专利名称：作为免疫调节子的萎叶提取物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及萎叶提取物用于从人外周血T细胞中诱导IFN-γ产生的应用。
背景技术：
大荨麻叶提取物已经在德国注册用于风湿病的辅助治疗。在全血培养物系统中，荨麻提取物IDS 23(Rheuma-Hek)可抑制脂多糖刺激的单核细胞细胞因子的表达，从而表现出一种免疫调节作用(大荨麻叶提取物IDS 23对T辅助细胞因子体外表达的抗风湿作用)。本申请人研究了萎叶提取物在体外对植物凝集素(PHA)刺激的外周血单核细胞(PBMC)的免疫调节作用。萎叶具有强烈的刺激性芳香气味，并可被广泛用作咀嚼剂。通常，成熟或老了的叶子虽然已经停止生长，但还没有变脆，因而可用于咀嚼。用于咀嚼目的的碱性制剂由用熟石灰和儿茶涂抹的萎叶组成，其中还加入了槟榔碎屑；根据个人口味的不同，还可使用调味料如椰子屑，丁香，小豆蔻，茴香，粉甘草，肉豆蔻和烟草。在某些地方，还在特制的盘上覆盖银箔或金箔。作为一种咀嚼剂，它具有很多特性它是芳香的，可消化的，刺激性的，并可减轻肠胃气胀。医学上，它可用于治疗粘膜炎和肺部感染；还可用于泥敷剂。咀嚼具有槟榔和其它添加剂的萎叶可兴奋唾液腺并刺激口腔粘膜。产生的红色染色是由于槟榔中的色素在石灰和儿茶中的碱的作用下显现出来。产生轻度的刺激导致一种温暖的感觉，此外还可产生一种令人愉快的气味。决定叶子芳香值的最重要因素是所含香精油的量，特别是香精油的性质。不同地区萎叶的气味和味道是不同的。最有刺激性的是Sanchi型，而最柔且最甜的则来源于马德拉斯。萎叶含有香精油，根据叶子种类的不同，香精油的含量范围从0.7到2.6％。所述香精油是由苯酚和萜烯组成。酚油的比例越高，品质越好。被称为萎叶醇(萎叶苯酚；4-烯丙基-2-羟基-1-甲氧基苯)的丁子香酚异构体被认为是萎叶油特有的成分。然而它并不存在于印度的样品中。印度的萎叶油主要含有酚成分。萎叶油已经被用于治疗各种呼吸粘膜炎，在治疗白喉时可通过漱口或吸入而局部使用，具有减轻肠胃胀气的性质。它对哺乳动物的中枢神经系统具有不同的作用；致死剂量可产生深度昏迷，进而在几小时内导致死亡。叶子的香精油和提取物具有抗各种革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌，如白色化脓微球菌(Mircococcus pyogenes var.albus)和金黄色化脓微球菌(Mircococcus pyogenes var.aureus)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtillis)和巨大芽孢杆菌(B.megaterium)，肺炎双球菌(Diplococcuspneumoniae)，酿脓链球菌(Streptococcus pyogene)，埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)，伤寒沙门氏菌(Salmonella typhosa)，逗号弧菌(Vibrio comma)，痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae)，普通变形菌(Proteus vulgaris)，青枯假单胞菌(Psedomonas solanacaerum)，藤黄八叠球菌(Sarcina lutea)和胡萝卜软腐欧文氏菌(Erwiniacarotovora)的作用。该油可在大约5分钟内杀死原生动物大草履虫(paramaecium caudatum)(Wealth of India，Vol.8 pp.84-94)。它可抑制霍乱弧菌(Vibrio cholerae)，伤寒沙门氏菌(Salmonellatyphosum)和弗氏志贺氏菌(Shigella flexneri)及埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)的生长。叶子的水蒸气蒸馏物具有抗结合分支杆菌(Mycobaterium tuberculosis)的活性。
