专利名称：抑制端粒酶活性脱氧核酶寡核苷酸结构及用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及生物工程药物，具体地说涉及抑制入端粒酶的脱氧核酶寡核苷酸药物的制备及用于抑制恶性肿瘤生长的用途。
癌症是威胁人类生命的重大疾病，对癌症的治疗一直是科学界关注的问题。由于目前广泛使用的放疗和化疗等手段不仅缺少对癌细胞良好的特异性杀伤力，而且有较大的毒副作用，在很大程度上使治疗的范围和效果都受到了限制。因此，寻找一种特异性高、毒副作用小的新型癌症治疗药物对癌症的治疗具有重要的现实意义。近来研究表明端粒酶与癌症有着极为密切的关系。端粒是真核细胞染色体末端的DNA序列，其功能是保持染色体的稳定性。端粒DNA的长短和稳定性决定了细胞的寿命，并与细胞的衰老和癌变密切相关。端粒是由端粒酶合成的。研究发现在永生细胞和85％的人恶性肿瘤细胞中均有端粒酶的活性，而在绝大多数正常人体细胞中却没有端粒酶的表达，因而端粒酶就有望成为癌症诊断的标志物和癌症治疗的靶点(Shay J W et al.Curr Opin oncol，1996，8(1)66-71)。端粒酶是一种由RNA和蛋白质组成的核蛋白复合体构成的酶，在端粒合成时由自身的RNA组分提供染色体末端端粒合成的模板。其中具有逆转录酶活性的hTRT蛋白亚基的表达是细胞调节端粒酶活性的主要限速步骤(Meyerson S et al.Cell，1997，90785-788)。由于其结构的特殊性，可以通过针对编码入端粒酶hTRT蛋白质亚基基因结构的反义寡核苷酸抑制端粒酶的活性，从而达到抑制肿瘤细胞生长的目的。
反义寡核苷酸(Antisense Oligonucleotide，ASON)是指同一个基因的有意义链或由它转录的RNA特异性互补并能杂交的核苷酸寡聚物，是治疗肿瘤和病毒性传染病的潜在新型药物(Stein et al.Science 1993，262(60)1004-1012)。国内外已尝试采用反义寡核苷酸治疗恶性肿瘤。尤其令人关注的是催化RNA切割反应的脱氧核酶的发现为目前正在兴起的以基因为靶点的反义基因治疗注入了新的活力。脱氧核酶的发现进一步丰富了反义技术。最典型的催化RNA切割反应的“10-23”型脱氧核酶是由Santoro和Joyce在1997年发现的。“10-23”型脱氧核酶寡核苷酸一般由33个核苷酸组成，其中脱氧核酶的催化中心序列有15个核苷酸(GGCTAGCTACAACGA)，在催化中心序列两端为各由9个核苷酸构成的靶RNA结合区，脱氧核酶的切割位点在RNA底物的嘌呤和嘧啶连接点上(图1)。酶动力学研究表明，该酶的kcat/Km可达109M-1·min-1以上，与RNase A(108M-1·min-1)、发夹型核酶(107M-1·min-1)、及锤头型核酶(107M-1·min-1)相比，脱氧核酶的催化降解RNA效率最高。而且在正常的细胞pH、温度和离子强度下，DNA对水解破坏的稳定性比蛋白质约高1000倍，比RNA高100,000倍，具有良好的稳定性(Break RR.Catalytic DNAin training and seekingemployment.Nat.Biotechnol.1999；17422)。脱氧核酶既具有反义寡核苷酸相对稳定、易于进行化学修饰、相对低廉的生产成本以及不需要构建载体的所有优点，同时又具有核酶(ribozyme)的酶学特性，并克服了核酶易受RNase降解、需要构建载体又不能象反义寡核苷酸那样直接用药的核酶自身的先天不足。因此，做为新一代反义技术，脱氧核酶的研究和应用已成了新药开发中的热门课题。
