专利名称：一种人胰岛素重组基因、制备方法和应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种人胰岛素重组基因、制备方法和作为治疗糖尿病药物的应用，属于生物制药技术领域。
自1980年人胰岛素基因序列解明以后，有许多关于人胰岛素基因作为治疗糖尿病药物研究的报道，但现在所称的人胰岛素基因，实际为人胰岛素原基因，直接表达产物是活性较低的胰岛素原，由B链、C肽、A链86个氨基酸的单链多肽组成，而胰岛素原只有在胰岛β细胞内，被羧肽酶切掉C肽部分，才能成为成熟的活性很高的胰岛素及C肽，1992年由日本的Masahiro与Yanagita等人，对大鼠I型胰岛素基因进行了定点突变，以使胰岛素原的C肽部分可以被动物体内，普通细胞内存在的一种蛋白水解酶Furin或PACE切掉，成为成熟的胰岛素及C肽。此后亦有很多关于人胰岛素基因定点突变的研究报道，但他们所进行的定点突变多是在靠近C肽部分的B链或A链氨基酸上完成的。
本发明的目的在于提供一种在C肽氨基酸上完成的定点突变人胰岛素基因，并添加第一内含子重组改建，这样第一可避免改变胰岛素B、A链的氨基酸成分，保证与正常胰岛素的氨基酸成分一样，提高效用降低由不同于正常胰岛素氨基酸组成成分的不良作用。第二可以提高表达量，增加表达产物的调控作用，这对利用体细胞基因制备治疗糖尿病药物有重要的应用前景。本发明的技术方案是这样实现的这种人胰岛素重组基因序列(见附
图1)，序列长度1789个碱基，重组序列特征为第669-674碱基是密码子AAG、密码子CGC；第1536-1538碱基是密码子GGA；第1542-1544碱基是密码子CGG；第305-483个碱基是扩增的第一内含子。
所述的人胰岛素重组基因制备方法，包括a.制备突变载体和突变模板用限制性内切酶NcoI和SphI将人胰岛素基因组基因DNA片段取下，克隆进M13mp18噬菌体内，作为突变用载体，该噬菌体内含尿嘧啶的单链DNA作为突变用模板；b.定点突变利用定点突变引物15′-CTGCAGGTCCTCGCGCTTCCGGCGGGTC-3＇、定点突变引物25＇-CACGCTTCTGCCGGGATCCCTC-3＇与T4DNA聚合酶进行寡核苷酸介导的定点突变，并克隆该噬菌体及其提取DNA；突变位点第669-674、1536-1538、1542-1544个碱基；c.构建成表达载体将突变后的人胰岛素基因组基因DNA1.3kb片段，经DNA限制性内切酶ApaI切下回收，克隆进质粒PRC/CMV的多克隆位点上，构建成定点突变人胰岛素基因组基因质粒(pCMV/mhINS质粒)；d.补平酶切后质粒断端定点突变人胰岛素基因组基因质粒(pCMV/mhINS质粒)经DNA限制性内切酶XbaI、BamHI、NcoI、SacI、ApaI酶切后，70℃加热10分钟灭活DNA限制性内切酶，并补加核苷三磷酸和大片段酶，以补平酶切后定点突变人胰岛素基因组基因质粒断端；e.扩增连接利用第一内含子特异性引物15′-GTTCTAGACAGGCTGCATCAG-3＇、第一内含子特异性引物25＇-TACCATGGCAGAAGGACAGTG-3＇从人胰岛素基因组基因DNA中将第一内含子扩增0.23kb的DNA片段；经DNA连接酶(Ligase)与pCMV/mhINS质粒连接构建成含第一内含子的定点突变人胰岛素基因组基因重组质粒(pCMV/ImhINS)，第一内含子位点第305-483个碱基；f.重组质粒pCMV/ImhINS的克隆扩增重组质粒DNA转化入大肠杆菌DH5a后，进行细菌培养扩增；g.重组Pcmv/ImhINS质粒DNA的提取在大肠杆菌中复制的重组质粒经分离抽提、沉淀冷冻干燥制成人胰岛素重组基因。3、根据权利要求2所述的一种人胰岛素重组基因方法，其特征在于所述的构建突变用载体的方法a.包括混合人胰岛素基因组DNA 1μL(0.1-0.4μg)、酶切缓冲液2μL，限制性内切酶NcoI和SphI 1U/μgDNA、加水至20μL，37℃反应1小时；0.4％琼脂糖凝胶电泳回收1.3kb酶切产物；将M13mp18用限制性内切酶SmaI和SphI双酶切，用连接酶将1.3kb酶切产物与M13mp18连接，构建成突变用载体M13mp18/INS；提取该噬菌体的单链含尿嘧啶的DNA，作为定点突变用“U”模板。
