞无限增殖化和/或转化的DNA分子。
激活宿主细胞中内源基因可通过导入调控元件来实现，特别是通过导入能够有效转录编码本发明的酶变体的内源基因的启动子。
生产多肽的方法本发明另一方面提供生产本发明分离的酶变体的方法。在本发明的方法中，合适的生产细胞通过导入外源的多核苷酸进行基因改造以使酶变体能够表达，该细胞在允许产生该多肽的条件下培养，然后收集目的多肽。
本发明的多核苷酸可通过本领域公知的方法被引入到期望的生产或宿主细胞中，这些方法如Sambrook等人描述的[Sambrook等MolecularCloningA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Lab.，ColdSpring Harbor，NY 1989]。任何能够促进外源多核苷酸导入期望细胞的技术都可以使用，包括例如转导，转染，转化，感染等等。
本发明的多核苷酸还可以特别通过定点诱变，或者甚至随机诱变而得到。
本发明的多核苷酸可来自任何合适的来源。本发明的多核苷酸优选来自昆虫或低等脊椎动物。在一个更优选的实施方式中，本发明的多核苷酸来自或产生于任何公众可获得的cDNA文库。
在一个优选实施方式中，本发明的多核苷酸可使用PCR引物制备，该引物在实施例中描述并如SEQ ID NOS7-8和13-20所列。
本发明的分离多核苷酸可以通过本发明公知的技术制备，如在下列实施例中所描述的。
生物活性与多数已知的具有尽管部分重叠但不相同的底物特异性和效力的脱氧核糖核苷激酶相反，本发明的脱氧核糖核苷激酶变体相较于野生型酶显示对于不同的底物具有增强的相对效力。
在一个优选的实施方式中，“kcat/Km(底物)/kcat/Km(核苷类似物)”比率(即两边之间的比率，其中一边是至少一种天然底物的“kcat/Km”，另一边是至少一种核苷类似物的“kcat/Km”)至少被降低5倍，更优选10倍，最优选20倍。
按此处的定义，如果激酶变体对一种或多种底物的磷酸化活性比野生型(亲代)酶增长了不止1倍，则认为其提高了灵敏度。
在一个优选的实施方式中，不同的底物是核苷类似物。优选的核苷类似物包括阿昔洛韦(9-[2-羟基-乙氧基]-甲基-鸟嘌呤核苷)，布昔洛韦，泛昔洛韦，更昔洛韦(9-[2-羟基-1-(羟甲基)乙氧基甲基]-鸟嘌呤核苷)，喷昔洛韦，伐昔洛韦，三氟胸苷，AZT(3’-叠氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-双脱氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鸟嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脱氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-双脱氧尿苷，1-[2-脱氧-2-氟代-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脱氧尿苷)，氟达拉滨(2-氟代腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他滨(gencitabine)，2’，3’-双脱氧次黄嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-双脱氧胞苷(ddC)，2’，3’-双脱氧胸苷(ddT)，2’，3’-双脱氧腺苷(ddA)，2’，3’-双脱氧鸟苷(ddG)，2-氯-2’-脱氧腺苷(2CdA)，5-氟代脱氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脱氧尿苷)，FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脱氧-3’-硫杂胞苷(thiacytidine))，dFdC吉西他滨(2’，2’-双氟脱氧胞苷)，dFdG吉西他滨(2’，2’-双氟脱氧鸟苷)或者d4T(2’，3’双脱氢-3’-脱氧胸苷)。
近来出现了基因治疗，作为一种新的治疗手段来治疗各种癌症。另外，该方法可用于治疗病毒感染，还可以应用于移植技术。该项治疗的基础是激酶基因被导入靶细胞，在该细胞中该基因将被表达。被导入的激酶可以特异性激活本身无害的前体药物，该前体药物的激活形式是有毒的，将导致细胞死亡或者抑制病毒复制。
脱氧核苷类似物如AZT(齐多夫定，Retrovir)，ddC(扎西他滨，Hivid)或AraC(阿糖胞苷)被广泛用于治疗癌症以及病毒感染的患者。在靶细胞中，这些前体药物必须是可以代谢合成其三磷酸形式从而带有毒性并导致细胞死亡或抑制病毒复制。这个激活反应过程中的限速步骤是磷酸化为单磷酸核苷。但是，许多核苷类似物的磷酸化在靶细胞中通常是无效的，或者在非靶细胞中也非特异地发生。
这些药物的效力和选择性可使用编码本发明脱氧核糖核苷激酶变体的前体药物激活基因来大大提高。
这样，从一个方面来看，本发明提供使细胞对前体药物敏感的方法，该方法包括以下步骤(i)用本发明的编码促进所述前体药物转化为(细胞毒性)药物的酶的多核苷酸序列转染所述细胞；以及(ii)将所述前体药物递送至所述细胞；其中所述细胞对于所述(细胞毒性)药物比对于所述前体药物更加敏感。
