专利名称：结核分枝杆菌Ag85B抗原的表达纯化和作为疫苗组份的应用的利记博彩app
技术领域：
本发明属生物医药技术领域，具体涉及一种融合DNA片段和及其表达产物蛋白质。该分子以融合方式在大肠杆菌宿主中重组表达。该重组DNA分子及其表达产物能够作为抗结核病的疫苗组份。
本发明提出的结核分枝杆菌Ag85B抗原的表达纯化方法是以标准毒力株H37Rv DNA为模板，用PCR法克隆抗原85B的编码基因，将该基因重组到表达型质粒pQE30中，表达的His6 Tag融合蛋白分子质量约为32 ku，用亲和层析一步法纯化的重组蛋白纯度好，得率高，为进一步的免疫研究创造条件。
近年来，纯蛋白制剂的亚单位疫苗是抗结核疫苗研究的热点。抗原85复合物中的Ag85A，Ag85B，Ag85C作为结核分枝杆菌主要的分泌抗原，不仅具有强大的免疫保护作用，同时也是潜在的新型抗结核药物的作用靶位点。真核表达系统的优点是无内毒素，而原核表达系统的优点是技术成熟，产率较高。pQE30/大肠杆菌系统的独特之处在于它利用六组胺酸表位可以高效快速表达，纯化目标蛋白，同时基本不影响其结构和生物活性。我们据紫外分光光度法OD(280)值计算，TG1株表达产物产量为11mg/L培养物，其含量约占总蛋白的7％。可见，用这种亲和纯化方法得到的产物得率高，纯度好，而且操作简便，适于大规模生产，为今后对它的结构研究，疫苗和诊断试剂盒的开发提供了条件。
本发明提出的结核分枝杆菌Ag85B抗原的表达纯化方法。该方法使用的材料如下(1)菌株与质粒大肠杆菌TG1和M15，质粒pQE30(Qiagen公司)。
(2)人型结核分支杆菌H37Rv株(上海第一肺科医院提供)。
(3)主要酶类及其它生化试剂DNA限制酶HindIII、BamHI、DNA连接酶、进口琼脂糖、均购自Roche公司；胶回收试剂盒购自华舜公司；镍离子螯合型琼脂糖凝胶(Ni-NTAAgarose)是Qiagen公司产品；PCR系列试剂购自Promega公司。其余化学试剂均为分析纯。
(4)PCR引物根据已发表的结核分枝杆菌H37Rv的DNA序列设计引物。引物1为5′TTTGGATCCTTCTCCCGGCCGGGGCTGC 3′；引物2为5′ATAAAGCTTTCAGCCGGCGCCTAACGAAC3′。为了便于PCR产物的克隆，在引物1和引物2的两端分别设计了一个BamHI和HindIII位点，由上海生工公司合成。
(5)测序引物pQE载体通用测序引物(Qiagen公司)本发明对结核分枝杆菌Ag85B抗原表达纯化的具体步骤如下(1)质粒DNA的制备，酶切按常规方法，割胶回收纯化。
(2)Ag85B编码基因的制备以H37Rv基因组DNA为模板，用PCR技术获取目的基因。PCR循环反应条件为(94℃，1min；79℃，1min；72℃，1min)×35循环。
(3)PCR产物的克隆和鉴定纯化的外源基因用与酶切质粒相同的2种限制性内切酶酶切、割胶化，然后与上述处理的质粒连接，转化宿主大肠杆菌，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性菌落。双酶切及PCR技术以上操作均按常规方法进行。用ABI377型自动测序仪对阳性克隆进行序列分析以鉴定重组质粒。
(4)外源基因在大肠杆菌中的诱导表达按常规方法，将鉴定后的阳性克隆于液体LB培养基中过夜培养，然后按5％接种量接种培养3小时后加入IPTG诱导表达4小时左右。
(5)表达产物的纯化pQE30/Ag85B重组表达产物带有六组氨酸表位，所以可用它对二价镍离子的螯合作用，直接用Ni-NTA Agarose亲和柱一步纯化表达产物。纯化操作如下超声破菌后高速离心，取上清上柱，先以含10mmol/L咪唑的平衡缓冲液(pH7。4)洗去不吸附的蛋白，再以含30mmol/L咪唑的缓冲液(pH7。4)洗平至基线，除去非特异性吸附的杂蛋白，再按咪唑浓度30-400mmol/L(pH7。4)的连续梯度条件洗脱，始终保持流速2mL/min。纯化表达产物用SDS-PAGE凝胶电泳，HPLC(惠普公司HP-1100型)鉴定。
纯化产物的初步性质检测洗脱、纯化的产物经透析，超滤除盐后，以质谱仪(PE
