专利名称：细胞增殖抑制蛋白质、多核苷酸、与多核苷酸对应的反义核苷酸,以及细胞增殖抑制剂、癌 ...的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及对作为癌症等细胞无限增殖化的原因的疾病的治疗和对诊断有效的基因信息及其使用。更详细地讲，本发明涉及通过在包括癌细胞在内的无限增殖化细胞中表达、抑制该细胞增殖，对癌症等疾病的治疗有用的蛋白质的基因信息及其使用。特别是本发明涉及编码在包括癌细胞在内的无限增殖化细胞中表达少、或正在消失的细胞增殖抑制蛋白质的基因，以及将它们作为论断试剂或治疗药的使用。
背景技术：
人的正常细胞非常难于无限增殖化，逐渐老化。人正常细胞遵循细胞分裂次数计数机制(老化机制)，命运注定要老化的。通常从生物体组织采集的原代细胞通过20～80次反复传代培养(分裂)，逐渐丧失增殖能力，表现出老化状态。如果细胞老化，细胞就会变大、变得扁平，对细胞外基质成分的变化、促进有丝分裂的物质的刺激没有响应，以及表现出象生长调节基因表达的功能减退那样的一些形态学和生物化学的变化，分裂停止，所以细胞老化容易判断。
然而，通过在传代培养中进行致癌剂处理、放射线照射处理等，极少一部分细胞会逃避细胞老化继续增殖，形成集落。通过这样操作获得无限增殖能力(或老化机制破坏了)的细胞有可能连续培养，即使经过一定的细胞世代数也不会灭绝，所以称之为「无限增殖化细胞」。
如果将正常细胞和无限增殖化细胞融合，生成的杂种细胞显示出有限分裂能力。另外即使在无限增殖化细胞之间进行融合，也能得到显示出有限分裂能力的杂种细胞。人细胞中的无限增殖化相对于老化从遗传学来说是劣性遗传，这表明与细胞分裂次数计数机制有关的某一特定基因(无限增殖化抑制基因)的缺损、或功能的丧失对细胞的无限增殖化是必要的。
另外由人正常细胞直接制作癌细胞并不容易，细胞的无限增殖化和癌化之间存在密切关系。通过在培养条件下使细胞癌化的实验体系已经阐明了人正常细胞逃避对增殖有很强反作用的老化机构，变化到可无限增殖的无限增殖化阶段，然后比较容易地经许多阶段变异到癌化阶段。例如即使使所谓的变异p53和变异Rb基因等癌基因在人正常细胞中表达，不仅不能癌化，而且也不能无限增殖化，一旦成为无限增殖化细胞通过上述的癌基因容易进行癌化(Namba，M.et a1.，Crit.Rev.Oncogen.，719-31，1996)。这一现象强烈地暗示出在细胞的癌化过程中，细胞的无限增殖化是重要的阶段，因此无限增殖化阶段的解析对了解人细胞的致癌机理非常重要。
作为癌细胞中的增殖抑制因子有网膜芽细胞瘤的Rb基因、大肠癌的p53基因、Wilms肿瘤的WT基因等10多种。其中特别适用的增殖抑制因子是p53，已经开始使用p53进行基因治疗(Li，H.etal.，Clinical Cancer Res.，5,637-642，1999)，既然细胞的无限增殖化与癌化有关，不仅癌抑制基因，而且无限增殖化抑制基因对细胞增殖抑制也都可能成为癌症的有效治疗方法。
现在已经报道的与细胞老化和无限增殖化有关的基因有Sdil(Noda，A.et al.，Exp.Cell Res.，21190-98，1994)、SEN6(Banga，S.S.et al.，Oncogene，14313-321，1997)、SEN6A(Sandhu，A.K.et al.，Oncogene，12247-252，1996)、ING1(Garkavtsev，I.andRiabowol，K.，Mol.Cell.Biol.，172014-2019，1997)、Hic-5(Shibanuma，M.et al.，Mol.Cell.Biol.，171224-1235，1997)等，这些基因和人细胞的老化、无限增殖化以及癌化之间的关系尚未阐明。
本发明鉴于上述情况，对无限增殖化抑制基因的全长cDNA进行鉴定，目的在于提供与该无限增殖化抑制基因有关的信息和它编码的蛋白质的功能的信息。