在这个方面，一个优选的实施方式中，该前体药物是核苷类似物。在一个更优选的实施方式中，该核苷类似物是阿昔洛韦(9-[2-羟基-乙氧基]-甲基-鸟嘌呤核苷)，布昔洛韦，泛昔洛韦，更昔洛韦(9-[2-羟基-1-(羟甲基)乙氧基甲基]-鸟嘌呤核苷)，喷昔洛韦，伐昔洛韦，三氟胸苷，AZT(3’-叠氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-双脱氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鸟嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脱氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-双脱氧尿苷，1-[2-脱氧-2-氟代-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脱氧尿苷)，氟达拉滨(2-氟代腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他滨(gencitabine)，2’，3’-双脱氧次黄嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-双脱氧胞苷(ddC)，2’，3’-双脱氧胸苷(ddT)，2’，3’-双脱氧腺苷(ddA)，2’，3’-双脱氧鸟苷(ddG)，2-氯-2’-脱氧腺苷(2CdA)，5-氟代脱氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脱氧尿苷)，FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脱氧-3’-硫杂胞苷(thiacytidine))，dFdC吉西他滨(2’，2’-双氟脱氧胞苷)，dFdG(2’，2’-双氟脱氧鸟苷)或者d4T(2’，3’双脱氢-3’-脱氧胸苷)。
从另一个方面来看，本发明提供对抗患者体内病原体的手段和方法，该患者可能特别是包括人类在内的恒温动物。
在一个优选的实施方式中，本发明提供一种抑制恒温动物中病原体的方法，该方法包括对所述动物施用本发明的多核苷酸序列或者本发明的载体。
在一个更优选的实施方式中，该多核苷酸序列或所述载体是体内给药。
在另一优选的实施方式中，该病原体是病毒，细菌或寄生虫。
在另一优选的实施方式中，该病原体是肿瘤细胞或自身反应的免疫细胞。
本发明已知恒温动物中病原体的方法还进一步包括向所述恒温动物施用核苷类似物的步骤。
在一个优选的实施方式中，该核苷类似物是阿昔洛韦(9-[2-羟基-乙氧基]-甲基-鸟嘌呤核苷)，布昔洛韦，泛昔洛韦，更昔洛韦(9-[2-羟基-1-(羟甲基)乙氧基甲基]-鸟嘌呤核苷)，喷昔洛韦，伐昔洛韦，三氟胸苷，AZT(3’-叠氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-双脱氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鸟嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脱氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-双脱氧尿苷，1-[2-脱氧-2-氟代-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脱氧尿苷)，氟达拉滨(2-氟代腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他滨(gencitabine)，2’，3’-双脱氧次黄嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-双脱氧胞苷(ddC)，2’，3’-双脱氧胸苷(ddT)，2’，3’-双脱氧腺苷(ddA)，2’，3’-双脱氧鸟苷(ddG)，2-氯-2’-脱氧腺苷(2CdA)，5-氟代脱氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脱氧尿苷)，FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脱氧-3’-硫杂胞苷(thiacytidine))，dFdC吉西他滨(2’，2’-双氟脱氧胞苷)，dFdG(2’，2’-双氟脱氧鸟苷)或者d4T(2’，3’-双脱氢-3’-脱氧胸苷)。
药物组合物本发明另一方面提供新的药物组合物，该药物组合物包含有效治疗量的本发明酶变体。
为用于治疗，本发明的酶变体可以通过任何方便形式给药。在一个优选的实施方式中，本发明的酶变体与一种或多种辅剂，赋形剂，载体和/或稀释剂一起被并入药物组合物中，并且该药物组合物是通过本领域技术人员公知的传统方法制备的。
这种药物组合物可以包含本发明的酶变体，或其抗体。该组合物可以单独给药或者与一种或几种其他物质，药物或激素结合给药。
本发明的药物组合物可通过任何合适的途径给药，包括但不限于口服，静脉内，肌肉内，动脉内，骨髓内，鞘内，心室内，经皮，皮下，腹膜内，鼻内，anteral，局部，舌下或直肠给药，颊，阴道，眼眶内，大脑内，颅内，脊柱内，心室内，脑池内，囊内，肺内的，粘膜内或者通过吸入。
进一步的制剂和给药方法细节可参考最新版的Remington’sPharmaceutical Sciences(Maack Publishing Co.，Eston，PA)。
活性成份可以每天一剂或几剂给药。目前预期的合适剂量是每次给药介于0.5ng酶变体/kg体重到约50μg/kg之间，每天剂量约1.0ng/kg到约100μg/kg。
当然给药剂量必须谨慎调节，视被治疗个体的年龄，体重和症状，以及给药途径，剂量形式和方式，所期望的结果而定，精确的剂量当然需要专业人员来测定。
在进一步的实施方式中，本发明的酶变体可通过使用在“治疗方法”中描述的细胞系和载体进行基因传递给药。为产生这样的治疗细胞系，本发明的多核苷酸可被插入到表达载体中如质粒，病毒或其他表达载体，并以某种方式操作性连接到表达调控序列，该方式使编码序列的表达在与表达调控序列相匹配的条件下得以实现。合适的表达调控序列包括启动子，增强子，转录终止子，起始密码子，内含子拼接信号，终止密码子，它们都包括在本发明的多核苷酸的正确阅读框中，以使mRNA能够正确翻译。表达调控序列还可以包括其它的组份如前导序列和融合伙伴序列。
治疗方法涉及多核苷酸和蛋白，多肽，多肽片段或其产生的衍生物，以及这种蛋白，多肽或衍生物的抗体的本发明，可以用于治疗或缓解活动物体包括人类的紊乱或疾病，其中该紊乱或疾病对细胞毒性物质的活性起反应。
紊乱，疾病或病症尤其可以是癌症或病毒感染。
本发明的酶变体可通过例如注射，植入或摄取的药物组合物直接使用来治疗对该酶变体起反应的病理过程。