所述的一种人胰岛素重组基因制备方法中所述基因定点突变方法b包括(1)、突变引物的5’端引物OH磷酸化；(2)、突变引物与单链DNA“U”模板杂交和延伸反应；(3)、对JM109F＇大肠杆菌的转染和突变体的筛选。
所述的一种人胰岛素重组基因制备方法中所述的突变引物的5’端引物OH磷酸化方法包括将突变引物1或2取100-200pmol、加入T4多核苷酸激酶缓冲液2μL、10mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)1μL、T4多核苷酸激酶4U，加水至20Ml，37℃水浴反应1小时，68℃水浴加热10分钟灭活酶。
所述的一种人胰岛素重组基因制备方法中所述的突变引物与单链DNA“U”模板杂交和延伸反应方法包括a.退火反应单链DNA“U”模板0.5pmol与磷酸化的“引物1”10pmol、磷酸化的“引物2”10pmol、T4DNA聚合酶缓冲液1μl、加水至10μl，置68℃水浴5分钟，缓慢冷却至室温，短暂离心以收集管壁上水滴；b.延伸反应混合T4DNA聚合酶缓冲液1μl、4种脱氧核苷磷酸(dNTP要达到500μmol/L)每种1μl、10mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)1μl、T4DNA连接酶缓冲液2μl、T4DNA聚合酶3U、T4DNA连接酶4U、加水至10μl；向a退火反应收集的溶液中加入10μl延伸反应混合液，首先冰浴放置5分钟，室温放置5分钟，然后于37℃水浴1-2小时，最后将反应产物置于10-16℃过夜。
所述的一种人胰岛素重组基因制备方法中所述的对JM109F＇大肠杆菌的转染和突变体的筛选方法包括接种JM109F＇大肠杆菌单菌落于10ml LB液种，37℃振荡培养至OD600＝0.3时，于4℃离心收集细胞，加入20ml冰冷的75mmolCaCl2溶液，悬浮后冰浴20分钟，离心收集细胞，将细胞溶于冰冷的4ml 75mmolCaCl2、15％甘油溶液中，使菌体成为感受态细胞，取2管100μl感受态JM109F＇大肠杆菌，分别加入过夜的延伸反应物1μl、5μl，混匀后冰浴30分钟，42℃热冲击2分钟，再冰浴5分钟。与100μl对数生长期的JM109F＇大肠杆菌及4ml溶化的顶层琼脂培养基混合均匀，铺于LB固体培养基上，37℃培养6小时后，待噬菌斑出现，用EcoRI和BamHI对突变后的噬菌体M13mp18/INS RF DNA进行酶切鉴定、DNA序列分析，证实两个位置都突变成功，该基因的其它序列完全正确。
所述的一种人胰岛素重组基因方法中所述的重组质粒pCMV/ImhINS的克隆扩增方法f包括将大肠杆菌DH5a(含第一内含子的定点突变人胰岛素基因组基因质粒)单菌落加入含氨苄青霉素的50mg/L的细菌液体选择培养基，37℃振荡培养8小时，作为种子培养液；按1/100比例将种子培养液加入细菌液体选择培养基，37℃振荡培养12-16小时，至OD600＝1.8-2.0，于4℃离心收集菌体；加入预冷的溶液悬浮菌体，再加入NaOH 0.2mol/L，1％十二烷基磺酸钠裂解溶液裂解菌体，室温放置5分钟，加入KAc-HAc缓冲溶液，冰浴30分钟，于4℃离心20分钟，取上清液，重复离心一次，至上清液澄清。
