专利名称：作为胞液型磷脂酶的调制剂的甘油磷酸肌醇衍生物的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及甘油磷酸肌醇在制备用于抑制花生四烯酸释放的治疗药物中的应用，具有甘油磷酸肌醇结构的新衍生物及它们的制备。磷脂酶是催化膜磷脂水解的酶，根据所含的化学键类型，分为磷脂酶A1、A2、B、C、D。
在哺乳动物中，花生四烯酸从磷脂的sn2酯键的活动化主要是由于在大量激动剂(包括激素、神经递质、神经肽和生长因子)诱导受体活化后，胞液型磷脂酶(cytosolic phospholipase)A2(cPLA2)的活化造成的。
关于PLA2通过激动剂-受体相互作用的活化机理，提出了G-蛋白质通过两种不同的机理介导受体诱导的活化(i)直接与PLA2相互作用，因为用百日咳毒素处理降低酶的活性是众所周知的；或(ii)通过磷脂酶C(PLC)活化、由促分裂原活化的蛋白激酶(MAPK)造成的PLA2的磷酸化和活化来间接介导。
在哺乳动物中已鉴定了磷脂酶A2的两种同等型，14 kDa分泌型和85 kDa胞液型(cPLA2)，它们不共有氨基酸序列同源性，并且它们的催化和调节机理不同。胞液型磷脂酶A2位于休眠细胞(例如，血小板和白细胞)的胞液中脂多糖、凝血酶或细胞因子(例如，白介素1β)、肿瘤坏死因子α，而且神经肽如速激肽、缓激肽或神经递质如嘌呤，特别是ATP，以及5-羟色胺能激动剂、肾上腺素能激动剂和毒蕈碱性激动剂通过蛋白激酶C活化酶，使细胞内钙水平上升以及酶的快速磷酸化，并随后转移到质膜，在这里它与磷脂底物结合。这些介质也诱导酶的从头合成(E.Armandiburgermeister，U.Tibes，B.M.Kaiser，W.G.Friebe，W.V.Scheuer，“Suppression of Cytockine Synthesis，integrin expression and chonic inflammation by inhibitors of cytosolicphospholipase A2”Europ.J.Pharmacol.，326(1997)237-250)。
G蛋白、PKC、cPLA2体系的密切互调，以及在生成脂质和脂溶(lysolipid)介质时包含cPLA2(“胞内信号中的甘油磷酸肌醇-4-磷酸酯”(Glycerophosphoinositol-4-phosphate in intracellular signaling)C.P.Berrie，M.Falasca，A.Carvelli，C.Iurisci和D.Corda，in Bioactive Lipids，Vanderbock YY/ed.Plenum Publisching Corporation New York，1998)使PLA2成为具有潜在重要性的药理学目标。
申请人现在最先发现，伴随花生四烯酸的释放而产生的物质，即L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇(GPI)，是一种自体有效物质，另外，通过化学半合成获得并具有下述通式(I)的其钾盐、钙盐和锌盐及其它新衍生物和同系物，通过离体活化的PLA2的负调制对花化四烯酸的释放发挥强有力的抑制作用，可以有效地用于处置由PLA2的活化介导的疾病。
本发明的目的是2、3、4、5、6或1’和2’位选择性地O-取代的甘油基-磷酸基-D-肌醇，其特征在于由下面的通式表示 式中R1’、R2’、R2、R3、R4、R5、R6相互之间相同或不同，可以为H、或C(O)A或B，其中A、B、X、Y和M的含义在后面详细说明。
本发明还涉及L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇(GPI)及其盐，特别是与碱金属或碱土金属，特别是钙的盐，及与锌的盐，及式(I)的新衍生物在制备用于处置通过PLA2的活化或过度活化介导的疾病的药剂中的应用。
本发明另外涉及药物组合物，其含有至少一种式(I)的衍生物作为有效成分，以及适当的赋形剂，该组合物用于处置通过PLA2的活化或过度活化介导的疾病，特别是脓毒性休克及病毒和细菌感染；呼吸器官疾病，如急性肺部损伤(包括新生儿疾病)、慢性阻塞性支气管病(包括哮喘)；皮肤病如牛皮癣、脂溢性皮炎、特异性皮炎，更一般的是皮肤活性不足(dis-reactivity)，也包括UV损伤后的氧化应力；由于细菌感染而对齿龈组织的损害；肠局部缺血；关节病如关节炎和关节痛，包括风湿性关节炎；眼科病、头痛、血管重塑关联的心血管病、肾病及任何与PLA2酶的过度刺激有关，甚至由特异受体和生长因子(如EGF、NGF)、或速激酶(如NK受体)、或嘌呤(例如ATP)如P2Y、或神经肽如蛙皮素或其它与活化PLA2的G蛋白偶联的受体介导的疾病；肿瘤疾病，如前列腺癌或肾癌、或总是依赖于PLA2活化的疾病、疼痛和iperalgesia，中枢和周围神经系统疾病和依赖于鞘磷脂循环的疾病，包括遗传类型如Hermansky-Pudlak和Nieman-Pick综合症；与血管和神经系统间的屏障(如神经束膜和血脑屏障)的损伤有关的疾病，例如神经细胞水肿、中风、脑水肿和脑出血、暂时性脑缺血(TIA，Transient Ischemic Attack)；阿尔茨海默氏病或行为异常如精神分裂症；代谢紊乱疾病如糖尿病；胰腺炎、与摄食异常有关的疾病如食欲过盛、食欲缺乏、恶病质(cachessia)、肥胖症、抑郁症。