发明目的本发明的主要目的是提供一种从人外周血单核细胞中诱导IFNγ的方法。
本发明的另一个目的涉及萎叶提取物用于从人外周血T细胞中诱导IFNγ产生的应用。
本发明的另一个目的是提供一种含有可用作Th1型免疫调节子的萎叶提取物的组合物。
发明概述为了达到上述目的，本发明提供了一种从人外周血单核细胞中诱导IFNγ的方法。本发明还涉及萎叶提取物用于从人外周血T细胞中诱导IFNγ产生的应用。
发明详述因此，本发明涉及一种从人外周血单核细胞中诱导IFNγ的方法，所述方法包括制备萎叶的水提取物；制备人外周血单核细胞；用萎叶提取物培养hPBMC 18-48小时；提取RNA，用于检测胞内细胞因子蛋白的细胞因子特异性RT-PCR或流式细胞术中；利用IFNγ特异性的已知引物使RNA进行RT-PCR从而获得PCR产物；并通过IFNγ的特异性带反映IFNγ的增加。
可选择地，还有从人外周血单核细胞中诱导IFNγ产生的一种进一步的方法，其中所述方法包括使所培养的细胞进行IFNγ胞内染色；在流式细胞计中分析染色的细胞；并使IFNγ阳性细胞至少增加至7倍。
一种使用萎叶提取物作为Th1型免疫调节子的方法，其中所述方法包括a)给予被试者至少5-10mg/ml/kg体重的萎叶提取物，并b)通过口服或肌内途径一天一次给予所述提取物达至少1个月。
本发明其中一个实施方案提供一种用作Th1型免疫调节子的药物组合物，所述组合物含有与添加剂混合或缔合的有效量萎叶水提取物或冻干的萎叶提取物。
在本发明另一实施方案中，所述添加剂选自于不会干扰萎叶提取物活性的方式。
在本发明另一实施方案中，所述添加剂选自营养物如蛋白，碳水化合物，糖，滑石粉，硬脂酸镁，纤维素，碳酸钙，淀粉-明胶糊和/或药学上可接受的载体，赋形剂，稀释剂，或溶剂。
在本发明另一实施方案中，所述水提取物，冻干产物或组合物通过口服或肌内给药。
在本发明另一实施方案中，所述口服途径是胶囊剂，糖浆剂，浓缩物，粉剂或颗粒剂的形式。
在本发明另一实施方案中，萎叶提取物与添加剂的比为10-1∶1-10。
在本发明另一实施方案中，萎叶提取物，冻干提取物或含有萎叶提取物的组合物是以5-10mg/kg体重的剂量水平至少一天一次给药达1个月。
本发明另一个实施方案提供了一种治疗被试者从而提供Th1型免疫调节的方法，所述方法包括给予被试者药学有效量的萎叶提取物，冻干提取物或含有所述提取物的组合物。
在本发明另一实施方案中，所述的添加剂选自于不会干扰冻干的萎叶提取物活性的方式。
在本发明另一实施方案中，所述添加剂选自营养物如蛋白，碳水化合物，糖，滑石粉，硬脂酸镁，纤维素，碳酸钙，淀粉-明胶糊和/或药学上可接受的载体，赋形剂，稀释剂，或溶剂。
在本发明另一实施方案中，所述水提取物，冻干产物或组合物通过口服或肌内给药。
在本发明另一实施方案中，所述口服途径是胶囊剂，糖浆剂，浓缩物，粉剂或颗粒剂的形式。
在本发明另一实施方案中，萎叶提取物与添加剂的比为10-1∶1-10。
在本发明另一实施方案中，萎叶提取物，冻干提取物或含有萎叶提取物的组合物是以5-10mg/kg体重的剂量水平至少一天一次给药达1个月。
在本发明又一实施方案中，与适宜的载体/添加剂缔合的萎叶提取物可用作Th1型免疫调节子。
在本发明另一实施方案中，所述的添加剂选自于不会干扰冻干的萎叶提取物活性的方式。
在本发明另一实施方案中，所述添加剂选自营养物如蛋白，碳水化合物，糖，滑石粉，硬脂酸镁，纤维素，碳酸钙，淀粉-明胶糊和/或药学上可接受的载体，赋形剂，稀释剂，或溶剂。
在本发明另一实施方案中，所述水提取物，冻干产物或组合物通过口服或肌内给药。
在本发明另一实施方案中，所述口服途径是胶囊剂，糖浆剂，浓缩物，粉剂或颗粒剂的形式。
在本发明另一实施方案中，萎叶提取物与添加剂的比为10-1∶1-10。
在本发明另一实施方案中，萎叶提取物，冻干提取物或含有萎叶提取物的组合物是以5-10mg/kg体重的剂量水平至少一天一次给药达1个月。
本发明另一实施方案涉及萎叶提取物的制备，包括下列步骤1)洗涤新鲜的萎叶，并将其放在混合捣碎器中均化；2)在超声浴器中进行2-3次声波降解，每次15分钟，过滤提取物，如果需要，重复提取至少一次并干燥；并3)冷冻干燥提取物，得到一种半-固体物质。