公司API165LC/MS型)测定其分子质量，并以圆二色仪(Jasco公司J-715型)测定其二级结构。二级结构中大约有45％的α螺旋，40％的β折叠。
PCR产物的克隆和鉴定纯化的外源基因用与酶切质粒相同的2种限制性内切酶酶切、割胶化，然后与上述处理的质粒连接，转化宿主大肠杆菌，在含氨苄青霉素的LB固体培养基上筛选阳性菌落。双酶切及PCR技术以上操作均按常规方法进行。用ABI 377型自动测序仪对阳性克隆进行序列分析以鉴定重组质粒。
PCR扩增产物的长度为876个碱基，琼脂糖电泳结果如
图1所示。图中(1)为PCR产物，(2)为λ噬菌体HindIII酶切片段-DNA分子质量标准。
实施例2 重组Ag85B的表达和纯化外源基因在大肠杆菌中的诱导表达按常规方法，将鉴定后的阳性克隆于液体LB培养基中过夜培养，然后按5％接种量接种培养3h后加入IPTG诱导表达4h左右。
表达产物的纯化pQE30/Ag85B重组表达产物带有六组氨酸表位，所以可用它对二价镍离子的螯合作用，直接用Ni-NTA Agarose亲和柱一步纯化表达产物。纯化操作如下超声破菌后高速离心，取上清上柱，先以含10mmol/L咪唑的平衡缓冲液(pH7。4)洗去不吸附的蛋白，再以含30mmol/L咪唑的缓冲液(pH7。4)洗平至基线，除去非特异性吸附的杂蛋白，再按咪唑浓度30-400mmol/L(pH7。4)的连续梯度条件洗脱，始终保持流速2mL/min。纯化表达产物用SDS-PAGE凝胶电泳，HPLC(惠普公司HP-1100型)鉴定。重组表达质粒pQE30/Ag85B在大肠杆菌中经IPTG诱导呈高效表达，表达产物的分子质量大小为32ku。如图2所示。图中(1)分子质量标准，(2)空pQE30载体，(3)pQE30/Ag85B重组载体，诱导4h的全菌样品。
取亲和层析洗脱曲线不同位置处收集的样品进行SDS-PAGE电泳，结果见图3所示。图中，(1)分子质量标准，(2)亲和层析前经诱导的TG1中的可溶蛋白，(3)亲和层析上样后的流出液，(4)非特异性结合的杂蛋白(30mmol/L咪唑缓冲液洗脱)，(5)Ag85B洗脱峰的峰尖部分。
实施例3纯化产物的鉴定和初步结构分析纯化产物的HPLC及质谱图谱见图4和图5。其中，柱型号Zorbax300SB-CN，5u，250×4.6nm，流动相C0.1％TFA；D0.085％TFA/CAN，梯度C for 5 min，next from C to80％D for 60min，流速1mL/min。
可见，一步法纯化后的重组Ag85B纯度已达99％。而质谱测得的分子质量(32，072。0u)与理论计算的分子质量(32，061。8u)的差异在仪器精度范围(1/1000)之内，证明了表达产物是准确的，进一步验证了我们对重组质粒的测序结果。我们也利用圆二色仪对重组Ag85B的结构作了初步测定(如图6)。根据杨公式计算分析，在低盐中性条件下，重组Ag85B的二级结构中大约有45％的α螺旋，40％的β折叠。图6园二色仪结果样品浓度50ug/Ml，比色皿光程0.1cm，溶剂water(mili-Q grade)，温度20℃，扫描范围250-190nm，步长0.2nm，Accumulation5。
权利要求
1.一种重组表达结核分枝杆菌Ag85B抗原分子的方法，其特征是在大肠杆菌中重组表达的融合性结核分枝杆菌Ag85B抗原。
2.权利要求1所述方法中涉及的一种融合DNA片段，其特征是含有真核生物的启动子序列和结核分枝杆菌Ag85B抗原。
3.一种疫苗配方，其特征是含有权利要求1所述的融合重组表达产物。
4.一种疫苗配方，其特征是含有权利要求1所述的融合DNA片段。
全文摘要
本发明涉及在大肠杆菌中重组表达结核分枝杆菌Ag85B抗原。以标准毒力株H37Rv DNA为模板,用PCR法克隆抗原85B的编码基因。将该基因重组到表达型质粒pQE30中,表达的His6 Tag融合蛋白分子质量约32ku,用亲和层析一步法纯化的重组蛋白纯度好,得率高,为进一步的免疫研究创造条件。
文档编号A61P31/00GK1342771SQ0112678
公开日2002年4月3日 申请日期2001年9月17日 优先权日2001年9月17日
发明者王洪海, 智刚, 王宝林 申请人:复旦大学