本发明的多核苷酸，包括其互补的序列，可用于本发明酶变体的表达。这可通过表达这种蛋白，多肽或衍生物的本发明的细胞系来实现，或者通过编码这种蛋白，多肽或衍生物的本发明病毒载体来实现，或者通过表达这种蛋白，多肽或衍生物的宿主细胞来实现。可施用这些细胞，载体和组合物处理靶区域来影响跟细胞毒性物质起反应的疾病过程。
合适的表达载体可以来自慢病毒，逆转录病毒，腺病毒，疱疹或痘苗病毒，或者来自各种细菌产生的质粒，并可用于体内递送核苷酸序列到整个有机体或靶器官，组织或细胞群。其他方法包括但不限于脂质体转染，电穿孔，用含有核酸或其他定位信号的载体多肽转染，以及通过缓释系统的基因递送。本发明的另一方面，互补于本发明的核苷酸或其部分的“反义”核苷酸序列可用于抑制或提高酶变体表达。
本发明的另一方面涉及治疗或缓解活动物体包括人类紊乱，疾病或病症的方法，该紊乱或疾病对细胞毒性物质的活性起反应。
实施例1PCR诱导的Dm-dNK变体采用基于诱变PCR的定向进化方法，来产生突变激酶形式。Dm-dNK的开放阅读框架(ORF)通过不同的核苷酸类似物浓度诱变处理并研究不同核苷酸类似物浓度的作用。诱变的PCR片段被连接到表达质粒中，然后被转化到TK缺陷的大肠杆菌KY895菌株中。
随机突变和突变文库的构建表达载体pGEX-2T-rDm-dNK[Munch-Petersen等，J.Biol. Chem.2000 275(9)6673-6679]被用作PCR诱变的模板。
Dm-dNK的开放阅读框(ORF)使用下述引物扩增Dm-TK35’-CGCGGATCCATGGCGGAGGCAGCATCCT-3’(SEQ ID NO7)；和Dm-TK45’-CGGAATTCTTATCTGGCGACCCTCTGGCGT-3’(SEQ IDNO8)。
PCR分两步进行。首先PCR在20μl反应物中于提供的缓冲液内与0.15单位的来自Amersham Corp.的Taq聚合酶反应。使用10fmol模板DNA，20pmol每种引物，0.2mM每种dNTP。核苷酸类似物6-(2-脱氧-β-赤型戊呋喃糖基)-3，4-二氢-8H-嘧啶并-[4，5C][1，2]噁嗪-7-酮-5’-三磷酸(dPTP)和2’-脱氧-8-羟基鸟苷-5’-三磷酸(8-oxo-dGTP)(均可获自Amersham Corp)以如
图1中所示浓度存在。
PCR条件是在94℃变性5分钟，然后94℃ 45秒，50℃ 45秒，72℃ 2分钟，如此循环25次，最后在72℃延长10分钟。
PCR产物用获自Boehringer Mannhein的PCR纯化试剂盒进行纯化，并在80μl pH7.5的5mM Tris/HCl中稀释。将40μl该稀释液用于没有核苷酸类似物的第二次PCR，该PCR与0.5单位Taq聚合酶，65pmol每种引物，0.2mM每种dNTP一起，在65μl的体积内进行。PCR条件与第一次的PCR相同，但只循环15次。
诱变的PCR片段用获自Boehringer Mannhein的PCR纯化试剂盒进行纯化，用BamHI和EcoRI切割，并亚克隆到pGEX-2T质粒载体的多克隆位点。TK缺陷的大肠杆菌KY895菌株[F-tdk-1 ilv][Igarashi K，Hiraga S和Yura TA deoxythymidine kinase deficient mutant ofEschericha coli.II.Mapping and transduction studies with phageΦ80；Genetics(遗传学)1967 57 643-654]，与连接混合物一起，使用标准技术进行电转染，并在LB-氨苄青霉素(100μg/ml)平板上涂平板。
通过随机选取菌落的菌落PCR来测定携带有再成环载体的相对菌落数。
诱变的程度研究不同核苷酸类似物浓度在诱变PCR中的作用。通过TK活性的减少来评价诱变的程度。这可通过将至少500个LB-氨苄青霉素平板上的菌落复制涂布到TK选择平板上[Black ME，Newcomb T G，WilsonHMP和Loeb L ACreation of drug-specific herpes simplex virustype 1 thymidine kinase mutants for gene therapy；Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996 93 3525-3529]并计数在TK选择平板上存活的菌落数来实现。结果以再成环载体校正。
突变体的选择首先，通过在TK选择平板上复制涂布那些菌落而选择出恢复了TK活性的菌落[Black M E，Newcomb T G，Wilson H M P和Loeb LACreation of drug-specific herpes simplex virus type 1thymidine kinase mutants for gene therapy；Proc.Natl.Acad.Sci.USA1996 93 3525-3529]。只有与TK阴性大肠杆菌KY895菌株互补的突变株才能在该选择培养基上产生菌落。
这些菌落的过夜培养物用10％甘油稀释200倍，并将2μl的稀释液涂布在M9基本培养基平板上[Ausubel F，Brent R，Kingston R E，Moore D D，Seidman J G，Smith J A和Struchl K(编著)Shortprotocols in molecular biology；Wiley，USA，第3版，1995，1-2页]，该平板中补充有0.2％葡萄糖，40μg/ml异亮氨酸，40μg/ml缬氨酸，100μg/ml氨苄青霉素并且存在或不存在核苷类似物。
为最初的筛选，将200μl 2.5mM AraC，500μM AZT，500μM ddA或25mM ddC均匀地涂布在10ml固化的培养基表面，该培养基装在8.5cm直径的平板内。37℃ 24小时后可以肉眼观察到菌落的生长。从在含有核苷类似物平板上不生长而在不含有核苷类似物的平板上正常生长的菌落中，分离出质粒并再转化到KY895中。这些菌落经过再测试来核实质粒引起的表型。