在本发明又一实施方案中，所述的冻干提取物是通过用常规方法冷冻干燥水提取物而获得。
在另一实施方案中，所述水提取物是从下列类型，即野生型，Climber型，Bangla型和Sweet型的萎叶(Piper betel)制备而得。
附图
简述图I描述RT-PCR，证实了萎叶提取物通过正常人的外周血单核细胞(PBMC)提高了IFNγ mRNA的表达。
图II描述流式细胞术测定，萎叶提取物通过正常人的PBMC提高了IFNγ在蛋白质水平的表达。
下列实施例用于进一步举例说明本发明，而不是对本发明的限制。
实施例1用无菌水彻底清洗34.14gm新鲜的萎叶(Piper betle)，在混合捣碎器中用100ml蒸馏水均化。然后在超声浴器中进行3次声波降解，每次15分钟。通过Whatman 1号滤纸过滤所述提取物，并收集滤液。重复该提取过程3次。冷冻干燥所收集的提取物，得到重1.17gm的半-固体。然后测试其生物活性。
实施例2在混合捣碎器中用蒸馏水(60ml)均化21.68gm新鲜的萎叶，然后在超声浴器中进行2次声波降解，每次15分钟。过夜提取16小时。通过Whatmanl号滤纸过滤，从而分离出在水中提取出的物质。重复3次这种类型的提取处理。45℃减压条件下，在闪蒸器中蒸发所收集的提取物至干。然后在高度真空条件下的干燥器中干燥剩余的残渣，得到重约0.59gm的半-固体物质，测试它们的生物活性。
所得物质的性质通过实施例1和2得到的生物活性物质具有下列性质1)按上述制备的干燥半固体是一种可溶于水和二甲基亚砜的深色物质。
2)所述活性物质在正-丁醇∶醋酸∶水＝9∶5∶7的溶剂系统中的薄层色谱显示出5个点，其Rf值分别为0.75，0.64，0.50，0.40和0.33。
3)使用Intersil ODS-3(4.6×250mm)分析柱，甲醇∶水＝4∶1的溶剂系统，1.0ml/分钟的流速对所述活性物质进行HPLC分析，在217nm处检测，所述物质被分解成11个保留时间分别为2.69，4.27，5.95，6.97，7.49，9.39，11.20，12.40，15.53，18.90和21.49分钟的峰。
实施例31.人外周血单核细胞(PBMC)的制备使肝素化的全血(采集自正常人)经过Ficoll Hypaque密度梯度离心。用磷酸盐缓冲生理盐水(PBS)洗涤界面中的细胞2次，然后在补充了10％胎牛血清的培养基RPMI-1640中重悬浮。
2.用萎叶提取物培养hPBMC在37℃，5％CO2，及有或没有萎叶提取物(12.5mg/ml最终浓度)的条件下，在24孔平板中过夜(18小时)培养PBMC(5.0×106个细胞)，其中该平板中含有总体积2.0ml的RPMI+含5μg/ml植物凝集素的10％FBS。培养结束时，用PBS洗涤PBMC两次以提取总RNA，该总RNA用于以单细胞水平检测胞内细胞因子的细胞因子特异性RT-PCR或流式细胞术中。
3.RNA的制备和RT-PCR通过Trizol(Gibco BRL)从所培养的PBMC中提取总细胞RNA。如上所述培养5×106个细胞18小时，收集并在1ml Trizol中重悬浮。将2μgRNA和10μm各引物用于合成cDNA，并使用superscriptTM一步RT-PCR系统(Gibco BRL)在单管中进行PCR，其中该系统含有总体积25μl的人IFNγ和人IL-4引物序列，该引物序列如下所示IFNγ有意义的，5’TCTGCA TCG TTT TGG GTT CT 3’；反义的，5’CAG CTT TTC GAAGTC ATC TC3’；IL-4有意义的，5’CCT CTG TTC TTC CTG CTAGC 3’；反义的，5’CCGTTTCAGGAA TCG GAT CA 3’。扩增及cDNA的合成是按照制造商的方案所述进行的。使PCR产物在有溴乙啡啶存在的1.2％琼脂糖凝胶中进行电泳，并在紫外线transmilluminator下照相。分子量标记物(123bp梯形物，Gibco BRL)包括在所有的凝胶中(J.Rheumatol.1999262517-2522)。