另外开发上述基因和上述蛋白质论断试剂和/或治疗药的用途也是本发明的目的。
本发明人为了解决上述课题进行潜心研究，对编码在包括癌细胞在内的细胞中表达低下、或正在消失的蛋白质的无限增殖化抑制基因进行分离，对包括编码有350个氨基酸序列的蛋白质(序列1)的1050bp的翻译区(序列2)相对应的DNA序列在内的多个多核苷酸进行了鉴定。另外发现序列表中的序列1记载的上述蛋白质具有细胞增殖抑制活性。
另外本发明人发现无限增殖化抑制基因可作为癌症等无限增殖化细胞为原因的疾病诊断中有用的标准参照物，可以表达对癌症等疾病治疗有效的蛋白质的基因信息，直至完成本发明。
即本发明可以提供以下1～2记载的蛋白质和多核苷酸。
1.由在序列表中的序列1记载的氨基酸序列中进行取代、缺失或附加一个或数个氨基酸后形成的氨基酸序列构成，而且具有细胞增殖抑制活性的蛋白质。
2.在从序列表中序列2记载的DNA序列、序列3记载的DNA序列和序列4记载的DNA序列中选择出来的DNA序列中取代、缺失或附加一个或数个DNA后的DNA序列构成的，且具有细胞增殖抑制活性的多核苷酸。
另外本发明也提供与以下3～5记载的任一个DNA序列相对应的反义DNA、或含有与3～5记载的任一个DNA编码的RNA相对应的反义RNA或其衍生物的反义多核苷酸。
3.序列表中序列2记载的DNA序列。
4.序列表中序列3记载的DNA序列。
5.序列表中序列4记载的DNA序列。
另外本发明也提供由以下6～9中记载的蛋白质或多核苷酸构成的细胞增殖抑制剂或癌症治疗剂。
6.含有序列表中序列1记载的氨基酸序列的蛋白质。
7.含有序列表中序列2记载的DNA序列的多核苷酸。
8.含有序列表中序列3记载的DNA序列的多核苷酸。
9.含有序列表中序列4记载的DNA序列的多核苷酸。另外本发明还提供癌症论断试剂，其特征是用上述1或6记载的蛋白质作为标准参照物。
另外本发明还提供癌症论断试剂，其特征是用上述7～9中任一项记载的多核苷酸作为标准参照物。
另外本发明还提供基因治疗用组成物，其特征是用上述7～9中任一项记载的多核苷酸作为治疗基因。
上述基因治疗用组成物中，理想的是在病毒载体中含有治疗基因，更理想的是该病毒载体是腺病毒载体。
最后本发明还提供癌细胞的识别方法，其特征是提供针对由序列表中的序列1记载的氨基酸序列构成的蛋白质的被荧光标记的抗体，用该抗体对怀疑是癌细胞的细胞进行染色，然后测定有无荧光发色。
附图的简单说明
图1表示对本发明使用的REIC(Reduced Expression inImmortalized Cell)蛋白质和hDkk3和RIG7-1蛋白质的同源性进行比较的序列对比图。
图2为了比较各种人细胞株中的REIC基因的表达而进行的Northern blotting结果的放射自显影照片图。
图3表示本发明使用的表达质粒REIC/pTracer构建的模式图。
图4表示3H胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到本发明的无限增殖化KMST-6细胞的实验结果。
图5表示3H胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到本发明的Saos2骨肉瘤细胞的实验结果。
图6表示本发明使用的表达质粒REIC/pGEX-2T构建的模式图。
图7利用免疫荧光法对KMS-6进行双重染色结果的照片。
图8表示实施例10中得到的553bp的扩增产物的电泳照片。
图9是人11号染色体图。该图谱中表示了11p15中报告的各种癌组织中的LOH频率(％)和相应于各个LOH的STS基因组标准参照物名。与LOH频率一起表示的癌组织分别是B(乳腺癌)、G(食道癌)、H(胃癌)、HN(肝细胞癌)和P(前列腺癌)。
图10对本发明涉及到的REIC基因和图9表示的标准参照物D11S288的同源性进行比较的序列对比图。