以下将详细说明作为能够通过负调制磷脂酶A2、特别是其胞液同等型(cPLA2)的过度刺激，并随后抑制花生四烯酸及其代谢物释放的药剂的式(I)的甘油基-磷酸基-D-肌醇的衍生物及同系物的特征和优点。
本发明涉及下式(I)的化合物、它们的对映异构体、非对映异构体、外消旋体、它们的混合物、它们的水合物及溶剂化物， 式中I)R1’、R2’、R2、R3、R4、R5、R6相互之间可相同或不同，为a)H或基团C(O)A、一元羧酸的非环残基或二元羧酸的emiacylic残基，其中A可以为直链或支链的饱和烷基或含1-4个双键的不饱和的烷基，或单环或多环烷基或烯基、或芳基、芳烷基或含一个或多个杂原子的杂环基；这些基团可以任意被一个或多个基团置换，这些基团选自氧代、羟基、酰胺基、卤素、巯基、烷硫基或烷基二硫基、-COOH，并且这些-COOH任意被中和形成COOM盐，其中M具有与第(II)点中的相同含义；或-基团B，基中B为直链或支链的饱和烷基或含1-6个双键的不饱和烷基；或单环或多环烷基或烯基、或芳基、烷芳基或含一个或多个杂原子的杂环基；这些基团可以任意被一个或多个基团置换，这些基团选自氧代、羟基、酰胺基、卤素、巯基、烷硫基或烷基二硫基、-COOH，并且这些-COOH被任意中和形成-COOM盐，其中M具有与第(II)点中的相同含义
((II)M为具有n+价的药理学容许的无机元素的阳离子、或药理学容许的有机碱的阳离子，其中n具有与下面的第(III)点中相同的含义；(III)n等于1或2或3；(IV)X与Y相互相同或不同，为O或S；以及其中，当Y为S时，式(I)的化合物也包括各自的未中和化合物。
更具体的A的说明i)当A为烷基时，优选为饱和或一元不饱和，并优选含1-8个碳原子，优选2-6个。
ii)当A为单环或多环烷基或烯基时，优选含5-30个碳原子，更优选6-24个碳原子。
当A为芳基、芳烷基或含一个或多个杂原子的杂环基时，优选其含4-15个碳原子，更优选4-8个。杂原子为1-5个，优选1-3个。它们可以是N、O或S，优选N。这些杂原子N可以被药理学容许的有机或无机酸任意中和形成盐。
B的说明i)当B为烷基，优选为饱和或一元不饱和。优选含1-8个碳原子，更优选2-6个碳原子。
ii)当B为单环或多环烷基或烯基时，优选其含5-30个碳原子，更优选6-24个碳原子。
当B为芳基、芳烷基或含一个或多个杂原子的杂环基时，优选含5-15个碳原子，更优选5-8个。杂原子优选为1-5个，更优选为1-3个。它们可以为N、O或S，优选N。这些杂原子N可以被药理学容许的有机或无机酸任意中和形成盐。
M的说明i)当M为药理学容许的无机元素的阳离子时，优选其选自钠、锂、钾、镁、钙、锌、铁、硒、铬、铜。
ii)当M为药理学容许的有机碱的阳离子时，优选为单烷基-、二烷基-、三烷基-或四烷基铵，更优选为N-(2-羟乙基)-二甲基铵，胆碱或氨基酸(优选赖氨酸或精氨酸)的阳离子，或一肽、二肽、三肽和四肽(优选肌肽)的阳离子，或黄嘌呤碱(优选咖啡因)的阳离子。
术语酰胺基优选指乙酰胺基。
术语烷氧基优选指甲氧基、乙氧基或烯丙氧基。
术语卤素优选指氯、氟、溴或碘。
术语芳烷基优选指C7-C9芳烷基，更优选苄基。
术语芳基优选指C6-C12芳基，优选苯基。
术语杂环基优选指饱和或不饱和的5员或6员环基团，或5员或6员环的芳族杂环基。
术语环烷基或环烯基(cycloalkylenic)优选指单环或多环，并优选含5-30个碳原子，更优选6-24个碳原子。
X和Y相互相同或不同，为O或S，并优选相互一致，并优选都为O。
本发明的另一个目的是式(I)的化合物及相关的未成盐产物在处置通过cPLA2的活化或过度刺激介导的疾病，特别是前面所列的疾病中的应用。本发明化合物的制备本发明化合物优选但不限于从L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇(GPI)开始制备；含有硫原子的GPI同系物甘油硫代磷酸肌醇(glycerophosphothioinositol)根据下面实施例中所述的方法，从市售中间体开始制备，或根据文献记载的简单方法制备。GPI是以钾形式出售的已知物质。室温下GPI在水溶液中仅在接近中性的pH值下才稳定。在不同的pH值下，分子发生水解反应并降解。发现下述的制备GPI新型盐的方法在维持GPI结构的稳定性方面有效。