本发明的目的是根据编码入端粒酶hTRT蛋白质亚基基因序列设计并制备脱氧核酶寡核苷酸，以此可做为抑制表达端粒酶活性的恶性肿瘤细胞生长的癌症治疗药物。
本发明的主要内容是根据Morin等(Morin GB，et al.Science 1997，277(5328)955-959)测定的编码入端粒酶具有逆转录酶活性蛋白质亚基(hTRT)基因结构设计了十二条脱氧核酶寡核苷酸序列。本发明涉及合成的非天然存在的具有核糖核酸内切酶活性的寡核苷酸化合物，该化合物含有其序列定义了一个脱氧核酶催化区的寡核苷酸和其序列能够与入端粒酶催化亚基mRNA内预定的靶序列杂交的寡核苷酸。脱氧核酶催化区可以得自“10-23”型脱氧核酶等。该化合物其特征在于它包括与所述基因或其转录本或其复制中间体的至少一部分互补的序列，和在此互补列中不同位点上包含脱氧核酶催化区域，所述脱氧核酶催化区域序列插在互补序列的两个连续碱基之间。这类寡核苷酸化合物与所述部分基因杂交后会切割靶RNA，并阻止入端粒酶催化亚基基因表达，降低端粒酶活性，从而抑制恶性肿瘤细胞的生长。
该寡核苷酸由分子式为-O-P(＝O)(Y)-O-的磷酸酯键连接，其中Y可以是氧、或硫、或甲氧基等。该寡核苷酸及其硫代物可以抑制肿瘤细胞(HepG2细胞)的生长。故此发现该寡核苷酸在抑制恶性肿瘤细胞生长中有良好的作用，是一种用于抑制表达端粒酶活性的恶性肿瘤细胞生长的新型生物工程药物。
本发明的反义寡核苷酸可以包括以下序列1.5′CGCGCGGCA GGCTAGCTACAACGA CGCGGGGGT3′2.5′ACCTGCAAA GGCTAGCTACAACGA CCAGAAACA3′3.5′TCTTGTAGA GGCTAGCTACAACGA GTTGGTGCA3′4.5′GCAGGAGGA GGCTAGCTACAACGA CTTGTAGAT3′5.5′CAGCACACA GGCTAGCTACAACGA GCGTGAAAC3′6.5′CTGATGAAA GGCTAGCTACAACGA GGGAGCTGC3′7.5′ACTTGCTGA GGCTAGCTACAACGA GAAATGGGA3′8.5′CAGGAAAAA GGCTAGCTACAACGA GTGGGGTTC3′9.5′TGTCAGAGA GGCTAGCTACAACGA GACGCGCAG3′10.5′CTTTCAGGA GGCTAGCTACAACGA GGAGTAGCA3′11.5′AGTCCAGGA GGCTAGCTACAACGA GGTCTTGAA3′12.5′GGGTGGCCA GGCTAGCTACAACGA CAGTCCAGG3′本发明的抑制端粒酶活性的脱氧核酶寡核苷酸可以通过修饰来增加其稳定性。组成寡核苷酸的磷酸酯基团可以在天然磷酸二酯键部分的自由单键氧位置进行修饰，其中可以是氧、或是甲氧基、或是硫。
本发明的再一目的是提供一种药物组合物，它含有至少一种本发明的寡核苷酸或其修饰物，如果适当的话，还含有治疗上可接受的载体材料。
本发明的实施对严重危害人类健康的恶性肿瘤的治疗具有重大的社会效益和经济效益。
本发明用下列实施例进行解释，这些实施例的目的只是为了解释而不是以任何方式限制本发明。结合