4.流式细胞术洗涤细胞，通过用4％多聚甲醛处理10分钟而使细胞渗透，接着用0.1％皂甙培养10分钟。然后用洗涤缓冲液(含有1％白蛋白，0.1％皂甙和0.1％叠氮化钠的PBS)洗涤细胞。洗涤后，在室温黑暗条件下，用FITC或PE标记的对照单克隆抗体(mAb)，用FITC标记的抗-人IFNγ Ab或用PE标记的抗-人IL-4 mAb处理渗透的细胞达20分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤细胞一次，用PBS洗涤细胞一次，接着在含有1％多聚甲醛的PBS中重悬浮，以便进行流式细胞术分析。
结果萎叶提取物对Th1细胞因子表达的作用图I清楚地表明，正如RT-PCR所测定的，萎叶提取物通过正常人的外周血单核细胞提高了IFNγ mRNA的表达，但对IL-4 mRNA的表达没有影响。换句话说，图I所示的申请人的数据表明，萎叶提取物显著增加了IFNγ特异性的mRNA的合成，且事实上对IL-4 mRNA的合成没有影响。
从图II的流式细胞术的散点图可明显看到，通过PBMC进行的IFNγ合成可在蛋白水平检测到。当用PHA培养PBMC时(图IIA)，仅有0.9％的PBMC对于IFNγ是阳性的。另一方面，当用PHA加萎叶提取物培养PBMC时(图IIB)，有7.1％的PBMC显示出胞内IFNγ。与此相反，当用萎叶提取物培养PBMC时(图IIC & D)，产生IL-4的细胞百分比没有显著的改变。
讨论根据T细胞的细胞因子模式可将其细分成Th1和Th2表型(Mossmann，T.R.，Coffman，RL.Th1和Th2细胞淋巴因子分泌的不同模式导致不同的功能性，Annual Rev.Immunol.1989，7145-73)，其可调节细胞介导和体液引起的免疫应答。炎性免疫应答主要是由IL2& IFN-γ产生过程的Th1细胞群介导的，其可提高细胞免疫(Trinchieri G.白介素-12及其在Th1细胞产生中的作用，Immunol Today 1993；14335-8；Germann，T.，Szeliga，J.，Hess，H等，白介素-12与II型胶原的联合给药在DBA/1小鼠中诱导严重的关节炎，Proc Natl Acad Sci.USA 1995；924823-7)。
因此，我们的试验结果表明萎叶提取物增加了导致细胞免疫提高的Th1型应答。
权利要求
1.一种从人外周血单核细胞中诱导IFNγ的方法，其中所述方法包括下列步骤a)制备萎叶的水提取物，b)制备人外周血单核细胞，c)用萎叶提取物培养hPBMC 18-48小时，d)提取RNA，用于检测胞内细胞因子蛋白的细胞因子特异性RT-PCR或流式细胞术，e)利用IFNγ特异性的已知引物使RNA进行RT-PCR从而获得PCR产物，并f)通过IFNγ的特异性带反映IFNγ的增加。
2.一种从人外周血单核细胞中诱导IFNγ产生的方法，其中所述方法进一步包括下列可选择的步骤a)使所培养的细胞进行IFNγ胞内染色，b)在流式细胞计中分析染色的细胞，并c)使IFNγ阳性细胞至少增加至7倍。
3.一种使用萎叶提取物作为Th1型免疫-调节子的方法，其中所述方法包括a)给予被试者至少5-10mg/ml/kg体重的萎叶提取液，b)至少一天一次给予提取物达至少1个月，c)通过口服或肌内途径给予所述提取物。
4.一种用作Th1型免疫调节子的药物组合物，所述组合物含有与添加剂混合或缔合的有效量的萎叶水提取物或冻干萎叶提取物。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述的冻干提取物是通过用常规方法冷冻干燥水提取物而获得。
6.根据权利要求4所述的组合物，其中所述添加剂选自不会干扰萎叶提取物活性的方式。
7.根据权利要求4所述的组合物，其中所述添加剂选自营养物如蛋白，碳水化合物，糖，滑石粉，硬脂酸镁，纤维素，碳酸钙，淀粉-明胶糊和/或药学上可接受的载体，赋形剂，稀释剂，或溶剂。
8.根据权利要求4所述的组合物，其中所述水提取物，冻干产物或组合物通过口服或肌内给药。
9.根据权利要求4所述的组合物，其中所述口服途径是胶囊剂，糖浆剂，浓缩物，粉剂或颗粒剂的形式。