所述的一种人胰岛素重组基因制备方法中所述的重组质粒(pCMV/ImhINS)DNA的提取方法g包括将扩增所得上清液加入0.6倍体积异丙醇室温放置30分钟，离心，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥；将所得DNA溶于TE缓冲液中，加等量5mol/L LiCl，于4℃离心取上清；加等体积异丙醇室温放置30分钟，室温离心，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥；加入1mlTE缓冲液溶解沉淀，加入核糖核酸酶(Rnase)至其终浓度为20μg/ml，于37℃放置1小时，加等体积饱和重蒸苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1抽提，于4℃离心取上清；加等体积氯仿抽提，取上清；加1/10体积3mol/L NaAc、2倍体积无水乙醇，4℃放置30分钟以上；于4℃离心取沉淀；用70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥，所得DNA于-20℃下保存备用。
所述的一种人胰岛素重组基因方法中所述的重组质粒(pCMV/ImhINS)DNA的提取方法g还包括将扩增所得上清液加入0.6倍体积异丙醇室温放置30分钟，离心，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥；加等体积饱和重蒸苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提上层水相，加入1/10体积3mol/L NaAc、2倍体积无水乙醇或异丙醇，室温放置30分钟，室温离心，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥；将所得DNA溶于TE缓冲液中，加入核糖核酸酶(Rnase)至其终浓度为20μg/ml，37℃放置30分钟，加等体积饱和重蒸苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1抽提，上层水相进行Sepharose CL4B柱层析，检测洗脱液OD260，收集第一峰，收集液加入1/10体积3mol/L NaAc、2倍体积无水乙醇，4℃放置30分钟以上，离心，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥所得DNA于-20℃下保存备用。
本发明所述的人胰岛素重组基因作为治疗糖尿病药物的应用，其特征在于人胰岛素重组基因可以作为临床上治疗糖尿病的药物原料，制成临床上治疗糖尿病的冻干粉末制剂形式/静脉及肌肉注射溶液制剂形式、脂质体制剂形式、微胶囊制剂形式。
本发明的人胰岛素重组基因在体内外转染实验中取得了良好结果，提高了胰岛素和C肽表达量。本发明的技术进步意义是利用人胰岛素重组基因可直接制备制备治疗糖尿病的药物制剂或者用于合成人胰岛素。
下面结合附图和实施例详细说明本发明的技术内容图1是本发明人胰岛素重组基因制备流程2是本发明人胰岛素重组基因全序列图2中人胰岛素重组基因序列长度为1789个碱基，501-590碱基为决定胰岛素的B链氨基酸，1557-1616碱基为决定胰岛素的A链氨基酸，591-687、1474-1544碱基为决定胰岛素的C肽氨基酸，如图所示突变碱基AAG CGC位于第669-674碱基，突变碱基GGA位于第1536-1538碱基，突变碱基CGG位于1542-1544碱基，即突变碱基都位于C肽上，图中的定点突变碱基密码子用下划线表示，原碱基密码子写在突变碱基下方。添加的第一内含子部分位于第305-483碱基，用括号括出(GTCTGT……CAG)。
本发明的制备方法实施例人胰岛素DNA定点突变引物15＇-CTGCAGGTCCTCGCGCTTCCGGCGGGTC-3＇人胰岛素DNA定点突变引物25＇-CACGCTTCTGCCGGGATCCCTC-3＇定点突变引物1和2由北京大学用ABI381A DNA合成仪合成。第一内含子特异性引物15＇-GTTCTAGACAGGCTGCATCAG-3＇第一内含子特异性引物25＇-TACCATGGCAGAAGGACAGTG-3＇第一内含子特异性引物1和2委托由TAKARA公司合成。1、制备突变载体和突变模板用NcoI和SphI DNA限制性内切酶(购自promega公司，美国)将人胰岛素基因组基因DNA片段取下，克隆进M13mp18噬菌体(由中国农大生物学院动物生化室提供)内，作为突变用载体，该噬菌体内含尿嘧啶的单链DNA为突变用“U”模板。