本发明的具体实施方法图1.脱氧核酶寡核苷酸″10-23″模型示意2.端粒酶hTRT脱氧核酶硫代寡核苷酸对端粒酶hTRT mRNA底物片段的酶解切割图3.不同浓度3、9号端粒酶hTRT脱氧核酶硫代寡核苷酸对端粒酶hTRT mRNA底物片段的切割图4.不同浓度7、8号端粒酶hTRT脱氧核酶硫代寡核苷酸对端粒酶hTRT mRNA底物片段的切割图5.端粒酶hTRT脱氧核酶硫代寡核苷酸对HepG2细胞生长的抑制图6.不同浓度1、3、7、8号端粒酶hTRT脱氧核酶硫代寡核苷酸对HepG2细胞生长的抑制图7.7号端粒酶hTRT脱氧核酶硫代寡核苷酸对HepG2细胞端粒酶活性的抑制实施例方法1脱氧核酶硫代寡核苷酸设计与合成根据入端粒酶hTRT催化蛋白亚基cDNA序列，设计十二条脱氧核酶寡核苷酸。每条脱氧核酶寡核苷酸的两端各有3个核苷酸为硫代修饰，脱氧核酶寡核苷酸用PAGE或OPC纯化。方法2细胞培养HepG2采用含10％小牛血清，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的DMEM培养液，在37℃，5％二氧化碳条件下进行培养及传代。实施例一端粒酶hTRT脱氧核酶硫代寡核苷酸对端粒酶hTRT mRNA底物的酶解切割以构建好的PCI-hTRT质粒为模板，设计寡核苷酸引物(引物1.5′GTCACAGCCTGTTTCTGGAT；引物2.5′CGTTCTTGGC TTTCAGGATG)，进行PCR扩增，得到端粒酶催化亚基hTRT基因中210bp的目的片段hTRT210；将目的片段连接到pGEM-T载体；并用PCR扩增方法，筛选出阳性克隆菌落。DNA测序分析，确认克隆DNA片段序列的正确性。将此构建的质粒命名为pGEM-hTRT210质粒。用Nco I酶切重组质粒pGEM-hTRT210得到线型DNA片段，以此DNA片段为模板，用SP6 RNA聚合酶进行体外转录(Promega体外转录试剂盒)，加入α-32PrUTP进行放射性标记，鉴定、纯化转录产物，从而得到hTRT mRNA的部分基因片段。
分别对2-10号脱氧核酶硫代寡核苷酸进行RNA底物切割实验，程序如下1μl脱氧核酶硫代寡核苷酸(脱氧核酶硫代寡核苷酸的终浓度为5μmol/L)、2μl RNA底物、8μl反应缓冲液(50mmol/L Tris.HCl，pH7.5；0.15mol/L NaCl；MgCl210mmol/L；0.01％SDS)，37℃反应2.5小时。采用0.5×TBE的7％非变性PAGE电泳，放射自显影。采用上述反应条件测定3、9、7、8号脱氧核酶硫代寡核苷酸在不同浓度下对RNA底物的切割作用。脱氧核酶硫代寡核苷酸的终浓度分别为5μmol/L，1μmol/L，0.2μmol/L，0.04μmol/L。
图2(2-102号-10号脱氧核酶硫代寡核苷酸，C对照)结果表明2-10号脱氧核酶硫代寡核苷酸对端粒酶hTRT mRNA底物片段都有不同程度的切割作用。图3(1-4号为3号脱氧核酶硫代寡核苷酸的终浓度分别为0.04μmol/L，0.2μmol/L，1μmol/L，5μmol/L；5-8号为9号脱氧核酶硫代寡核苷酸的终浓度分别为0.04μmol/L，0.2μmol/L，1μmol/L，5μmol/L；C为对照)和图4(1-4号为7号脱氧核酶硫代寡核苷酸的终浓度分别为5μmol/L，1μmol/L，0.2μmol/L，0.04μmol/L；5-8号为8号脱氧核酶硫代寡核苷酸的终浓度分别为5μmol/L，1μmol/L，0.2μmol/L，0.04μmol/L；C为对照)的结果表明3、9、7、8号脱氧核酶硫代寡核苷酸对底物RNA的切割作用与脱氧核酶硫代寡核苷酸的用量有依赖关系。实施例二端粒酶hTRT脱氧核酶硫代寡核苷酸对HepG2细胞生长的抑制HepG2细胞用含10％小牛血清的DMEM培养液进行细胞培养，在96孔细胞培养板中，每孔接种3×103细胞/0.2ml，培养过夜。