实施例2酶变体的表征测序使用Thermo Sequenase radio-labelled terminator循环测序试剂盒和P33标记的ddNTPs(Amersham Corp.)通过Sanger双脱氧法人工操作对纯化的质粒进行测序。
测定LD100(体内表征)为测定核苷类似物致死剂量(LD100)(在该致死剂量，细菌没有生长)，对数稀释核苷类似物，在M9平板上测定所有对至少一种核苷类似物提高了灵敏度的克隆。浓度范围为10-1000μM AraA，3.16-1000μM AraC；0.01-100μM AZT；0.316-31.6μM ddA；0.0316-100μM 2CdA或10-3500μM ddC的平板用于测定假定的突变体的LD100(能够导致100％死亡的浓度)。
在倒平板之前在可能的最低温度混合培养基和类似物来制备平板。
这些测定的结果如下面表2所示。
表2LD100
蛋白表达和纯化(体外表征)在大肠杆菌BL21菌株(Pharmecia Biotech，瑞典)中得到的表达高于KY895细胞。如Munch-Petersen等人所描述，表达和纯化凝血酶切割的重组野生型Dm-dNK或突变MuD[J.Biol.Chem.2000 275(9)6673-6679]。纯化的蛋白命名为rDm-dNK或rMuD。
酶分析使用氚标记的底物进行DE-81滤纸分析，通过基于4个时间样品的起始速率的测量来测定核苷激酶活性。可供选择地，ADP的产量可通过分光光度法进行测定。这两种方法可如Munch-Petersen等人所描述实施[J.Biol.Chem.2000 275(9)6673-6679]。
动力学数据的分析按Knecht等人的描述，使用Michaelis-Menten等式v＝Vmax×[S]/(Km+[S])，通过非线性回归分析，评价动力学数据[KnechtW，Bergjohann U，Gonski S，Kirschbaum B，Loffler MFunctionalexpression of a fragment of human dihydroototate dehydrogenaseby means of the baculovirus expression vector system，andkinetic investigation of the purified recombinant enzyme；Eur.J.Biolchem.1996 240(1)292-301]。
将在各种抑制剂浓度[I]存在下的反应速率代入等式v1＝V0/(1+[I]/IC50)，从而测定出对酶活性达到50％抑制的浓度(IC50)。v1和v0分别是在抑制剂存在或不存在下的速率。
为鉴定抑制的类型，在3种不同的抑制剂浓度下测定Vmax和Km值。相较于非抑制性酶反应的常数，Vmax和Km值的偏差被认为用来测定抑制是竞争性，反竞争性还是非竞争性的。
一旦建立了一种抑制模式，以非竞争性抑制的不变等式v＝Vmax×[S]/{Km×(1+[I]/Kic)+(1+[I]/Kiu)×[S]}拟合整个数据组。Kic是竞争性抑制常数，Kiu是反竞争性抑制常数[Liebecg CIUBMB Biochemicalmonenclature and related documents；Portland Press，London，1992]。
实施例3
序列测定在National Institute for Biotechnology information的GenBank数据库中，用the basic local alignment search tool(BLAST)搜索公众可利用的表达序列标记(EST)文库，鉴定编码类似于Dm-dNK的酶(GenBanK ACCN AF226281)的ESTs。通过这种方法，鉴定出了来自家蚕的ESTs ACCN AU004911和来自滑爪蟾的ACCN AW159435。
ESTs获自基因组研究组(Genome Research Group)，NationalInstitute of Radiological Sciences，Anagawa 4-9-1，Inage，Chiba 263-8555，日本(ACCN AU004911)和Lita Annenberg HazenGenome Sequencing Center，Cold Spring Harbor Laboratory，PO Box100，Cold Spring Harbor，NY 11724，USA(AW159435)。通过DNA序列测定测定这两个ESTs编码的脱氧核糖核苷激酶的完整开放阅读框(见实施例2)。
然后将完整开放阅读框提交到GenBank并被分配编号ACCNAF226281(家蚕脱氧核糖核苷激酶，如SEQ ID NO3所示)和ACCNAF250861(滑爪蟾脱氧核糖核苷激酶，如SEQ ID NO5所示)。
实施例4杂种酶本实施例说明了在表达载体pGEX-2T中构建杂种酶(分别是pGEX-2T-rdmk/bmk和pGEX-2T-rbmk/dmk)。
表达质粒pGEX-2T-rBm-dNK基本上Munch-Petersen等人构建pGEX-2T-rDm-dNK的描述[J.Biol.Chem.2000 275(9)6673-6679]，使用引物Bmfor1和Bmrev1，以家蚕激酶的cDNA(如实施例3所述制备)作为模板来构建。
进行下述第一次PCR
PCR条件94℃变性5分钟；然后94℃ 1分钟，50℃ 1分钟，72℃ 1分钟，如此进行30个循环；最后72℃延长10分钟。
从所有4个PCR中得到的片段通过获自Boenringer Mannheim的PCR Purification Kit进行纯化。
然后进行下面的第二次PCR
PCR条件94℃变性5分钟；然后94℃ 1分钟，45℃ 5分钟，72℃ 1分钟，如此进行30个循环；最后72℃延长10分钟。
所获的片段被切割，纯化并亚克隆到按实施例1所述制备的表达载体中。