主要从钾盐开始制备下面的新GPI盐，然而这里所述的方法适于从不同盐开始制备工业需求的任何新型盐。制备新型L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇盐(GPI)的一般方法方法I根据美国专利US 5,306,840制备L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇(GPI)的无机和有机盐的一般方法简述如下将起始的盐溶于水或水与有机溶剂的混合物中，然后施加于阳离子交换树脂柱(在4℃温度下以H+的形式产生)上。收集洗脱的GPI酸型溶液并保持在0-4℃，然后用生物学容许的有机或无机阳离子的碱中和(摩尔/摩尔)，得到有关的盐。该溶液可以原样用于随后的制剂操作，或可以在通过真空干燥或冷冻干燥或喷雾干燥而得到纯净干燥的GPI固体盐后加以使用。
制备L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇(GPI)的-OH基烷基化或酰基化的衍生物的一般方法通常从根据美国专利US5,306,840制备的GPI盐开始进行，制备的GPI盐通常为钾盐或与季铵，优选在纯有机溶剂或有机溶剂混合物或有机溶剂与水的混合物中，浓度为10-500mg/ml、优选50-200mg/ml的四丁基铵的盐。其中优选以下有机溶剂丙酮、2-丁酮、甲基异丁基酮、二甲亚砜、环丁砜、二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺、N-甲基-2-吡咯烷酮、吡啶、四氢呋喃、甲基四氢呋喃、乙腈、二甲氧基乙烷、二乙醚、叔丁基甲基醚、乙酸乙酯、氯仿、二氯甲烷、1，1，1-三氯乙烷、甲醇、乙醇、2-丙醇、丁醇。反应在-30℃至120℃、优选5℃至40℃的温度下进行15分钟至48小时，优选1-15小时。
为插入详细说明中第I点所定义的-C(O)A基团、一元羧酸的非环基团或二元羧酸的emiacylic基团，在优选但不限于有机或无机碱的存在下，将GPI与上述酸的活性衍生物反应，这些衍生物优选氯化物、溴化物、混合酸酐、环状酸酐、活性酯如对硝基苯基酯、琥珀酰亚胺基酯、酰基咪唑、O-酰基异脲。这些碱优选碱金属或碱土金属，优选锂、钠、钾、镁、钙的碳酸盐、碳酸氢盐、氧化物、氢氧化物、氢化物和醇盐，三甲胺、三乙胺、三丁胺、四甲基氢氧化铵、四丁基氢氧化铵、吡啶或甲基吡啶。
为插入详细说明中第(I)点所定义的B基团，将GPI与式Z-B(式中Z为卤素)的活性衍生物反应，所述的活性衍生物优选氯化物、溴化物或碘化物，或烷基磺酸盐基，优选甲磺酸盐、苯磺酸盐、对甲苯磺酸盐或三氟甲磺酸盐。GPI与Z-B的反应优选但不限于在无机或有机碱的存在下进行。这些碱优选碱金属或碱土金属，优选锂、钠、钾、镁、钙的碳酸盐、碳酸氢盐、氧化物、氢氧化物、碘化物和醇盐，三甲胺、三乙胺、三丁胺、四甲基氢氧化铵、四丁基氢氧化铵、吡啶或甲基吡啶。
以同样的方式制备GPI的含有S原子的烷基或酰基衍生物甘油硫代磷酸肌醇。
反应收率98％。
产物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇镁盐的化学物理性质如下外观白色粉末分子式 (C9H18H11P)2Mg分子量 690.71元素分析C＝31.3％，H＝5.25％，O＝50.96％，P＝8.97％，Mg＝3.52％在有机溶剂中的溶解度 微溶于有机溶剂在水中的溶剂度 ＞10mg/mlTLC 在硅胶玻璃上施加100微克；显影剂A氯仿/甲醇/水3∶3∶1显影剂B乙腈/水3∶1，喷雾碱性KMnO4(KMnO4basic)-符合GPI标准，没有观察到降解产物。
反应收率98％。
产物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇钙盐的化学物理性质如下外观 白色粉末分子式(C9H18H11P)2Ca分子量706.48元素分析 C＝30.6％，H＝5.14％，O＝49.82％，P＝8.77％，Ca＝5.6/％在有机溶剂中的溶解度 微溶于有机溶剂在水中的溶剂度 ＞10mg/mlTLC 在硅胶玻璃上施加100微克；显影剂A氯仿/甲醇/水3∶3∶1显影剂B乙腈/水3∶1，喷雾碱性KMnO4-符合GPI标准，没有观察到降解产物。
反应收率99％。
产物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇锌盐的化学物理性质如下外观 白色粉末分子式 (C9H18H11P)2Zn分子量 731.78元素分析 C＝29.54％，H＝4.96％，O＝48.1％，P＝8.47％，Zn＝8.93％在有机溶剂中的溶解度 微溶于有机溶剂在水中的溶剂度＞10mg/mlTLC 在硅胶板上施加100微克；显影剂A氯仿/甲醇/水3∶3∶1显影剂B乙腈/水3∶1，喷雾碱性KMnO4-符合GPI标准，没有观察到降解产物。