图11A是表示研究在一群非小细胞肺癌患者的组织中REIC基因表达的Northern blotting结果的放射自显影照片图。「N」表示非癌组织。「T」表示癌组织。
图11B是表示研究在一群肝细胞癌患者的组织中REIC基因表达的Northern blotting结果的放射自显影照片图。「N」表示非癌组织。「T」表示癌组织。
图11C是表示研究在食道癌患者的组织中REIC基因表达的Northern blotting结果的放射自显影照片图。「N」表示非癌组织。「T」表示癌组织。
图11D是表示研究在几个胃癌患者的组织中REIC基因表达的Northern blotting结果的放射自显影照片图。「N」表示非癌组织。「T」表示癌组织。
图11E是表示研究在几个大肠癌患者的组织中REIC基因表达的Northern blotting结果的放射自显影照片图。「N」表示非癌组织。「T」表示癌组织。
图12是表示在来自肝癌的各种细胞株中进行REIC基因的RFLP解析的Sothern blotting结果的放射自显影照片图。
图13A是表示研究在KMS-6的细胞周期中REIC基因表达量变化的Northern blotting结果的放射自显影照片图。
图13B是表示研究在与图13A同样的KMS-6的细胞周期中3H胸腺嘧啶脱氧核苷掺入到KMS-6的实验结果图。
图14是表示比较在TGF-β存在或不存在下，REIC基因表达量变化的Northern blotting结果的放射自显影照片图。
图15表示本发明中使用的质粒pUC119/REIC的构建模式图。
图16表示本发明中使用的质粒pAxCAwt的构建模式图。
图17表示本发明中使用的质粒pAxCAREIC的构建模式图。
图18表示为了制作本发明使用的腺病毒对腺病毒进行处理的模式图。
实施发明的最佳方案以下就本发明的构成以及优选的实施方案进行详细说明。
在本说明书中按照IUPAC、IUB的规定、「包括碱基序列或氨基酸序列在内的说明书制作指导书」，用各种省略符号表示氨基酸、蛋白质、DNA序列和核酸等。
另外在本说明书中使用的「多核苷酸」具体化为单链和双链的基因组DNA、cDNA、mRNA和cRNA等各式各样的形式。
另外在本说明书中，没有特别指定，DNA(包括cDNA)指的是由有义链和反义链两条链构成的DNA，RNA指的是单链RNA，反义DNA或反义RNA指的是由一条链构成的DNA或RNA。
还有在本说明书中所谓的「无限增殖化抑制」用语有时与「细胞增殖抑制」的意思相同。另外在本说明书中的「无限增殖化细胞」用语也用于癌细胞。
另外「反义多核苷酸」虽然包括在多核苷酸中，但在本说明书中特别明确指出该多核苷酸是反义链时表示为反义多核苷酸。(无限增殖化抑制基因和蛋白质)在本发明中使用的无限增殖化抑制因子之一是由编码具有细胞增殖抑制活性的序列表中序列1记载的350个氨基酸序列组合物蛋白质的DNA序列构成的，分离且纯化的多核苷酸(序列2)。另外本发明有关基因包括由序列3或序列4记载的DNA序列构成的多核苷酸。本发明有关基因还包括由对序列表中的序列2、序列3和序列4中记载的任一个DNA序列进行取代、缺失或附加一个或多个核苷酸修饰后的DNA序列构成的多核苷酸。
当使由序列1记载的氨基酸序列组合物蛋白质在体内或体外产生用于本发明时，在通过序列2、3、或4记载的DNA序列构成的多核苷酸的表达中并没有限定，可以对与构成上述氨基酸序列的各个氨基酸相对应的任意的密码进行组合，作为本发明有关基因在密码使用频率不同的各种各样的宿主中有效地进行表达。因此除了上述定义的多核苷酸以外随意含有这样的简并密码的基因也包括在本发明有关基因范围内。