引物Dm-TK3(SEQ ID NO7)；Dm-TK4(SEQ ID NO8)；pGEX-2Tfor5’-acg ttt ggt ggt ggc gac ca-3’(SEQ ID NO13)；pGEX-2Trev5’-ctc cgg gag ctg cat gtg tc-3’(SEQ ID NO14)；bmk-Nterm5’-cta aaa atg gag cgc tcc att agc ttt act gga gtt gg-3’(SEQ ID NO15)；dmk-Cterm5’-cca gta aag cta atg gag cgc tcc att ttt agc gc-3’(SEQ ID NO16)；dmk-Nterm5’-gaa taa tga tcg ctc cat tat ttt tag ctt ctt gt-3’(SEQ ID NO17)；bmk-Cterm5’-aag cta aaa ata atg gag cga tca tta ttc agt gc-3’(SEQ ID NO18)；Bmfor15’-tat cgc gga tcc atg agt gcc aac aat gtt aaa cca ttc acc-3’(SEQ ID NO19)；和Bmrev15’-ccg gaa ttc gtc gac tta taa gat cct cat gtg agg tgt gat ctt g-3’(SEQ ID NO20).
序列表<160>20<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>750<212>DNA<213>黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)<220><221>CDS<222>(1)..(750)<400>1atg gcg gag gca gca tcc tgt gcc cga aag ggg acc aag tac gcc gag48Met Ala Glu Ala Ala Ser Cys Ala Arg Lys Gly Thr Lys Tyr Ala Glu1 5 10 15ggc acc cag ccc ttc acc gtc ctc atc gag ggc aac atc ggc agc ggg96Gly Thr Gln Pro Phe Thr Val Leu Ile Glu Gly Asn Ile Gly Ser Gly20 25 30aag acc acg tat ttg aac cac ttc gag aag tac aag aac gac att tgc144Lys Thr Thr Tyr Leu Asn His Phe Glu Lys Tyr Lys Asn Asp Ile Cys35 40 45ctg ctg acc gag ccc gtc gag aag tgg cgc aac gtc aac ggg gta aat192Leu Leu Thr Glu Pro Val Glu Lys Trp Arg Asn Val Asn Gly Val Asn50 55 60ctg ctg gag ctg atg tac aaa gat ccc aag aag tgg gcc atg ccc ttt240Leu Leu Glu Leu Met Tyr Lys Asp Pro Lys Lys Trp Ala Met Pro Phe65 70 75 80cag agt tat gtc acg ctg acc atg ctg cag tcg cac acc gcc cca acc288Gln Ser Tyr Val Thr Leu Thr Met Leu Gln Ser His Thr Ala Pro Thr85 90 95aac aag aag cta aaa ata atg gag cgc tcc att ttt agc gct 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1.分离的编码多底物脱氧核糖核苷激酶的突变多核苷酸，该突变多核苷酸与未突变的多核苷酸相比，在转化到细菌或真核细胞中之后，使至少一种核苷类似物的致死剂量(LD100)降低至少4倍。
2.权利要求1的突变多核苷酸，其中所述的核苷类似物是阿昔洛韦(9-[2-羟基-乙氧基]-甲基-鸟嘌呤核苷)，布昔洛韦，泛昔洛韦，更昔洛韦(9-[2-羟基-1-(羟甲基)乙氧基甲基]-鸟嘌呤核苷)，喷昔洛韦，伐昔洛韦，三氟胸苷，AZT(3’-叠氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-双脱氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鸟嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脱氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-双脱氧尿苷，1-[2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脱氧尿苷)，氟达拉滨(2-氟腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他滨(gencitabine)，2’，3’-双脱氧次黄嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-双脱氧胞苷(ddC)，2’，3’-双脱氧胸苷(ddT)，2’，3’-双脱氧腺苷(ddA)，2’，3’-双脱氧鸟苷(ddG)，2-氯-2’-脱氧腺苷(2CdA)，5-氟脱氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脱氧尿苷)，FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脱氧-3’-硫杂胞苷)，dFdC吉西他滨(2’，2’-双氟脱氧胞苷)，dFdG(2’，2’-双氟脱氧鸟苷)或者d4T(2’，3’双脱氢-3’-脱氧胸苷)。
3.权利要求1的突变多核苷酸，其中该突变多核苷酸使至少两种不同的核苷类似物的致死剂量(LD100)降低了至少4倍，该核苷类似物类似性基于两种不同的糖部分和两种不同的碱基部分。
4.权利要求1-3的多核苷酸所编码的分离的脱氧核糖核苷激酶变体。