制备L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇的钠盐将3.7克GPI钾盐(10mmol)溶于35ml蒸馏水中。将溶液在4℃冷却，然后施加于含有15ml阳离子交换磺酸基树脂(以H+型产生，并在4℃恒温)的柱上。然后用15ml蒸馏水洗脱柱子，并在4℃、流过氮气流的条件下收集洗脱液，然后用0.53克碱性碳酸钠中和。过滤、冷冻和真空干燥所得的溶液。
反应收率98％。
产物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇钠盐的化学物理性质如下外观白色粉末分子式 C9H18H11PNa分子量 356.2元素分析C＝30.35％，H＝5.09％，O＝49.41％，P＝8.70％，Na＝6.45％在有机溶剂中的溶解度 微溶于有机溶剂在水中的溶剂度＞10mg/mlTLC 在硅胶板上施加100微克；显影剂A氯仿/甲醇/水3∶3∶1显影剂B乙腈/水3∶1，喷雾碱性KMnO4-符合GPI标准，没有观察到降解产物。
反应收率98％。
产物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇胆碱盐的化学物理性质如下外观粉末分子式 C9H18H11P·C5H14NO分子量 437.37元素分析 C＝38.45％，H＝7.38％，N＝3.20％，O＝43.90％，P＝7.08％在有机溶剂中的溶解度 微溶于有机溶剂在水中的溶剂度 ＞10mg/mlTLC 在硅胶板上施加100微克；显影剂A氯仿/甲醇/水3∶3∶1显影剂B乙腈/水3∶1，喷雾碱性KMnO4-符合GPI标准，没有观察到降解产物。
反应收率 99％。
产物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇赖氨酸盐的化学物理性质如下外观 粉末式 C9H19H11P·C6H14N2O2分子式 C15H33N2O13P分子量 480.40元素分析 C＝37.50％，H＝6.92％，N＝5.83％，O＝43.30％，P＝6.45％在有机溶剂中的溶解度 微溶于有机溶剂在水中的溶剂度＞10mg/mlTLC 在硅胶板上施加100微克；显影剂A氯仿/甲醇/水3∶3∶1
显影剂B乙腈/水3∶1，喷雾碱性KMnO4-符合GPI标准；没有观察到降解产物。
反应收率98％。
产物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇精氨酸盐的化学物理性质如下外观 粉末式 C9H19H11P·C6H14N4O2分子式 C15H33N4O13P分子量 508.42元素分析 C＝35.44％，H＝6.54％，N＝11.02％，O＝40.91％，P＝6.09％在有机溶剂中的溶解度 微溶于有机溶剂在水中的溶剂度＞10mg/mlTLC 在硅胶板上施加100微克；显影剂A氯仿/甲醇/水3∶3∶1显影剂B腈/水3∶1，喷雾碱性KMnO4-符合GPI标准；没有观察到降解产物。
反应收率97％。
产物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇四丁基铵盐的化学物理性质如下外观 粉末式 C9H18H11P·C6H36N分子式 C25H54NO11P分子量 575.69元素分析 C＝52.16％，H＝9.46％，N＝2.43％，O＝30.57％，P＝5.38％在有机溶剂中的溶解度 微溶于有机溶剂，在DMF中≥10mg/ml在水中的溶剂度＞10mg/mlTLC 在硅胶板上施加100微克；显影剂A氯仿/甲醇/水3∶3∶1显影剂B乙腈/水3∶1，喷雾碱性KMnO4-符合GPI标准；没有观察到降解产物。
反应收率90％。
产物L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇钾盐的化学物理性质如下外观 粉末分子式 C23H32O18PK分子量 666.58元素分析 C＝41.44％，H＝4.84％，O＝43.21％，P＝4.65％，K＝5.87％在有机溶剂中的溶解度 在DMF和乙醇中≥10mg/ml。
“将1.0克二酰基硫代甘油基磷酰基-肌醇在氮气氛下悬浮在10ml无水甲醇中。加入50mg叔丁醇钾，并将混合物在20℃下持续搅拌3小时。加入26.7mg乙酸，然后干燥混合物。将残余物溶于10ml冷水中，并用10ml二乙醚萃取。然后丢弃有机层。”将该溶液冷却至4℃，并施加到含有5ml阳离子交换磺酸基树脂(以H+型产生，并在4℃恒温)的柱上洗脱。然后用5ml蒸馏水洗脱柱子，并在流过氮气流的条件下在4℃收集洗脱液，并用0.1M KOH中和至pH为7。过滤、冷冻并真空干燥所得的溶液。
反应收率95％。
产物硫代甘油基-磷酸基-D-肌醇钾盐的化学物理性质如下外观 粉末分子式C9H18O10PSK分子量388.38元素分析 C＝27.84％，H＝4.67％，S＝8.25％，O＝41.20％，P＝7.98％，K＝10.07％
在有机溶剂中的溶解度 微溶于有机溶剂在水中的溶解度 ≥10mg/mlTLC 在硅胶板上施加100微克；显影剂A 氯仿/甲醇/水3∶3∶1显影剂B 乙腈/水3∶1，喷雾碱性KMnO4-Rf＝0.38