方法在无菌微量离心管内混合人胰岛素基因组DNA 1μL(0.1-0.4μg)酶切缓冲液2μL(购自promega公司，美国)NcoI和SphI 1U/μg DNA加水至20μL37℃反应1小时，0.4％琼脂糖凝胶电泳回收1.3kb酶切产物，将M13mp18用SmaI和SphI(购自promega公司，美国)双酶切，用连接酶将1.3kb酶切产物与M13mp18连接，构建成突变用载体M13mp18/INS，提取该噬菌体的单链含尿嘧啶的DNA，即为定点突变用“U”模板。2、定点突变利用突变引物1、2与T4 DNA聚合酶(购自promega公司，美国) 进行寡核苷酸介导的定点突变，并克隆该噬菌体及其提取DNA，方法(1)、突变引物的5’端引物OH磷酸化引物(1或2)100至200pmol加入T4多核苷酸激酶缓冲液2μL(购自promega公司，美国)10mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)1μL(购自promega公司，美国)T4多核苷酸激酶4U(购自promega公司，美国)加水至20μL37℃水浴反应1小时，68℃水浴加热10分钟灭活酶。(2)、突变引物与单链DNA“U”模板杂交和延伸反应a.退火反应(在1.5ml小管中进行)单链DNA“U”模板0.5pmol磷酸化的引物1 10pmol磷酸化的引物2 10pmolT4DNA聚合酶缓冲液1μl(购自promega公司，美国)加水至 10μl将小离心管置68℃水浴5分钟，然后放入一个100ml烧杯中，烧杯内含温度为60℃的水，置烧杯于室温，使小管内反应缓慢冷却至室温(需1-2小时)，短暂离心5秒以收集管壁上水滴。b.延伸反应I、将一新离心管置冰上，准备下面延伸反应混合液T4DNA聚合酶缓冲液1μl(购自promega公司，美国)4种脱氧核苷三磷酸(dNTP要达到500μmol/L)每种 1μl10mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP) 1μlT4DNA连接酶缓冲液 2μl(购自promega公司，美国)T4DNA聚合酶3 U(购自promega公司，美国)T4DNA连接酶4 U(购自promega公司，美国)加水至 10μlII、向a退火反应管中加入10μl延伸反应混合液，首先冰浴放置5分钟，室温放置5分钟，37℃水浴1-2小时，最后将反应管置于10-16℃过夜。(3)、对JM109F＇大肠杆菌的转染和突变体的筛选接种JM109F＇大肠杆菌(由中国农大生物学院动物生化室提供)单菌落于10ml LB液种，37℃振荡培养至OD600＝0.3时，于4℃，离心力3500g离心收集细胞，加入20ml冰冷的75mM CaCl2溶液，悬浮后冰浴20分钟。离心力3000g离心收集细胞，将细胞溶于冰冷的4ml 75mM CaCl2、15％甘油溶液中，使菌体成为感受态细胞。取2管100μl感受态JM109F＇大肠杆菌，分别加入过夜的延伸反应物1μl、5μl，混匀后冰浴30分钟，42℃热冲击2分钟，再冰浴5分钟。与100μl对数生长期的JM109F＇大肠杆菌及4ml溶化的顶层琼脂(购于Promega公司，美国)培养基混合均匀，铺于LB固体培养基上。37℃培养6小时后，待噬菌斑出现，用EcoRI和BamHI(购于Promega公司，美国)对突变后的噬菌体M13mp18/INS RF DNA(定点突变人胰岛素基因的M13mp18复制型DNA)进行酶切鉴定，若切出1kb的片段，即认为是阳性克隆，对该阳性克隆进一步做DNA序列分析，证实两个位置都突变成功，该基因的其它序列完全正确。3、构建表达载体将突变后的人胰岛素基因组基因DNA约1.3kb片段，经ApaI DNA限制性内切酶(购自promega公司，美国)切下回收，克隆进质粒PRC/CMV(由中国农大生物学院动物生化室提供)的多克隆位点上，构建成定点突变人胰岛素基因组基因质粒表达载体(pCMV/mhINS质粒)。