在无血清状态下，采用Lipofectin(GIBCO，1mg/ml)试剂并参照说明书操作进行脱氧核酶硫代寡核苷酸转染，每孔细胞用脱氧核酶硫代寡核苷酸终浓度为0.5μmol/L，脂质体0.8μg，总体积为100μl，每条脱氧核酶硫代寡核苷酸设置3孔，并设置阴性对照。转染时，在消毒的1.5ml离心管中，将0.75μl的200μmol/L的脱氧核酶硫代寡核苷酸与2.4μg脂质体分别用无血清DMEM培养基37.5μl稀释，室温放置30分钟后，将脂质体与脱氧核酶硫代寡核苷酸溶液混匀，室温下再放置30分钟，以便形成脂质体—脱氧核酶硫代寡核苷酸复合物，然后加入无血清DMEM培养基225μl。培养细胞用无血清DMEM培养基洗两次，每孔加入总体积100μl的脂质体—脱氧核酶硫代寡核苷酸复合物溶液，作用5小时，换含10％小牛血清的DMEM培养基培养19小时。然后同上重新换液和加入脂质体与脱氧核酶硫代寡核苷酸溶液两次。于培养72小时后，每孔加20μl MTT，并继续培养4小时，换液加100μl二甲基亚砜，于492nm测定光吸收。通过细胞生长倍增数量评价脱氧核酶硫代寡核苷酸对细胞生长的影响。方法同上，测定不同浓度(0.5μmol/L，0.25μmol/L和0.125μmol/L)1、3、7、8号脱氧核酶硫代寡核苷酸对HepG2细胞生长影响。
从图5中可见1～12号共十二条脱氧核酶硫代寡核苷酸对HepG2细胞生长的抑制率。十二条脱氧核酶硫代寡核苷酸对HepG2细胞均有不同程度的抑制作用，其中1、3、7、8号脱氧核酶硫代寡核苷酸对HepG2细胞生长的抑制率分别达到45.7％、43.2％、39.2％和45.6％。从图6中可见1、3、7、8号脱氧核酶寡核苷酸在0.5μmol/L(1c、3c、7c、8c)、0.25μmol/L(1b、3b、7b、8b)和0.125μmol/L(1a、3a、7a、8a)的不同浓度下，HepG2细胞生长抑制率与脱氧核酶寡核苷酸的浓度有显著的剂量依赖关系。
结果表明端粒酶hTRT脱氧核酶寡核苷酸可以有效地抑制HepG2肝癌细胞的生长。实施例三端粒酶hTRT脱氧核酶硫代寡核苷酸对HepG2细胞端粒酶活性的影响取30μl脂质体，加250μl无血清DMEM，混匀，室温放置30分。取7.5μl 7号脱氧核酶寡核苷酸，加250μl无血清DMEM，混匀，室温放置30分。两者混匀，放置15分钟。取一瓶HepG2细胞，用无血清DMEM洗两次，分别加入2.5ml无血清DMEM和0.5ml脂质体与7号脱氧核酶寡核苷酸的混合液，混匀，培养。脱氧核酶寡核苷酸的终浓度为0.5μmol/L。另取一瓶HepG2细胞同上，但只加脂质体。作用五小时后，各培养瓶分别加入3ml含20％小牛血清的DMEM培养液，继续培养。培养48小时后，收集细胞。按照Kim方法(Kim NW，et al.Specific association of human telomerase activity with immortal cells and cancer.Science，1994；2662011)测定端粒酶活性。
图7(7号端粒酶hTRT脱氧核酶硫代寡核苷酸，2阴性对照，3阳性对照)结果表明7号端粒酶hTRT脱氧核酶寡核苷酸可以抑制HepG2细胞端粒酶活性。
权利要求
