专利名称：金葡菌毒力刺激因子抑制肽及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一组能够特异抑制金葡菌毒力刺激因子活性的多肽。本发明还涉及这些金葡菌毒力刺激因子抑制肽在医药领域中的应用。
背景技术：
金黄色葡萄球菌(金葡菌)是一类常见的革兰氏阳性致病菌，是引起烧伤及战伤感染、肺炎、心内膜炎、败血症、中毒性休克等致命性疾病的主要微生物之一。每年仅医院内感染金葡菌的人数就超过数百万。目前临床上对金葡菌感染的治疗多采用联合使用抗生素的办法，但是效果并不理想。由于金葡菌极易产生耐药性且无好的解决方法，常用的许多抗生素对之无效，控制金葡菌感染已成为目前临床医学中亟待待解决的问题之一。
金葡菌的主要致病物质是毒素，包括溶血毒素、杀白细胞素、肠毒素等。最新研究表明，金葡菌这些毒力因子的合成是受一种可调节RNA分子，即RNA III控制的。RNA III激活毒力因子的基因转录，通过碱基互补调节毒力因子的翻译。在细菌生长的对数早期，其RNA III水平低，但到对数晚期RNAIII水平会增加40倍，而RNA III的水平是由金葡菌自身分泌的因子RAP(RNA III activating protein)，即RNA III激活蛋白调节的，故因子RAP又称为金葡菌毒力刺激因子。金葡菌持续分泌RAP，在RAP达到一定浓度后才有激活毒力因子产生的作用。没有RAP产生的金葡菌本身并不致病。1998年Science杂志研究结果表明，用RAP免疫动物，其抗体可以有效地保护小鼠免受金葡菌的感染，存在的主要问题是个体间抗体差异大，所以保护效果差异也大(Balaban N，et al.Autoinducer of virulence as a target for vaccine andtherapy against Staphylococcus aureus.Science，1998，280(17)438-440)。目前，文献报道一种一种小分子肽可抑制肽金葡菌毒力刺激因子的活性，该抑制肽被命名为RIP，氨基酸序列为YSPWTNF。它与RAP蛋白N-末端氨基酸序列有高度同源性(Balaban N，et al.Regulation of Staphylococcus aureuspathogenesis via target of RNA III-activating protein(TRAP).J.Bio.Chem.2001，2762658-2667)。
发明内容
我们采用噬菌体展示技术从随机肽库中筛选出能特异与RAP分子结合并抑制其活性的小分子多肽，目的是用RAP抑制剂阻断RAP对毒力因子产生的诱导作用，从而切断金葡菌毒素产生的信号转导，为治疗金葡菌感染开辟新的途径。本发明的多肽无论从来源还是从结构上完全不同于上述抑制肽RIP。
本发明的目的是提供一类能够与金葡菌毒力刺激因子特异结合并抑制其活性的多肽。
本发明的另一目的是提供这些金葡菌毒力刺激因子抑制肽在医药领域中的用途。
本发明的金葡菌毒力刺激因子抑制肽是具有以下通式结构的12肽W1-X1-A1-X2-W1-X4-P1-X1，其中，W代表色氨酸残基，X代表任何天然L-型氨基酸残基或D-型异构体，A代表芳香族氨基酸残基，如色氨酸残基(W)、酪氨酸残基(Y)或苯丙氨酸残基(F)等，脚注数字代表氨基酸残基的个数。
具有上述结构模式的多肽能够与金葡菌毒力刺激因子RAP特异结合，并抑制其活性。具体表现为，在体外具有上述结构模式的多肽无论是以何种形式如展示在噬菌体上、或体外化学合成、或用基因工程方法重组表达，都能够与RAP特异结合，并抑制金葡菌中由RAP调控的RNAIII的表达，动物实验结果表明，具有上述结构模式的多肽能够抑制金葡菌引起的感染。
本发明的小分子多肽可通过本技术领域的的常规方法，如化学合成或基因重组表达的方法制得。
传统抗生素治疗产生抗药性的原因主要为用药后细菌在生存压力下产生分解抗生素中有效基团的诱导酶。本发明利用特异抑制RAP活性的多肽建立的治疗金葡菌感染的方案，由于不杀灭细菌而使细菌的致病性丧失，所以不会象传统抗生素治疗那样对细菌产生选择压力而产生抗药株，这就为一直困扰临床的抗药性金葡菌感染这一常见、多发且有致命性的疾病的治疗找到新的出路。