方法混合下列溶液于一无菌微量离心管内定点突变人胰岛素基因组DNA1μL(0.1-4μg)酶切缓冲液2μL加限制性内切酶ApaI(购自promega公司，美国)1U/μg DNA加水至 20μL37℃反应1小时，0.4％琼脂糖凝胶电泳回收1.3kb酶切产物，将pRC/CMV用ApaI酶切，用连接酶将1.3kb酶切产物与pRC/CMV连接，构建成定点突变人胰岛素基因组基因质粒(pCMV/mhINS质粒)；4、扩增连接方法利用第一内含子特异性引物1、2从人胰岛素基因组基因DNA中将第一内含子扩增约0.23kb的DNA片段；定点突变人胰岛素基因组基因质粒(pCMV/mhINS质粒)经XbaI、BamHI、NcoI、SacI、ApaI等DNA限制性内切酶(购自promega公司，美国)进行酶切后，70℃加热10分钟灭活DNA限制性内切酶，并补加脱氧核苷三磷酸(dNTP)和Klenow(大片段酶)，以补平酶切后定点突变人胰岛素基因组基因质粒断端；经T4 DNA连接酶(Ligase购自promega公司，美国)与第一内含子DNA片段连接构建成含第一内含子的定点突变人胰岛素基因组基因重组质粒(pCMV/ImhINS)。5、重组质粒(pCMV/ImhINS)的克隆扩增重组质粒DNA转化入大肠杆菌DH5a(由中国农大生物学院动物生化室提供)后，进行细菌培养扩增。方法将大肠杆菌DH5a(含第一内含子的定点突变人胰岛素基因组基因质粒)单菌落加入含氨苄青霉素50mg/L的细菌液体选择培养基5ml(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH7.0购自北京化学试剂公司)37℃振荡培养8小时，作为种子培养液；按1/100比例将种子培养液加入500ml细菌液体选择培养基(配方同上，另含50mg/L氨苄青霉素)37℃振荡培养12-16小时，至OD600＝1.8-2.0，于4℃，离心力6000g离心10分钟收集菌体。裂解菌体方法将离心收集的菌体加50ml预冷溶液(葡萄糖50mmol/L，Tris-HCl 25mmol/L，EDTA10mmol/L，pH8.0购自北京化学试剂公司)悬浮菌体，加50ml新配置的裂解溶液裂解菌体(NaOH 0.2mol/L，1％十二烷基磺酸钠购自北京化学试剂公司)室温放置5分钟，每管加50ml缓冲溶液(3mol/L KAc，5mol/L HAc，购自北京化学试剂公司)，冰浴30分钟，于4℃，离心力20000g，离心20分钟取上清液，重复离心一次，至上清液澄清。7、重组Pcmv/ImhINS质粒DNA的提取方法1将所得上清液加入0.6倍体积异丙醇室温放置30分钟，室温离心力20000g离心20分钟，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥；将所得DNA溶于15mlTE缓冲液中(三羟甲基胺基甲烷(Tris)10mmol/L，EDTA1mmol/L，pH8.0购自北京化学试剂公司)，加等量5mol/L LiCl，于4℃、离心力15000g离心10分钟，取上清；加等体积异丙醇室温放置30分钟，室温离心力20000g离心20分钟，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥；加入1mlTE缓冲液溶解沉淀，加入核糖核酸酶(Rnase购自Sigma公司)至其终浓度为20ug/ml，于37℃放置1小时，加等体积饱和重蒸苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1抽提，于4℃，离心力10000g，离心5分钟，取上清；加等体积氯仿抽提，取上清；重复以上抽提步骤一次；加1/10体积3mol/L NaAc、2倍体积无水乙醇，4℃放置30分钟以上；于4℃，离心力10000g离心10分钟，取沉淀；用70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥，所得DNA于-20℃下保存备用。