5.权利要求4的酶变体，其中该变体与野生型酶相比在下列方面被改变(i)“kcat/Km(底物)/kcat/Km(核苷类似物)”比率至少被降低5倍；和/或(ii)如使用2或10μM胸苷(dThd)作为底物测定的，NTP和dNTPs，尤其是TTP的反馈抑制被降低了至少1.5倍。
6.权利要求4的酶变体，其使至少两种不同的核苷类似物的致死剂量(LD100)降低至少4倍，该核苷类似物的类似性基于两种不同的糖部分和两种不同的碱基部分。
7.权利要求4的酶变体，该变体与野生型酶相比，在下述位置是突变的(i)在非基序和/或非保守区域；和/或(ii)仅在一个基序和/或保守区域；和/或(iii)在任何保守的位置；该区域和位置在表1中定义。
8.权利要求4的酶变体，该变体在下述的一个或多个位置上包含突变(包括替换，增加和缺失)位置51，62，82，91，100，102，107，112，114，134，138，139，140，164，167，168，171，199，202，207，211，213，214，216，217，220，222，228，229，274，277，281，283，284，307，309，316，318，321，334，347，和352(dNK编号)。
9.权利要求6的酶变体，该变体包含相对于G80，N81，I82，G83，S84，G85，K86，T87，T88，E107，P108，V109，E110，K111，W112，Y140，Q164，E201，R202，S203，C210，Y211，C212，P258，R265，I266，R267，Q268，R269，A270，R271，E274，L279，L282，或者L293保守的替换(dNK编号)。
10.权利要求6的酶变体，该变体包含一个或多个下述的突变M51T；T62A；N91D；N100D；I102T；N114D；N134D；N134S；L138S；M139L；M139V；V167A；V167S；V167M；T168A；M171R；I199M；A207D；V214A；N216S；M217V；N220S；S222W；Y228C；N229S；V277A；Y281H；S307P；K309R；D316N；N318D；N321S；F334L；L347P；和K352N(dNK编号)。
11.权利要求8的酶变体，该变体包含M51T/T168A/N220S；T62A/V167A/N321S；N91D/N134D；N100D/N134D；N100D/N134D/N318D/L347P；N100D/N134D/I199M/N216S/M217V/D316N；I102T/N318D；N114D/M217V/Y281H；N134S/L138S/M139L/K352N；M139V/N318D/L347P；V167A/M171R/A207D；V167S/M171R/A207D；V167A/I199M/N216S/M217V/D316N；V167A/N318D/L347P；T168A/N318D/L347P；T168A/I199M/N216S/M217V/D316N；M171R/A207D；I199M/V214A/N216S/M217V/D316N；I199M/N216S/M217V/N229S/S307P/D316N；I199M/N216S/M217V/D316N；S222W/F334L；Y228C/V277A/K309R；或N318D/L347P(dNK编号)。
12.权利要求3-9任一项的酶变体，该变体来自多底物脱氧核糖核苷激酶。
13.权利要求3-9任一项的酶变体，该变体是来自人胸苷激酶2(hu-TK2)、或人脱氧鸟苷激酶(hu-dGK)、或人脱氧胞苷激酶(hu-dCK)、或单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSV1-TK)的脱氧核糖核苷激酶。
14.权利要求3-9任一项的酶变体，该变体来自昆虫多底物脱氧核糖核苷激酶。
15.权利要求14的酶变体，其为来自两种或更多种昆虫多底物脱氧核糖核苷激酶的杂种脱氧核糖核苷激酶。
16.权利要求15的酶变体，该杂种脱氧核糖核苷激酶含有至少5个来自每种昆虫多底物脱氧核糖核苷激酶的连续氨基酸。
17.权利要求14的酶变体，该变体是来自黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)脱氧核糖核苷激酶(Dm-dNK)，或家蚕(Bombyx mori)脱氧核糖核苷激酶(Bm-dNK)，或滑爪蟾(Xenopus laevis)脱氧核糖核苷激酶(Xen-dNK)或冈比亚按蚊(Anopheles gambia)脱氧核糖核苷激酶的脱氧核糖核苷激酶。
18.权利要求17的酶变体，其为Dm-dNK/M51T；Dm-dNK/M51T/T168A/N220S；Dm-dNK/T62A；Dm-dNK/T62A/V167A/N321S；Dm-dNK/N91D；Dm-dNK/N91D/N134D；Dm-dNK/N100D；Dm-dNK/N100D/N134D；Dm-dNK/N100D/N134D/N318D/L347P；Dm-dNK/N100D/N134D/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/I102T；Dm-dNK/I102T/N318D；Dm-dNK/N114D；Dm-dNK/N114D/M217V/Y281H；Dm-dNK/N134D；Dm-dNK/N134S；Dm-dNK/N134S/L138S/M139L/K352N；Dm-dNK/L138S；Dm-dNK/M139L；Dm-dNK/M139V；Dm-dNK/M139V/N318D/L347P；Dm-dNK/V167A；Dm-dNK/V167A/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/V167A/N318D/L347P；Dm-dNK/V167A/M171R/A207D；Dm-dNK/V167S/M171R/A207D；Dm-dNK/T168A；Dm-dNK/T168A/N318D/L347P；Dm-dNK/T168A/