10.根据权利要求4所述的组合物，其中萎叶提取物与添加剂的比为10-1∶1-10。
11.根据权利要求4所述的组合物，其中萎叶提取物，冻干提取物或含有萎叶提取物的组合物以5-10mg/kg体重的剂量水平至少一天一次给药达1个月。
12.根据权利要求4所述的组合物，其中所述冻干的萎叶提取物具有下列性质i)所述干燥样品是一种可溶于水和二甲基亚砜的深色物质，ii)所述活性物质在正-丁醇∶醋酸∶水＝9∶5∶7的溶剂系统中的薄层色谱显示出5个点，其Rf值分别为0.75，0.64，0.50，0.40和0.33，且iii)使用Intersil ODS-3(4.6×250mm)分析柱，甲醇∶水＝4∶1的溶剂系统，1.0ml/分钟的流速对所述活性物质进行HPLC分析，在217nm处检测，所述物质被分解成11个保留时间分别为2.69，4.27，5.95，6.97，7.49，9.39，11.20，12.40，15.53，18.90和21.49分钟的峰。
13.萎叶提取物或其冻干提取物或含有效量萎叶提取物的组合物用于从人外周血单核细胞中诱导IFNγ或作为Th1型免疫调节子的应用。
14.根据权利要求13所述的应用，其中所述组合物含有与药学上可接受的添加剂缔合或混合的萎叶提取物。
15.根据权利要求13所述的应用，其中所述的添加剂选自不会干扰冻干的萎叶提取物的活性的方式。
16.根据权利要求13所述的应用，其中所述添加剂选自营养物如蛋白，碳水化合物，糖，滑石粉，硬脂酸镁，纤维素，碳酸钙，淀粉-明胶糊和/或药学上可接受的载体，赋形剂，稀释剂，或溶剂。
17.根据权利要求13所述的应用，其中所述水提取物，冻干产物或组合物通过口服或肌内给药。
18.根据权利要求13所述的应用，其中所述口服途径是胶囊剂，糖浆剂，浓缩物，粉剂或颗粒剂的形式。
19.根据权利要求13所述的应用，其中萎叶提取物与添加剂的比为10-1∶1-10。
20.根据权利要求13所述的应用，其中萎叶提取物，冻干提取物或含有萎叶提取物的组合物是以5-10mg/kg体重的剂量水平至少一天一次给药达1个月。
21.一种治疗被试者从而提供Th1型免疫调节的方法，所述方法包括给予被试者药学有效量的萎叶提取物，冻干提取物或含有所述提取物的组合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述组合物含有与药学上可接受的添加剂缔合或混合的萎叶提取物。
23.根据权利要求21所述的方法，其中所述添加剂选自不会干扰冻干的萎叶提取物活性的方式。
24.根据权利要求21所述的方法，其中所述添加剂选自营养物如蛋白，碳水化合物，糖，滑石粉，硬脂酸镁，纤维素，碳酸钙，淀粉-明胶糊和/或药学上可接受的载体，赋形剂，稀释剂，或溶剂。
25.根据权利要求21所述的方法，其中所述水提取物，冻干产物或组合物通过口服或肌内给药。
26.根据权利要求21所述的方法，其中所述口服途径是胶囊剂，糖浆剂，浓缩物，粉剂或颗粒剂的形式。
27.根据权利要求21所述的方法，其中萎叶提取物与添加剂的比为10-1∶1-10。
28.根据权利要求21所述的方法，其中萎叶提取物，冻干提取物或含有萎叶提取物的组合物是以5-10mg/kg体重的剂量水平至少一天一次给药达1个月。
全文摘要
本发明涉及从人外周血单核细胞中诱导IFN γ的应用，其中所述方法包括下列步骤制备萎叶的水提取物，制备人外周血单核细胞，用萎叶提取物培养hPBMC 18－48小时，提取RNA，用于检测胞内细胞因子蛋白的细胞因子特异性RT－PCR或流式细胞术中，利用IFN γ特异性的已知引物使RNA进行RT－PCR从而获得PCR产物，并通过IFN γ的特异性带反映IFN γ的增加。
文档编号A61P37/00GK1514731SQ00820077
公开日2004年7月21日 申请日期2000年12月18日 优先权日2000年12月18日
发明者桑图·班迪奥帕迪亚, 比卡什·帕尔, 萨米尔·巴塔查里亚, 米塔利·拉伊, 凯沙布·钱德拉·罗伊, 巴塔查里亚, 帕尔, 拉伊, 钱德拉 罗伊, 桑图 班迪奥帕迪亚 申请人:科学与工业研究委员会