1.本发明涉及合成的非天然存在的具有核糖核酸内切酶活性的寡核苷酸化合物，该化合物含有其序列定义了一个脱氧核酶催化区的寡核苷酸和其序列能够与入端粒酶催化亚基mRNA内预定的靶序列杂交的寡核苷酸。脱氧核酶催化区可以得自“10-23”型脱氧核酶等。这类寡核苷酸化合物与所述部分基因杂交后会切割靶RNA，并阻止入端粒酶催化亚基基因表达，降低端粒酶活性，从而抑制恶性肿瘤细胞的生长。
2.该化合物其特征在于其催化区序列有15个核苷酸(5′GGCTAGCTACAACGA)，在催化区两侧，各自连有7-9个核苷酸的互补结合臂序列，用于结合底物RNA。
3.根据权利要求1-2中的寡核苷酸，可以包括以下序列(黑体字部分为催化区)1.5′CGCGCGGCA GGCTAGCTACAACGA CGCGGGGGT3′2.5′ACCTGCAAA GGCTAGCTACAACGA CCAGAAACA3′3.5′TCTTGTAGA GGCTAGCTACAACGA GTTGGTGCA3′4.5′GCAGGAGGA GGCTAGCTACAACGA CTTGTAGAT3′5.5′CAGCACACA GGCTAGCTACAACGA GCGTGAAAC3′6.5′CTGATGAAA GGCTAGCTACAACGA GGGAGCTGC3′7.5′ACTTGCTGA GGCTAGCTACAACGA GAAATGGGA3′8.5′CAGGAAAAA GGCTAGCTACAACGA GTGGGGTTC3′9.5′TGTCAGAGA GGCTAGCTACAACGA GACGCGCAG3′10.5′CTTTCAGGA GGCTAGCTACAACGA GGAGTAGCA3′11.5′AGTCCAGGA GGCTAGCTACAACGA GGTCTTGAA3′12.5′GGGTGGCCA GGCTAGCTACAACGA CAGTCCAGG3′
4.根据权利要求1-3中的脱氧核酶寡核苷酸，包含与1-12号中任一序列相同，长度为33个核苷酸组成的任何寡核苷酸。催化区两侧的核苷酸长度可以是7-9个核苷酸。
5.根据权利要求1-4中所述脱氧核酶寡核苷酸的磷酸酯基团，其特征是该基团在磷酸二酯键部分的单键氧位置可以是氧、或硫、或甲氧基。
6.根据权利要求1-5中任一权项的脱氧核酶寡核苷酸，以及其修饰物，可以用于癌症的治疗。
7.将权利要求1-5中任一权项的脱氧核酶寡核苷酸，进行适当组合，制备治疗癌症的药用组合物。
8.将权利要求1-5中任一权项的脱氧核酶寡核苷酸，还可以制成各种不同的剂型，通过不同的给药途径用于恶性肿瘤的治疗。
9.将权利要求1-5中任一权项的脱氧核酶寡核苷酸，如果合适的话，还可与治疗上可接受的载体物质如脂质体、融合肽或病毒载体等组合，应用于癌症治疗。
10.将权利要求1-5中任一权项的脱氧核酶寡核苷酸应用于治疗癌症药物的制造工艺。
全文摘要
本发明涉及合成的非天然存在的具有核糖核酸内切酶活性的寡核苷酸化合物,该化合物含有其序列定义了一个脱氧核酶催化区的寡核苷酸和其序列能够与人端粒酶催化亚基mRNA内预定的靶序列杂交的寡核苷酸。脱氧核酶催化区可以得自“10－23”型脱氧核酶等。这类寡核苷酸化合物与所述部分基因杂交后会切割靶RNA,并阻止人端粒酶催化亚基基因表达,降低端粒酶活性,从而抑制恶性肿瘤细胞的生长。故此发现该脱氧核酶寡核苷酸在抑制恶性肿瘤细胞生长中有良好的作用,是一种用于抑制表达端粒酶活性的恶性肿瘤生长的新型药物。
文档编号A61K31/7088GK1380300SQ0111055
公开日2002年11月20日 申请日期2001年4月12日 优先权日2001年4月12日
发明者郑晓飞, 朱捷, 孙志贤 申请人:中国人民解放军军事医学科学院放射医学研究所