本发明上使用的细胞增殖抑制蛋白质(以下也称之为本发明涉及到的蛋白质、或REIC蛋白质)不但包括由序列1记载的氨基酸序列构成的蛋白质，而且还包括实质上保持与该蛋白质的细胞增殖抑制活性同样活性的，而且具有通过取代、缺失或附加等使序列1记载的氨基酸序列中的任一个或多个氨基酸改变的氨基酸序列的该蛋白质的变异体。这些变异体包括典型的天然的等位(allele)变异和异种动物之间的变异，与序列1记载的氨基酸序列具有很高的同源性。在本发明中编码上述变异体的所有多核苷酸的DNA序列也是相应于这些氨基酸序列改变得到的。所期望的DNA序列的改变可以通过位置特异的突变等同行人都知道的方法实施。
由序列1记载的氨基酸序列组合物蛋白质是作为与非洲爪蟾(Xenopus)的Dkk1蛋白质(xDkk1)的人同源hDkk3蛋白质报道的(Krupnik，V.E.et al.，Gene 238，301-313，1999)。据报道xDkk1是在非洲爪蟾的胚胎中具有强烈的头部诱导功能，Superman(シュペ-マン)形成体中的分泌型蛋白质，参与胚胎的分化、头部形成，是分泌型信号分子Wnt家族(Cadiga，K.M.and Nusse，R.，GenesDev.11，3286-3305，1997)的信号传递抑制因子。另外Krupnik等人进一步报道在人Dkk家族(hDkk1～4)中，hDkk1和hDkk4具有Wnt家族信号传递系统的Wnt活性的抑制活性，而hDkk3没有Wnt活性的抑制活性。已有报道(Cadigan上述报道)Wnt家族蛋白质是与癌症有关的基因。然而Krupnik等人的报道没有涉及到hDkk3和Wnt家族蛋白质之间的关系。因此在本发明以前有关hDkk3蛋白质与细胞无限增殖化或癌化的有关的报道一点也没有。
另外作为与由序列1家族的氨基酸序列组合物蛋白质和序列2家族的DNA序列构成的多核苷酸具有同源性的分子报道了在人神经胶质瘤细胞中表达低下的RIG蛋白质(Ligon，A.H.，etal.，J.NeuroVirology 4，217-226，1998)。然而RIG蛋白质与由序列1家族的氨基酸序列组合物蛋白质之间的同源性低，与本发明涉及到的后者蛋白质无论是功能还是结构也不同。(无限增殖化抑制基因在各种细胞株中的表达)本发明有关基因由于是无限增殖化抑制基因，所以可以预料在人各种细胞中都可表达。因此为了研究在各种人癌细胞和无限增殖化细胞中的表达，在从肺癌、肝癌、淋巴瘤、骨肉瘤等各种组织得到的10种人癌细胞株中在9株人癌细胞和1株人无限增殖化细胞株中表达消失，而在3株人无限增殖化细胞株中表达减少。另外对在人无限增殖化细胞中使本发明有关基因强制表达时，发现该细胞的增殖被有意义地抑制了。因此，很显然本发明有关基因具有抑制这些细胞增殖的活性。(染色体上的定位)对本发明有关基因在染色体上定位时，该基因被定位于人11号染色体的短臂15(11p15)。据报道在11p15区域内存在Beckwith-Wiedemann综合征、多巴受体D4、血红蛋白的β链、镰刀形贫血病、vfk inhiniyot p57kip2、H-ras、IGF-II、胰岛素、QT延长综合征、肾上腺皮质癌、Wilms肿瘤2、横纹肌肉瘤、乳酸脱氢酶、涅-皮病、肾上腺甲状腺激素、阿-蒂综合征等致病基因。另外有报道说在非小细胞肺癌、肝癌、胃癌、食道癌、头颈部癌、前列腺癌、卵巢癌等各种固体癌中11p15上染色体不稳定(Lalande，M.，Annu.Rev.Genet.，30，173，1997；Feinberg，A.P.，Cancer Res.，59，1743-1746，1999)。而据报道向来自肺腺癌、横纹肌肿瘤的细胞株中导入人染色体DNA的实验中，癌抑制基因定位于11p15上(O’Briant，K.，et al.，Anticaneer Res，17，3243-3251，1997；Reid，L.H.，et al.，Hum.Mol.Genet.，5，239-247，1996)。这些报告认为loss of heterozygosity(LOH)、基因组近交等染色体的不稳定性造成本发明有关基因的表达低下，这作为一个原因诱导细胞癌化的可能性。另外也清楚地表明该基因不仅是细胞的无限增殖化抑制基因，也是癌抑制基因。(无限增殖化抑制基因的获得)本发明有关基因根据本说明书中公布的DNA序列信息运用基因工程技术(例如，Molecular Cloning 2nded.，Cold Spring HarborLaboratory Press1989)可以获得。