将400mg 2，3，4，5，6-五-O-甲氧基甲基-D-肌醇(1mmol)溶于50ml四氢呋喃/二氯甲烷1∶4的混合物中，然后将混合物冷却至-15℃。
加入70mg咪唑和220mg三乙胺，然后缓慢逐滴加入150mg三氯化磷在5ml无水二氯甲烷中的溶液。
将所得的混合物保持搅拌2小时，然后加热至室温，加入10ml三乙基碳酸氢铵并搅拌1小时。相分离后，收集下层，用5ml冷水洗涤两次，蒸发并高真空干燥。
将残余物悬浮在20ml无水吡啶中，然后加入200mg 5，5-二甲基-2-氧代-2-氯-1，2，3-二氧磷杂六环(phosphorinane)及132.2mg D-α，β-亚异丙基基油，然后将混合物在室温下、在惰性气氛中搅拌30分钟。将混合物干燥、蒸发。将残余物悬浮在50ml四氯化碳中，并加入100mg硫；在室温下搅拌30分钟然后真空干燥。将残余物溶于20ml无水甲醇中，并加入100mg对甲苯磺酸。将混合物加热2小时至40分钟，然后冷却至室温，然后在搅拌30分钟的条件下加入2ml水。用碳酸氢铵中和混合物，并干燥。通过制备型色谱，使用氯仿/甲醇/水35∶25∶7的混合物作为显影剂在硅胶柱上进行纯化。收集含有产物的部分并真空干燥。
将残余物溶于5ml水中；将溶液在4℃冷却，并通过5ml阳离子交换磺酸基树脂(以H+型在4℃产生)洗脱。用5ml蒸馏水洗脱柱子，并在流过氮气流的条件下在4℃收集洗脱液，并用0.1M KOH中和至pH为7.0。过滤、冷冻和真空干燥所得的溶液。
反应收率65％。
产物硫代甘油基-硫代磷酸基-D-肌醇钾盐的化学物理性质如下外观粉末分子式 C9H18O10PSK分子量 388.38元素分析C＝27.84％，H＝4.67％，S＝8.25％，O＝41.20％，P＝7.98％，K＝10.07％在有机溶剂中的溶解度 微溶于有机溶剂在水中的溶解度≥10mg/mlTLC 在硅胶板上施加100微克；显影剂A氯仿/甲醇/水3∶3∶1显影剂B乙腈/水3∶1，喷雾碱性KMnO4-Rf＝0.35生物活性按照实施例对化合物编码，并编号如下Es. 化学名L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇钙盐L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇锌盐L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇钠盐L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇钾盐
L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇胆碱盐L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇赖氨酸盐对细胞系体外、及在小鼠中用P物质及其肽P6-11诱导的炎症模型中体内试验了这些化合物。
缩写、试剂和材料激素Gibco(Grand Island，NY)(6H-促甲状腺激素、胰岛素、铁传递蛋白、皮质甾醇、生长激素释放抑制因子、甘氨酰-L-组氨酰(istidil)-L-赖氨酸乙酸盐)。
青霉素Gibeo(Grand Island，NY)根据Ham改进的库恩F-12介质(coon’s F-12medium)Gibco(GrandIsland，NY)链霉素Gibco(Grand Island，NY)NaF、AlCl3Fluka Chem AG(CH)5，6，8，11，12，14，15-3H(N)花生四烯酸Du Pont-NEN(Boston，MA)BSA牛血清清蛋白Sigma A-3311伊文斯蓝(Evan’sBlue)Sigma E-2129甲酰胺Sigma F-7503乙酸乙酯Fluka Chem AG(CH)
PTFE 0.45μm过滤器Costar 130662P物质，SPClinalfa(IT)SP羰基末端肽SP6-11 Sigma S-0772蛋白激酶C，PKC磷脂酶A2，PLA2磷脂酶C，PLC促分裂原活化的PK，MAPK在各种细胞系中评价编码为实施例3、实施例4和实施例4a的L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇自体有效物质对cPLA2诱导的花生四烯酸释放的作用。实验模型细胞培养FRTL5，来自大鼠甲状腺的上皮细胞的细胞系在培养基中生长。简要地说，在37℃、每3-4天更换一次的含5％CO2、95％空气介质的湿气氛下将细胞培养在根据Ham改进的Coon’s F12介质中，该介质补加了5％牛血清、20mM谷氨酰胺和六种激素(6H-促甲状腺激素、胰岛素、铁传递蛋白、皮质甾醇、生长激素释放抑制因子、甘氨酰-L-组氨酰-L-赖氨酸乙酸盐)的混合物。