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/M171R/A207D；Dm-dNK/I199M；Dm-dNK/I199M/V214A/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/I199M/N216S/M217V/D316N；Dm-dNK/I199M/N216S/M217V/N229S/S307P/D316N；Dm-dNK/V214A；Dm-dNK/N216S；Dm-dNK/M217V；Dm-dNK/N220S；Dm-dNK/S222W；Dm-dNK/S222W/F334L；Dm-dNK/Y228C；Dm-dNK/Y228C/V277A/K309R；Dm-dNK/N229S；Dm-dNK/V277A；Dm-dNK/Y281H；Dm-dNK/S307P；Dm-dNK/K309R；Dm-dNK/D316N；Dm-dNK/N318D；Dm-dNK/N318D/L347P；Dm-dNK/N321S；Dm-dNK/F334L；Dm-dNK/L347P；或Dm-dNK/K352N(dNK编号)。
19.权利要求17的酶变体，其为Bm-dNK/E91D；Bm-dNK/E91D/N134D；Bm-dNK/-100D；Bm-dNK/-100D/N134D；Bm-dNK/-100D/N134D/K347P；Bm-dNK/-100D/N134D/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/I102T；Bm-dNK/N114D；Bm-dNK/N114D/I217V/Y281H；Bm-dNK/N134D；Bm-dNK/N134S；Bm-dNK/N134S/L138S/M139L/K352N；Bm-dNK/L138S；Bm-dNK/M139L；Bm-dNK/M139V；Bm-dNK/M139V/K347P；Bm-dNK/V167A；Bm-dNK/V167A/M171R/A207D；Bm-dNK/V167S/M171R/A207D；Bm-dNK/V167A/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/V167A/Q321S；Bm-dNK/V167A/K347P；Bm-dNK/S168A；Bm-dNK/S168A/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/S168A/N220S；Bm-dNK/S168A/K347P；Bm-dNK/L199M；Bm-dNK/L199M/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/L199M/V214A/H216S/I217V/D316N；Bm-dNK/I199M/H216S/I217V/A229S/D316N；Bm-dNK/M171R/A207D；Bm-dNK/V214A；Bm-dNK/H216S；Bm-dNK/I217V；Bm-dNK/N220S；Bm-dNK/T222W；Bm-dNK/F228C；Bm-dNK/F228C/V277A/P309R；Bm-dNK/V277A；Bm-dNK/A229S；Bm-dNK/Y281H；Bm-dNK/P309R；Bm-dNK/D316N；Bm-dNK/Q321S；Bm-dNK/L334L；Bm-dNK/K347P；或Bm-dNK/K352N(dNK编号)。
20.权利要求17的酶变体，其为Xen-dNK/M51T；Xen-dNK/M51T/Q168A；Xen-dNK/G62A；Xen-dNK/G62A/V167A/E321S；Xen-dNK/-100D；Xen-dNK/-100D/N134D；Xen-dNK/-100D/N134D/E318D；Xen-dNK/-100D/N134D/N216S/L217V；Xen-dNK/L102T；Xen-dNK/L102T/E318D；Xen-dNK/N114D；Xen-dNK/N114D/L217V/Y281H；Xen-dNK/N134D；Xen-dNK/N134S；Xen-dNK/N134S/L138S/M139L；Xen-dNK/L138S；Xen-dNK/M139L；Xen-dNK/M139V；Xen-dNK/M139V/E318D/；Xen-dNK/V167A；Xen-dNK/V167A/M171R/A207D；Xen-dNK/V167S/M171R/A207D；Xen-dNK/V167A/N216S/L217V；Xen-dNK/V167A/E318D；Xen-dNK/Q168A；Xen-dNK/Q168A/N216S/L217V；Xen-dNK/Q168A/E318D；Xen-dNK/M171R/A207D；Xen-dNK/V214A；Xen-dNK/V214A/N216S/L217V；Xen-dNK/N216S；Xen-dNK/N216S/L217V；Xen-dNK/N216S/L217V/A229S；Xen-dNK/L217V；Xen-dNK/K222W；Xen-dNK/Y228C；Xen-dNK/Y228C/I277A/P309R；Xen-dNK/A229S；Xen-dNK/I277A；Xen-dNK/Y281H；Xen-dNK/P309R；Xen-dNK/E318D；或Xen-dNK/E321S(dNK编号)。
21.权利要求16的酶变体，其是来自黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)脱氧核糖核苷激酶，和/或家蚕(Bombyx mori)脱氧核糖核苷激酶，和/或滑爪蟾(Xenopus laevis)脱氧核糖核苷激酶，和/或冈比亚按蚊(Anopheles gambia)脱氧核糖核苷激酶的杂种酶。
22.权利要求21的酶变体，其来自黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)脱氧核糖核苷激酶和家蚕(Bombyx mori)脱氧核糖核苷激酶，并含有SEQ ID NO10所示的氨基酸序列。