本发明对研制新型抗金葡菌感染的小分子多肽药物具有重要意义，并具有广泛的应用价值及广阔的市场前景。另外，金葡菌毒力刺激因子RAP结合肽作为生物制剂也有潜在的应用价值，如可用于RAP的亲和纯化或作为探针用于RAP的检测等。
本发明的RAP抑制肽在抑制RAP活性方面优于RIP。
图1是RAP抑制肽对金葡菌细胞内RNA III水平的影响(Northern blot结果)。
具体实施例方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明。
实施例1.RAP抑制肽对金葡菌细胞内RNA III水平的影响1.实验方法提取培养90分钟的金黄色葡萄球菌细胞内总RNA。具体方法是4℃12000g离心，从5毫升细菌培养物中回收细胞，重悬菌体于0.5毫升裂解缓冲液，并在冰中冻结。超声破碎后，用等体积的酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)抽提1次，再用氯仿/异戊醇(24∶1)抽提1次，400微升水相加入15微升5M NaCl，并加2.5倍体积乙醇沉淀，-204℃过夜。4℃离心后，沉淀用70％乙醇洗一次，干燥后用无RNA酶的DNA缓冲液溶解，加入DNA酶消化60分钟，37℃酚氯仿抽提，标准乙醇沉淀方法回收RNA，溶解于100微升DEPC处理水中，定量。
利用RNA III特异性探针(序列为RNA III基因序列中1320～1566片段)，通过Northern blot方法检测金黄色葡萄球菌细胞内RNA III的水平，以此来检测结合肽的活性。
结合肽1为WHWTNWGKTSPA结合肽2为WPFAHWPWQYPR2.实验结果结果表明结合肽1和结合肽2均能够明显抑制RNA III的转录，参见附图1。图中，A为阳性对照；B、C、D、E为单克隆噬菌体，其中B为1号结合肽，E为2号结合肽；F为无关噬菌体展示肽。每加样孔加入5μg细菌总RNA。
实施例2.在感染金葡菌的动物模型上检测结合肽的活性1.实验方法采用经典的动物感染模型，即分别将同等培养条件且相同数量(1×108个细胞)的金黄色葡萄球菌单独或与结合肽混合注射到Balb/c来源的具有正常免疫力的无毛小鼠(军事医学科学院动物中心提供)皮下，所有注射物中含有终浓度为5毫克/毫升的Cyfodex(Ampharmacia公司产品)。72小时后观察小鼠皮肤感染面积的大小，感染面积的计算公式如下。
面积＝(π/6)×长度(厘米)×宽度(厘米)结合肽为WPFAHWPWQYPR2.实验结果结果发现RAP结合肽能够明显抑制金葡菌造成的动物皮肤感染，见下表组 别 感染面积(平方厘米)金葡菌+生理盐水 2.763±0.86金葡菌+结合肽 0.776±0.37*金葡菌+无关肽 2.154±1.24n＝8，*表示与加生理盐水对照组和无关肽对照组相比都有显著性差异(p＜0.001)
权利要求
1.金葡菌毒力刺激因子抑制肽，具有以下通式结构的氨基酸组成W1-X1-A1-X2-W1-X4-P1-X1，其中，W代表色氨酸残基，X代表任何天然L-型氨基酸残基或D-型异构体，A代表芳香族氨基酸残基，脚注数字代表氨基酸残基的个数。
2.权利要求1所述的金葡菌毒力刺激因子抑制肽，其特征在于A代表酪氨酸残基。
3.权利要求1所述的金葡菌毒力刺激因子抑制肽，其特征在于A代表苯丙氨酸残基。
4.权利要求1所述的金葡菌毒力刺激因子抑制肽，其特征在于A代表色氨酸残基。
5.权利要求1所述的金葡菌毒力刺激因子RAP抑制肽，其特征在于氨基酸组成为WHWTNWGKTSPA。
6.权利要求3所述的金葡菌毒力刺激因子RAP抑制肽，其特征在于氨基酸组成为WPFAHWPWQYPR。
7.权利要求1至5中的任意一项所述的金葡菌毒力刺激因子抑制肽在制备抗金葡菌感染药物中的应用。
全文摘要
本发明涉及一组能够特异抑制金葡菌毒力刺激因子活性的多肽。该抑制肽的氨基酸组成为W
文档编号A61K38/10GK1394871SQ0111997
公开日2003年2月5日 申请日期2001年7月5日 优先权日2001年7月5日
发明者邵宁生, 杨光, 柳川, 薛沿宁, 沈倍奋 申请人:中国人民解放军军事医学科学院基础医学研究所, 海南通用同盟药业有限公司