瑞士(Swiss) 3T3纤维原细胞使用各种刺激物刺激培养基，以释放花生四烯酸依赖cPLA2的机理，例如ATP、肥大脱粒肽(肥大脱粒肽)、蛙皮索；不依赖cPLA2的机理，例如Ca2+离子载体、离子霉素(离子霉素)。试验花生四烯酸的释放首先将细胞用各种浓度的待检化合物温育60分钟，或用预定的100μM浓度温育各种时段(15-180分钟)，用加有10mM Hepes和0.2％BSA(不存在游离脂肪酸)、pH7.4的HBSS(Hank’s平衡盐溶液，存在Ca2+和Mg2+离子)洗两次，并在37℃下在所述的缓冲液中用100μM ATP刺激10分钟。收集上清液放入测定用闪烁池(scintillationcuvettes)中。结果表达为[3H]-花生四烯酸的总释放量的百分比。结果编码为实施例4a进行评价的化合物显示，在进行试验的所有细胞系中以依时和依浓度方式减少花生四烯酸的释放，所述的花生四烯酸的释放由cPLA2的活化诱导(表1、2、3、4、5)。
编码为实施例3和实施例4的化合物显示更为强烈的效果(表6)。
相反，实施例4a的化合物不能减少由与cPLA2无关的刺激物(如钙离子载体)诱导的花生四烯酸的释放(表7)。
总之，报告的数据显示，实施例4a及实施例3和实施例4的化合物能够限制花生四烯酸的释放，依据的机理是由胞液型cPLA2的活化途径(换句话说，是花生四烯酸代谢中的主要途径)的负调制所特异介导。
表1在用ATP刺激的FRTL5细胞中，在实施例4a化合物的存在下，花生四烯酸释放抑制的时程
用100μM实施例4a的化合物温育预加载的细胞不同的时段，然后用ATP(100μM)刺激10分钟。结果表达为3个独立实验的两点的平均值±SE(标准偏差)。在对应的时段中，对照细胞的刺激一般为基本值的4-5倍。
表2实施例4a的化合物诱导对从用ATP刺激的FRTL5细胞释放花生四烯酸的抑制
用各种浓度的实施例4a化合物预温育预加载的细胞60分钟，然后用100μM ATP刺激10分钟。结果表达为3个独立实验的两点的平均值±SE。
表3实施例4a化合物抑制从用ATP刺激的Swiss 3T3纤维原细胞释放[3H]-花生四烯酸
用各种浓度的实施例4a化合物预温育预加载的细胞60分钟，然后用100μM ATP刺激10分钟。结果表达为3个独立实验的两点的平均值±SE。
表4实施例4a化合物减少Swiss 3T3纤维原细胞中[3H]-花生四烯酸的肥大脱粒肽-依赖性释放
用各种浓度的实施例4a化合物预温育有放射标记的预加载细胞60分钟，然后用100μM肥大脱粒肽刺激10分钟。结果表达为3个独立实验的两点的平均值±SE。
表5实施例4a化合物减少Swiss 3T3纤维原细胞中[3H]-花生四烯酸的蛙皮素-依赖性释放
用各种浓度的实施例4a化合物预温育预加载细胞60分钟，然后用蛙皮素刺激10分钟。结果表达为3个独立实验的两点的平均值±SE。
表6实施例4a化合物不能抑制FRTL5细胞中由离子霉素诱导的[3H]-花生四烯酸的释放
用各种浓度的实施例4a化合物预温育预加载细胞60分钟，然后用10μM离子霉素刺激30分钟。结果表达为3个独立实验的两点的平均值±SE。
对由P物质的肽P6-11及P物质诱导的局部炎症的保护活性的评价。实验模型通过将保持在正常状态的光/暗循环中并“随意”进食的约20-22克的雌性balb/c小鼠暴露在乙醚饱和的气氛中将其麻醉。然后将动物分成4组，每组10只。
通过在左耳廓中皮下注射P物质(1pmol/3μl)或其肽片段P6-11(1pmol/3μl)诱导毛细管渗透性；对照是注射了盐溶液(Mazzari等，Eur.J.Pharm.1996)。
小鼠耳廓中的血浆外渗。
P物质或P6-11肽后立即对小鼠静脉内注射Evan’s Blue(100mg/kg)，2小时后将其杀死。然后通过将注射的耳廓在2ml甲酰胺中均质化(Polytron均化器)提取染料。然后将均质化的组织在50℃温育2小时。根据Saria和Lunberg方法(1983)，以Evan’s Blue在620nm(A620)的光密度测定血浆外渗。化合物的溶解和给用在毛细管渗透前30分钟，将实施例中所述的化合物溶解在0.9％盐溶液中，并以0.5-5mg/kg的剂量静脉内注射进行给药。结果P物质诱导的外渗是由于肥大细胞和血管内皮细胞的双重活化机理，而P物质片段-肽P6-11仅仅是由于通过与NKI受体的相互作用对内皮的作用引起外渗(“Role of the N-terminal arginine in thehistamine releasing activity of substance P，bradikinin and relatedpeptides”；Deviller P.，Drapeau G.，Renoux M.，Regoli D.，Europ.J.Pharmacol.168(1989)53-60)。
所有试验化合物均显著减少由肽P6-11诱导的毛细管渗透性，而对于SP诱导的渗透性效果不明显(表9)。
特别地，实施例5a中GPI的钾盐限制由P物质的片段P6-11诱导的外渗。