方法2将所得上清液加入0.6倍体积异丙醇室温放置30分钟，室温离心力20000g离心15分钟，取上清液，加等体积饱和重蒸苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1抽提上层水相，加入1/10体积3mol/L NaAc、2倍体积无水乙醇或异丙醇，室温放置30分钟，室温离心力20000g离心20分钟，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥；将所得DNA溶于15ml TE缓冲液中(Tris 10mmol/L，EDTA 1mmol/L，pH8.0)，加入核糖核酸酶(Rnase购自Sigma公司)至其终浓度为20ug/ml，37℃放置30分钟，加等体积饱和重蒸苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1抽提，上层水相进行Sepharose CL4B柱层析(购于promega公司)，检测洗脱液OD260，收集第一峰，收集液加入1/10体积3mol/L NaAc、2倍体积无水乙醇，4℃放置30分钟以上；于4℃，离心力10000g离心10分钟，取沉淀；70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥所得DNA于-20℃下保存备用。
重组质粒pCMV/ImhINS(含第一内含子的定点突变人胰岛素基因组基因质粒)的体外转染实验直接选择大白鼠体内肝细胞和骨骼肌细胞作为靶细胞，进行体外细胞培养体外培养细胞，含第一内含子的定点突变人胰岛素基因组基因质粒转染载体选择阳性离子脂质体Lipofectamine(购自GIBCO-BRL公司，美国)作转染载体。实验方法按Lipofectamine产品说明书执行，获得了较好的转染效果。经测定培养液中胰岛素浓度为10.45μIu/ml，C肽为0.67ng/ml，而不含第一内含子的培养液中胰岛素浓度为5.5μIu/ml，C肽未测出。
本发明的人胰岛素重组基因作为治疗糖尿病药物的应用，可以作为临床上治疗糖尿病的药物原料，如合成胰岛素等，或者直接制成临床上治疗糖尿病的冻干粉末制剂形式静脉及肌肉注射溶液制剂形式、脂质体制剂形式、微胶囊制剂形式等。
权利要求
1.一种人胰岛素重组基因序列(见附图1)，序列长度1789个碱基，重组序列特征为第669-674碱基是密码子AAG、密码子CGC；第1536-1538碱基是密码子GGA；第1542-1544碱基是密码子CGG；第305-483个碱基是扩增的第一内含子。
2.一种人胰岛素重组基因制备方法，包括a.制备突变载体和突变模板用限制性内切酶NcoI和SphI将人胰岛素基因组基因DNA片段取下，克隆进M13mp18噬菌体内，作为突变用载体，该噬菌体内含尿嘧啶的单链DNA作为突变用模板；b.定点突变利用定点突变引物15′-CTGCAGGTCCTCGCGCTTCCGGCGGGTC-3＇、定点突变引物25′-CACGCTTCTGCCGGGATCCCTC-3＇与T4DNA聚合酶进行寡核苷酸介导的定点突变，并克隆该噬菌体及其提取DNA；突变位点第669-674、1536-1538、1542-1544个碱基；c.构建成表达载体将突变后的人胰岛素基因组基因DNA 1.3kb片段，经DNA限制性内切酶ApaI切下回收，克隆进质粒PRC/CMV的多克隆位点上，构建成定点突变人胰岛素基因组基因质粒(pCMV/mhINS质粒)；d.补平酶切后质粒断端定点突变人胰岛素基因组基因质粒(pCMV/mhINS质粒)经DNA限制性内切酶XbaI、BamHI、NcoI、SacI、ApaI酶切后，70℃加热10分钟灭活DNA限制性内切酶，并补加核苷三磷酸和大片段酶，以补平酶切后定点突变人胰岛素基因组基因质粒断端；e.