实际上本发明有关基因就象实施例描述的那样可以利用Representational DifferenceAnalysis(RDA)法对在正常细胞中高效表达，而在无限增殖化细胞中低表达的基因的cDNA进行浓缩、选择获得。另外从通过分子量大小分级、oligocapping法或Race法等制备的长链cDNA文库中也可以有选择地获取基因的全长cDNA。具体来说，按照RDA法从老化的正常细胞KMS-6细胞和无限增殖化细胞KMST-6细胞的cDNA中可以获得在无限增殖化细胞中表达低下的至少为266bp的新的cDNA。本发明有关基因所包含的同源性可以以各种无限增殖化细胞和作为其亲本株的正常细胞为材料通过同样的处理得到。同行人选择作为材料所必需的细胞株是很容易的。
利用以上述那样得到的基因片段的DNA序列为基础制备成任意序列、任意长度的特异探针，通过菌落杂交、噬斑杂交等对人心脏cDNA文库进行筛选，可以分离出含有无限增殖化抑制基因的cDNA。另外对通过oligo capping(オリゴキヤツピング)法制备的人心脏cDNA文库进行同样的筛选，也可以分离出含有无限增殖抑制基因的cDNA。
另外从例如市售的各种人cDNA文库以及各种培养细胞、组织按照常规方法也可以从制备的cDNA文库中分离出所期望的cDNA克隆。另外以上述基因片段的DNA序列相对应的氨基酸序列为基础，使用抗该序列的特异抗体，利用免疫学上的筛选方法也可以筛选所期望的cDNA克隆。另外以上述基因片段的DNA序列为基础，设计适当的特异的PCR用引物，按照常规方法进行PCR反应，也可以从cDNA文库中选择出保有扩增DNA片段的所期望的cDNA克隆。(基因表达系统)在利用本发明有关基因时，至少要将含有序列表中序列2记载的DNA或与之相对应的共有DNA序列的多核苷酸整合到适当的表达盒和/或表达载体中，使由序列1记载的氨基酸序列组合物蛋白质或其变异体在作为靶细胞的人细胞内表达最理想。
表达盒只要是可以使本发明有关基因在靶细胞中表达，并没有特别限制，可以使用任一种。同行人很容易选择那样的表达盒。理想的是上述基因可在来自动物的细胞内表达的表达盒，更理想的是上述基因可在来自哺乳动物的细胞内表达的表达盒，最理想的是上述基因可在来自人的细胞内表达的表达盒。
在上述表达盒中除了本发明有关基因外也可以使用为转录基因使用的启动子和增强子、聚A信号序列、为了标记导入了基因的细胞的标记和/或为了筛选的标准参照物基因、为了使该基因有效地插入细胞的基因组DNA序列内使用的来自病毒的基因序列、为了使作为通过基因病毒产生的药物起作用的物质分泌到细胞外和/或滞留在细胞内的信号序列等任一种序列。
用于表达盒的启动子有诸如以下的一些启动子如来自以下一些病毒的启动子腺病毒(Ad)、巨细胞病毒(CMV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、腺-伴随病毒(AAV)、猿病毒(SV40)、罗斯肉瘤病毒(RSV)、单纯疱疹病毒(HSV)、鼠白血病病毒(MoMLV)、舟状花叶病毒(Sinbisvirus)、仙台病毒(SeV)、A型肝炎病毒(HAV)、B型肝炎病毒(HBV)、C型肝炎病毒(HCV)、人乳头状瘤病毒(HPV)、牛乳头状瘤病毒(BPV)、人T细胞白血病病毒(HTLV)、水泡性口内炎病毒(VSV)、流感病毒(Influenza virus)、日本脑炎病毒(Japanese encephalitisvirus)、JC病毒(JC virus)、细小病毒B19(Parvovirus