表7编码为实施例4a和6的化合物限制由P6-11诱导的外渗
Student-Newman-Keuls检验*p＜0.05对第1组；·p＜0.05对第2组；p＜0.05对第6组。
表8编码实施例4a的化合物对由P6-11诱导的外渗的依剂量效果
Student-Newman-Keuls检验*p＜0.05。
表9L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇钾盐(实施例4a)和L-α-甘油基-磷酸基-D-肌醇钙盐(实施例2)对P物质诱导的外渗的效果
报告的事实显示，本发明的化合物限制由P物质的末端肽P6-11诱导的血浆蛋白外渗。肽P6-11诱导通过上皮细胞外渗蛋白质，所按照的机理是称为NKI的neurokin受体介导的特异机理。必须记住NK1、NK2和NK3受体分别介导内生腺体SP、NKA和NKB的信号，所有的这些腺体识别SP的末端部分与肽P6-11的比例。
总之，本发明的试验化合物能够负调制cPLA2，从而限制了与花生四烯酸代谢有关的活动的级联反应。另外，本发明的化合物能够限制由各种刺激物(如ATP)诱导的cPLA2的活化及在屏障渗透性(barrierpermeability)变化的部位存在的花生四烯酸的浓度的增加，所述的部位如外围神经系统的血管-神经束膜，及中枢神经系统的血脑屏障。
本发明的化合物还调制通过蛙皮素受体介导的cPLA2活化，这与食物摄取失调有关，由此可以有助于处置由这样的疾病机理介导的疾病，例如食欲过剩、食欲减退、肥胖症和恶病质。
另外，本发明的化合物能够进一步调制体内模型的NK-1受体的刺激。
因此，本发明的化合物可以作为处置由cPLA2的活化或过度刺激介导的疾病(如前述列举的那些)的有效治疗工具。
给药剂量、时间和方式将根据疾病或变种的类型、阶段、严重性和表现区域或在人或兽保健中的最终应用来选择，对于3-90天的每一疗程在0.1-100mg/kg之间。对于提到的所有疾病，在所有情况下不仅有全身、肠胃外、口和直肠给药，而且也可局部、经皮给药，以便获得有效物质的最高利用率。对于口服制剂，主要是以片剂、糖衣片剂和胶囊给药，但也可以粉剂和含有喷雾剂的溶液/悬浮液给药。
对于局部处置，优选与皮肤和粘膜(包括齿龈粘膜)使用适合的凝胶、霜剂和溶液，以及用于在结膜囊给药的滴眼药。
注射型是用适合药用的溶剂调制的，适于静脉内、肌肉和皮下给药。
相同的有效化合物可以适当浓度调制为口服补剂，用在人和兽药中，用于预防或辅助处置与活性缺乏状况有关的异常。
下面是药物制剂和美容制剂的一些例子，它们仅是说明性的，不是限制。
实施例A-片剂有效成分实施例6 100mg赋形剂微晶纤维素 160mg淀粉 28mg乳糖 100mg硬脂酸 6.0mg实施例B-注射剂小瓶1有效成分实施例4，冻干品50mg小瓶2赋形剂 二水合磷酸氢二钠 12mg二水合磷酸二氢钠 1mg氯化钠32mg注射用水 加至4ml实施例C-油包水型局部用霜剂％mg有效成分实施例7 2赋形剂 Twin60 0.5Polwax 2.5鲸蜡基硬脂醇(Cetylstearylalcohol) 2卡波姆凝胶(Carbomer) 0.5TEA(三乙醇胺) 0.5甘油 3防腐剂1水加至100mg
权利要求
1.通式(I)的化合物 它们的对映异构体、非对映异构体、外消旋体，它们的混合物、它们的水合物和溶剂化物，其中I)R1’、R2’、R2、R3、R4、R5、R6相互之间可相同或不同，为a)H或基团C(O)A、一元羧酸的非环残基或二元羧酸的emiacylic残基，其中A可以为直链或支链的饱和或含1-4个双键的不饱和烷基，或单环或多环烷基或烯基、或芳基、芳烷基或含一个或多个杂原子的杂环基；这些基团可以任意被一个或多个基团置换，这些基团选自氧代、羟基、酰胺基、卤素、巯基、烷硫基或烷基二硫基、-COOH，并且这些-COOH可任意被中和形成COOM盐，其中M具有与第(II)点中的相同含义；或-基团B，其中B为直链或支链的饱和烷基或含1-6个双键的不饱和烷基；或单环或多环烷基或烯基、或芳基、芳烷基或含一个或多个杂原子的杂环基；这些基团可以任意被一个或多个基团置换，这些基团选自氧代、羟基、酰胺基、卤素、巯基、烷硫基或烷基二硫基、-COOH，并且这些-COOH可被任意中和形成-COOM盐，其中M具有与第(II)点中的相同含义(II)M为具有n+价的药理学容许的无机元素的阳离子、或药理学容许的有机碱的阳离子，其中n具有与下面的第(III)点中相同的含义；(III)n为1或2或3；(IV)X与Y相互相同或不同，为O或S；以及其中，当Y为S时，式(I)的化合物也包括各自的未中和化合物。
2.权利要求1所述的化合物，其中M为具有n+价的a)生物学容许的无机阳离子或b)生物学容许的有机阳离子，其中n为1或2或3。