扩增连接利用第一内含子特异性引物15＇-GTTCTAGACAGGCTGCATCAG-3＇、第一内含子特异性引物25＇-TACCATGGCAGAAGGACAGTG-3＇从人胰岛素基因组基因DNA中将第一内含子扩增0.23kb的DNA片段；经DNA连接酶(Ligase)与pCMV/mhINS质粒连接构建成含第一内含子的定点突变人胰岛素基因组基因重组质粒(pCMV/ImhINS)，第一内含子位点第305-483个碱基；f.重组质粒pCMV/ImhINS的克隆扩增重组质粒DNA转化入大肠杆菌DH5a后，进行细菌培养扩增；g.重组Pcmv/ImhINS质粒DNA的提取在大肠杆菌中复制的重组质粒经分离抽提、沉淀冷冻干燥制成人胰岛素重组基因。
3.根据权利要求2所述的一种人胰岛素重组基因制备方法，其特征在于所述的构建突变用载体的方法a.包括混合人胰岛素基因组DNA 1μL(0.1-0.4μg)、酶切缓冲液2μL，限制性内切酶NcoI和SphI 1U/μgDNA、加水至20μL，37℃反应1小时；0.4％琼脂糖凝胶电泳回收1.3kb酶切产物；将M13mp18用限制性内切酶SmaI和SphI双酶切，用连接酶将1.3kb酶切产物与M13mp18连接，构建成突变用载体M13mp18/INS；提取该噬菌体的单链含尿嘧啶的DNA，作为定点突变用“U”模板。
4.根据权利要求2所述的一种人胰岛素重组基因制备方法，其特征在于所述的基因定点突变方法b包括(1)、突变引物的5’端引物OH磷酸化；(2)、突变引物与单链DNA“U”模板杂交和延伸反应；(3)、对JM109F＇大肠杆菌的转染和突变体的筛选。
5.根据权利要求4所述的一种人胰岛素重组基因制备方法，其特征在于所述的突变引物的5’端引物OH磷酸化方法包括将突变引物1或2取100-200pmol、加入T4多核苷酸激酶缓冲液2μL、10mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)1μL、T4多核苷酸激酶4U，加水至20Ml，37℃水浴反应1小时，68℃水浴加热10分钟灭活酶。
6.根据权利要求4所述的一种人胰岛素重组基因制备方法，其特征在于所述的突变引物与单链DNA“U”模板杂交和延伸反应方法包括a.退火反应单链DNA“U”模板0.5pmol与磷酸化的“引物1”10pmol、磷酸化的“引物2”10pmol、T4DNA聚合酶缓冲液1μl、加水至10μl，置68℃水浴5分钟，缓慢冷却至室温，短暂离心以收集管壁上水滴；b.延伸反应混合T4DNA聚合酶缓冲液1μl、4种脱氧核苷磷酸(dNTP要达到500μmol/L)每种1μl、10mmol/L的腺嘌呤核苷三磷酸(ATP)1μl、T4DNA连接酶缓冲液2μl、T4DNA聚合酶3U、T4DNA连接酶4U、加水至10μl；向a退火反应收集的溶液中加入10μl延伸反应混合液，首先冰浴放置5分钟，室温放置5分钟，然后于37℃水浴1-2小时，最后将反应产物置于10-16℃过夜。
7.根据权利要求4所述的一种人胰岛素重组基因制备方法，其特征在于所述的对JM109F＇大肠杆菌的转染和突变体的筛选方法包括接种JM109F＇大肠杆菌单菌落于10ml LB液种，37℃振荡培养至OD600＝0.3时，于4℃离心收集细胞，加入20ml冰冷的75mmolCaCl2溶液，悬浮后冰浴20分钟，离心收集细胞，将细胞溶于冰冷的4ml 75mmolCaCl2、15％甘油溶液中，使菌体成为感受态细胞，取2管100μl感受态JM109F＇大肠杆菌，分别加入过夜的延伸反应物1μl、5μl，混匀后冰浴30分钟，42℃热冲击2分钟，再冰浴5分钟。与100μl对数生长期的JM109F＇大肠杆菌及4ml溶化的顶层琼脂培养基混合均匀，铺于LB固体培养基上，37℃培养6小时后，待噬菌斑出现，用EcoRI和BamHI对突变后的噬菌体M13mp18/INS RF DNA进行酶切鉴定、DNA序列分析，证实两个位置都突变成功，该基因的其它序列完全正确。