B19)、脊髓灰质炎病毒(Poliovirus)；来自以下一些哺乳类动物的启动子信号识别颗粒受体的α-亚单位(alpha-subunit of the signalrecognition particle receptor)(SR-α)、髓磷脂基础蛋白质(myelin basic protein)(MBP)、胶质细胞原纤维酸性蛋白(glial-specific glial fibrillary acidic protein)(GFAP)、β-肌动蛋白(β-actin)、延伸因子1-α(elongationfactorl-alpha)(EF1-α)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)(GAPDH)、广谱抗药基因(multidrug resistance gene)(Mdr1)、甲胎蛋白(alpha-fetoprotein)(AFP)、热休克多巴(HSP)、低氧诱导蛋白(HIP)等来自哺乳类的启动子；以及由CMV初期增强子/chicken β凝集素启动子/β株蛋白聚A构成的嵌合启动子(CAG)、由CMV初期增强子/alpha-skeketal actin启动子构成的嵌合启动子等嵌合型启动子。
另外基因和来自使其表达的逆病毒的启动子的LTR例如可以将LTR的U3区取代为CAG、CMC、RSV、TK、SV40、SR-α、MBP、β-actin、EF1-α等的启动子后作为嵌合LTR使用。
另外可以将含有本发明有关基因的表达盒整合到粘粒、质粒或来自病毒的适合宿主细胞的任意重组载体中。这样的重组病毒载体的种类、分子量、形状等并没有特别限制。具体来说，可以是DNA和/或RNA病毒，(+)链和/或(-)链病毒，并没有特别限制。
上述重组病毒载体可以是MoMLV载体、HSV载体、Ad载体、AAV载体、HIV载体、SeV载体等任一个病毒载体。另外本发明也可以使用将病毒载体的组成蛋白质群中的一个以上蛋白质取代为异种病毒的组成蛋白质的病毒载体，或将构成基因信息的核酸序列中的一部分取代为异种病毒的核酸序列的假型病毒载体。另外只要是具有治疗效果的病毒，即使带有人以外的宿主区的病毒也可以作为重组病毒载体使用。
就象以上详细说明的那样，例如可以将本发明有关基因整合到作为宿主细胞的微生物或真核生物的表达载体后，再通过培养被转化的微生物或真核生物，可以很容易、而且很稳定地制造由序列1记载的氨基酸序列组合物蛋白质等。从上述列举的载体中选择出的载体可以单独、或与阳离子脂质体、聚赖氨酸、聚赖氨酸丝氨酸等医学上容许的各种各样的载体形成复合体后导入宿主细胞。(反义多核苷酸)就构成本发明有关基因的DNA的有意义链或该DNA编码的RNA分别存在着由与该碱基序列互补的碱基序列构成的反义DNA或反义RNA。就是说这样的反义DNA具有与由序列2、3或4记载的DNA构成的DNA编码的至少一部分RNA互补的DNA序列。理想的是上述反义DNA和反义RNA与序列2记载的DNA序列或与之相对应的RNA序列的一部分互补。因此含有上述反义DNA或上述反义RNA的本发明的反义多核苷酸在由本发明涉及到的具有制造本发明有关的蛋白质的过程中(转录、翻译等)，与带有遗传信息的DNA或RNA杂交，影响遗传信息传递的正常流向，抑制该蛋白质的生物合成。另外本发明包括反义多核苷酸衍生物。例如，该衍生物可以是在反义多核苷酸的3’末端、或5’末端结合其它物质的产物或至少在碱基、糖、磷酸中的任一部分进行取代、缺失或附加等修饰的产物。特别是在用于生物体时为了防止被核酸酶分解，最好使用硫代磷酸(酯)(磷酸基与硫原子共价结合)的多核苷酸衍生物。本发明的反义多核苷酸或其衍生物的碱基数为10～2000最理想。如果处于该范围内的比较少的多核苷酸可以用DNA合成仪进行化学合成。另外有时也可以以本发明涉及到的DNA的cDNA的一部分作为模板利用PCR法合成。(用作治疗药)本发明涉及到的蛋白质由于抑制包括癌细胞在内的无限增殖化细胞的增殖，所以可以作为治疗药用于癌症等病因为细胞无限增殖化的疾病的治疗。因此编码这些蛋白质的本发明有关基因也可以作为治疗药。另外本发明的反义多核苷酸或其衍生物与本发明有关基因有拮抗作用，刺激细胞增殖，所以适用于各种各样疾病的治疗。