3.权利要求1所述的化合物，其中a)当A为烷基时，优选为饱和或一元不饱和，含1-8个碳原子，优选2-6个碳原子；b)当A为单环或多环烷基或烯基时，含5-30个碳原子，优选6-24个碳原子；c)当A为芳基、芳烷基或含一个或多个杂原子的杂环基时，其含4-15个碳原子，优选4-8个，含杂原子1-5个，优选1-3个，杂原子选自N、O或S，优选N；d)当B为烷基时，为饱和或一元不饱和，含1-8个碳原子，优选2-6个碳原子；e)当B为单环或多环烷基或烯基时，含5-30个碳原子，优选6-24个碳原子；f)当B为芳基、芳烷基或含一个或多个杂原子的杂环基时，含5-15个碳原子，优选5-8个，含杂原子1-5个，优选为1-3个，杂原子选自N、O或S，优选N。
4.权利要求2所述的化合物，其中M为a)生物学容许的无机阳离子，选自铬、硒、铜、碱金属元素、碱土金属元素、Zn和Fe；b)药理学容许的有机碱的阳离子，优选选自单烷基-、二烷基-、三烷基-或四烷基铵，优选N-(2-羟基)二甲基铵，胆碱的阳离子，或氨基酸的阳离子，其中氨基酸优选赖氨酸或精氨酸，或一肽、二肽、三肽和四肽的阳离子，或黄嘌呤碱的阳离子，其中黄嘌呤碱优选咖啡因。
5.权利要求1-4的任一项所述的化合物，用于处置由cPLA2的活化或过度刺激介导的疾病。
6.权利要求1-4的任一项所述的化合物及它们的非盐化衍生物的应用，是用于制备处置由cPLA2的活化或过度刺激介导的疾病的药物组合物。
7.权利要求6所述的应用，是用于处置与生长因子EGF或NGF和/或NK-1受体和/或与活化cPLA2的G蛋白偶联的受体，如ATP受体和/或蛙皮素受体的过度刺激有关的疾病。
8.权利要求6或7所述的应用，是用于处置心原性和脓毒性休克及病毒或细胞感染。
9.权利要求6或7所述的应用，是用于处置呼吸器官疾病，如包括新生儿疾病的急性肺部损伤、包括哮喘的慢性阻塞性支气管病。
10.权利要求6或7所述的应用，是用于处置皮肤疾病，如牛皮癣、脂溢性皮炎、特异性皮炎，更一般的是皮肤活性不足，也包括UVB损伤后的氧化应力；以及眼科疾病，如青光眼和结膜炎。
11.权利要求6或7所述的应用，是用于处置肿瘤疾病，如前列腺和肾癌，或总是依赖cPLA2的活化的疾病，以及肾病。
12.权利要求6或7所述的应用，是用于处置由于细菌感染引起的齿龈组织异常，以及肠局部缺血中的粘膜损伤。
13.权利要求6或7所述的应用，是用于处置关节病，如关节炎和关节痛，包括风湿性关节炎。
14.权利要求6或7所述的应用，是用于处置偏头痛和头痛、疼痛和痛觉过敏。
15.权利要求6或7所述的应用，是用于处置心脏病症，以及与血管重构有关的心血管病。
16.权利要求6或7所述的应用，是用于处置与炎症有关的外围神经系统疾病，或毒剂-代谢不良神经病，以及用于处置中枢神经系统疾病如阿尔茨海默氏病，行为异常如精神分裂病、抑郁症，医原性损伤引起的疾病、或毒剂如可卡因引起的疾病，以及与鞘磷脂循环有关的皮肤机能失调或异常，包括遗传型，如Hermansky-Pudlak和Nieman-Pick综合症。
17.权利要求6或7所述的应用，是用于处置与血管与神经系统间的屏障如神经的束膜的损伤有关的疾病，以及与血脑屏蔽的损伤有关的疾病，如神经水肿、中风、脑水肿和出血，暂时性脑缺血(TIA)。
18.权利要求6或7所述的应用，是用于处置与食物摄物紊乱有关的疾病，如食欲过剩、食欲缺乏、恶病质、肥胖症。
19.权利要求6或7所述的应用，是用于处置代谢失调疾病，如糖尿病和胰腺炎。
20.组合物，含有权利要求1-4的任一项所述的至少一种衍生物作为有效成分，以及含有药用容许的赋形剂。
21.权利要求20所述的组合物，适合经口给药、肠胃外给药、直肠给药、舌下给药、静脉内给药、肌肉内给药、皮下给药、局部给药、真皮内给药、经皮给药。
22.权利要求21所述的组合物，其中局部途径为皮肤或眼内。
23.权利要求21所述的组合物，其中经口给药的剂型为粉剂、片剂、丸剂、胶囊、微粒、悬浮液，或基于冷冻干燥的起始物的制剂，如干糖浆。
24.权利要求21所述的组合物，其中肠胃外给药的剂型为以冷冻干燥的化合物为起始物的临时注射剂。
25.权利要求21所述的组合物，其中局部给药的剂型为霜剂、软膏、凝胶、冷冻干燥的粉剂、溶液或喷雾剂型。
26.权利要求6-20的任一项所述的应用，其中药物用于兽用。
27.权利要求6-20的任一项所述的应用，其中，根据疾病或异常的类型、阶段、严重性和现病间隔并根据人或兽应用，这样的处置包括用3-90天的每一疗程含有0.1-100mg/kg有效成分的处置。
全文摘要
本发明提供O位任意取代的甘油磷酸肌醇衍生物，它们的类似物及它们的盐，其中取代基R1’、R2’、R3、R4、R5、R6具有所述的含义。并提供它们的合成及它们作为cPLA2的活化或过度刺激的调制剂的药理学效果。
文档编号A61P37/00GK1455779SQ00820007
公开日2003年11月12日 申请日期2000年11月7日 优先权日2000年11月7日
发明者达妮埃拉·科尔达, 罗伯托·达尔托索, 焦万纳·邦文托, 加布里埃利·马尔科隆戈, 伦佐·达尔蒙特 申请人:I·R·B·生物技术研究院有限公司