8.根据权利要求2所述的一种人胰岛素重组基因制备方法，其特征在于所述的重组质粒pCMV/ImhINS的克隆扩增方法f包括将大肠杆菌DH5a(含第一内含子的定点突变人胰岛素基因组基因质粒)单菌落加入含氨苄青霉素的50mg/L的细菌液体选择培养基，37℃振荡培养8小时，作为种子培养液；按1/100比例将种子培养液加入细菌液体选择培养基，37℃振荡培养12-16小时，至OD600＝1.8-2.0，于4℃离心收集菌体；加入预冷的溶液悬浮菌体，再加入NaOH 0.2mol/L，1％十二烷基磺酸钠裂解溶液裂解菌体，室温放置5分钟，加入KAc-HAc缓冲溶液，冰浴30分钟，于4℃离心20分钟，取上清液，重复离心一次，至上清液澄清。
9.根据权利要求2所述的一种人胰岛素重组基因制备方法，其特征在于所述的重组质粒(pCMV/ImhINS)DNA的提取方法g包括将扩增所得上清液加入0.6倍体积异丙醇室温放置30分钟，离心，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥；将所得DNA溶于TE缓冲液中，加等量5mol/L LiCl，于4℃离心取上清；加等体积异丙醇室温放置30分钟，室温离心，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥；加入1mlTE缓冲液溶解沉淀，加入核糖核酸酶(Rnase)至其终浓度为20ug/ml，于37℃放置1小时，加等体积饱和重蒸苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1抽提，于4℃离心取上清；加等体积氯仿抽提，取上清；加1/10体积3mol/L NaAc、2倍体积无水乙醇，4℃放置30分钟以上；于4℃离心取沉淀；用70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥，所得DNA于-20℃下保存备用。
10.根据权利要求9所述的一种人胰岛素重组基因制备方法，其特征在于所述的重组质粒(pCMV/ImhINS)DNA的提取方法g还包括将扩增所得上清液加入0.6倍体积异丙醇室温放置30分钟，离心，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥；加等体积饱和重蒸苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提上层水相，加入1/10体积3mol/L NaAc、2倍体积无水乙醇或异丙醇，室温放置30分钟，室温离心，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥；将所得DNA溶于TE缓冲液中，加入核糖核酸酶(Rnase)至其终浓度为20ug/ml，37℃放置30分钟，加等体积饱和重蒸苯酚∶氯仿∶异戊醇＝25∶24∶1抽提，上层水相进行Sepharose CL4B柱层析，检测洗脱液OD260，收集第一峰，收集液加入1/10体积3mol/L NaAc、2倍体积无水乙醇，4℃放置30分钟以上，离心，70％乙醇洗涤沉淀，冷冻干燥所得DNA于-20℃下保存备用。
11.一种人胰岛素重组基因作为治疗糖尿病药物的应用，其特征在于人胰岛素重组基因作为临床上治疗糖尿病的药物原料，制成治疗糖尿病的冻干粉末制剂形式、注射溶液制剂形式、脂质体制剂形式、微胶囊制剂形式。
全文摘要
本发明提供提供一种在C肽氨基酸上完成的定点突变人胰岛素基因,并添加第一内含子重组改建,重组序列特征为第669－674碱基是密码子AAG、密码子CGC;第1536－1538碱基是密码子GGA;第1542－1544碱基是密码子CGG;第305－483个碱基是扩增的第一内含子。本发明的人胰岛素重组基因作为治疗糖尿病药物的应用,可以作为临床上治疗糖尿病的药物原料或者直接制成临床上治疗糖尿病的各种制剂形式。
文档编号A61P3/00GK1321746SQ01110268
公开日2001年11月14日 申请日期2001年4月5日 优先权日2001年4月5日
发明者姚文彬, 吴以岭, 田书彦, 曹月青, 胡建立 申请人:河北以岭医药研究院