23.权利要求21的酶变体，其来自黑腹果蝇(Drosophilamelanogaster)脱氧核糖核苷激酶和家蚕(Bombyx mori)脱氧核糖核苷激酶，并含有SEQ ID NO12所示的氨基酸序列。
24.含有权利要求1-3任一项的多核苷酸的载体构建体。
25.权利要求24的载体，其为病毒载体，特别是单纯疱疹病毒载体，腺病毒载体，腺病毒相关病毒载体，或者逆转录病毒载体。
26.能够产生含有权利要求25的载体的感染性毒粒的包装细胞系。
27.携带权利要求1-3任一项的突变多核苷酸，或者权利要求24-25任一项的载体的宿主细胞。
28.权利要求27的细胞，其为人细胞，狗细胞，猴细胞，大鼠细胞或小鼠细胞。
29.使细胞对前体药物敏感的方法，该方法包括下述步骤(i)用编码能够促进所述前体药物转化为(细胞毒性的)药物的酶的权利要求1-3任一项的多核苷酸序列转染所述细胞；以及(ii)将所述前体药物递送到所述细胞；其中所述细胞对所述(细胞毒性的)药物比对所述前体药物更敏感。
30.权利要求29的方法，其中前体药物是核苷类似物。
31.权利要求30的方法，其中核苷类似物为阿昔洛韦(9-[2-羟基-乙氧基]-甲基-鸟嘌呤核苷)，布昔洛韦，泛昔洛韦，更昔洛韦(9-[2-羟基-1-(羟甲基)乙氧基甲基]-鸟嘌呤核苷)，喷昔洛韦，伐昔洛韦，三氟胸苷，AZT(3’-叠氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-双脱氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鸟嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脱氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-双脱氧尿苷，1-[2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脱氧尿苷)，氟达拉滨(2-氟腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他滨(gencitabine)，2’，3’-双脱氧次黄嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-双脱氧胞苷(ddC)，2’，3’-双脱氧胸苷(ddT)，2’，3’-双脱氧腺苷(ddA)，2’，3’-双脱氧鸟苷(ddG)，2-氯-2’-脱氧腺苷(2CdA)，5-氟脱氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脱氧尿苷)，FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脱氧-3’-硫杂胞苷)，dFdC吉西他滨(2’，2’-双氟脱氧胞苷)，dFdG(2’，2’-双氟脱氧鸟苷)或者d4T(2’，3’双脱氢-3’-脱氧胸苷)。
32.抑制恒温动物中病原体的方法，该方法包括对所述动物施用权利要求1-3任一项的突变多核苷酸，或者权利要求24-25任一项的载体。
33.权利要求32的方法，其中所述多核苷酸序列或所述载体体内给药。
34.权利要求32-33任一项的方法，其中所述病原体是病毒，细菌或寄生虫。
35.权利要求32-33任一项的方法，其中所述病原体是肿瘤细胞。
36.权利要求32-33任一项的方法，其中所述病原体是自身反应的免疫细胞。
37.权利要求31-35任一项的方法，其进一步包括对所述恒温动物施用核苷类似物的步骤。
38.权利要求37的方法，其中所述核苷类似物是阿昔洛韦(9-[2-羟基-乙氧基]-甲基-鸟嘌呤核苷)，布昔洛韦，泛昔洛韦，更昔洛韦(9-[2-羟基-1-(羟甲基)乙氧基甲基]-鸟嘌呤核苷)，喷昔洛韦，伐昔洛韦，三氟胸苷，AZT(3’-叠氮-3’-胸苷)，AIU(5’-碘-5’-氨基-2’，5’-双脱氧尿苷)，ara-A(腺苷-阿拉伯糖苷；Vivarabine)，ara-C(胞苷-阿拉伯糖苷)，ara-G(9-β-D-阿拉伯呋喃糖基鸟嘌呤)，ara-T，1-β-D-阿拉伯呋喃糖基胸腺嘧啶，5-乙基-2’-脱氧尿苷，5-碘-5’-氨基-2，5’-双脱氧尿苷，1-[2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基]-5-碘尿嘧啶，碘苷(5-碘-2’脱氧尿苷)，氟达拉滨(2-氟腺嘌呤9-β-D-阿拉伯呋喃糖苷)，吉西他滨(gencitabine)，2’，3’-双脱氧次黄嘌呤核苷(ddI)，2’，3’-双脱氧胞苷(ddC)，2’，3’-双脱氧胸苷(ddT)，2’，3’-双脱氧腺苷(ddA)，2’，3’-双脱氧鸟苷(ddG)，2-氯-2’-脱氧腺苷(2CdA)，5-氟脱氧尿苷，BVaraU((E)-5-(2-溴乙烯基)-1-β-D-阿拉伯呋喃糖基尿嘧啶)，BVDU(5-溴乙烯基-脱氧尿苷)，FIAU(1-(2-脱氧-2-氟-β-D-阿拉伯呋喃糖基)-5-碘尿嘧啶)，3TC(2’-脱氧-3’-硫杂胞苷)，dFdC吉西他滨(2’，2’-双氟脱氧胞苷)，dFdG(2’，2’-双氟脱氧鸟苷)或者d4T(2’，3’双脱氢-3’-脱氧胸苷)。
39.含有权利要求1-3任一项的突变多核苷酸，或权利要求24-25任一项的载体的药物组合物。
40.含有权利要求4-23任一项的酶变体和药学上可接受的载体或稀释剂的药物组合物。
全文摘要
本发明涉及新型多底物脱氧核糖核苷激酶变体。更具体地，本发明提供来自昆虫或低等脊椎动物特别是来自黑腹果蝇，家蚕，或滑爪蟾的新型脱氧核糖核苷激酶变体，编码多底物核苷激酶变体的新型多核苷酸，含有该多核苷酸的载体构建体，带有该多核苷酸或载体的宿主细胞，使细胞对前体药物敏感的方法，抑制恒温动物中病原体的方法，以及含有本发明脱氧核糖核苷激酶变体的药物组合物。
文档编号A61P33/00GK1429268SQ01809319
公开日2003年7月9日 申请日期2001年5月7日 优先权日2000年5月12日
发明者沃尔夫冈·肯特, 比吉特·芒克－彼得森, 尤雷·皮斯克 申请人:沃尔夫冈·肯特, 比吉特·芒克－彼得森, 尤雷·皮斯克