在将本发明涉及到的蛋白质作为细胞增殖抑制剂或癌症治疗剂用于治疗癌症等疾病时，最好是与药学上容许的载体、稀释剂、赋形剂、稳定剂等一起做成片剂、胶囊、注射用悬浮液以及其它制剂后用于患者最好。用于该目的的辅助剂同行人都知道。本发明的细胞增殖抑制剂和癌症治疗剂通过静脉给药、口服给药等制定的理想给药途径，可以预料会获得所期望的治疗效果。(基因治疗方面的应用)将本发明有关基因作为细胞增殖抑制剂、或作为癌症治疗剂等用于癌症等疾病的治疗时，最好是将该基因作为治疗基因与为上述治疗用而设计的载体一起制备成基因治疗用组成物，再用于患者。
本发明的基因治疗用组成物可以用于通过先从患者将靶细胞取到体外，导入本发明有关基因后再将该细胞输回到患者体内的自身移植的基因治疗(ex vivo基因治疗)。另外，也可以将本发明有关基因直接用于患者的基因治疗(in vivo基因治疗)中。
在将本发明有关基因用于基因治疗时，最好使用腺病毒载体。腺病毒有诸如以下的一些特征(1)可以向多种细胞导入基因，(2)即使对于增殖终止期的细胞也可有效地导入基因，(3)通过离心可以浓缩，获得高滴度(10～11PFU/ml以上)的病毒，(4)适于向体内(in vivo)的组织细胞直接导入基因。
作为基因治疗用的腺病毒已经开发出了以下一些使E1/E3区缺失的第1代腺病毒载体(Miyake，S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，1320，1996)、附加E1/E3区而使E2区或E4区缺失的第2代腺病毒载体(Lieber，A.，et al.，J.Virol.，70，8944，1996；Mizuguchi，H.&Kay，M.A.，Hum.Gene Ther.，10，2013，1999)、几乎完全缺失腺病毒基因组的第3代腺病毒载体(Steinwaerder，D.S.，etal.，J.Virol，73，9303，1999)，在导入本发明的基因时并没有特别限制，可以使用任一种腺病毒载体。
另外，如果使用具有整合到AAV染色体能力的腺病毒-AAV杂化载体(Recchia，A.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，96，2615，1999)或通过使用转座子的具有具有整合到染色体能力的腺病毒载体等，也可以应用于长期的基因表达中。
另外通过在腺病毒纤维的H1环插入表现出组织特异转移性的肽序列，有可能赋予腺病毒载体组织特异性(Mizuguchi，H.&Hayakawa.I.，Nippon Rinsho，7，1544，2000)。
将本发明的基因治疗用组成物投入到生物体的方法没有特别限制。例如可以不通过口给药，如最好是通过静脉给药。(对象疾病)由本发明有关基因编码的本发明相关蛋白质由于可以诱发感受细胞的老化或静止状态，所以可以充当癌细胞向非癌化细胞分化的媒介。例如可以用于为了抑制癌或癌原细胞急剧增殖的治疗中。
一般来说，肿瘤有良性肿瘤和恶性肿瘤，后者总称为癌。
通过利用本发明有关蛋白质可治疗的肿瘤没有特别限定，无论是良性肿瘤、还是恶性肿瘤哪一种都可以治疗，特别是对恶性肿瘤更有效。
按照发生脏器对恶性肿瘤进行分类，恶性肿瘤可分为脑和神经肿瘤、皮肤癌、胃癌、肺癌、肝癌、淋巴肿瘤和白血病、结肠癌、胰癌、肛门和直肠癌、食道癌、子宫癌、乳腺癌、骨和骨肉瘤、平滑肌瘤、横纹肌瘤和其它的癌。如上所述，可治疗的肿瘤没有特别限定，对上述的肿瘤、癌中的任一种都可以治疗，但对肺癌、肝癌、食道癌、骨和骨肉瘤最有效。
如果从组织学对各脏器癌症进行分类大致可以分为上皮细胞癌(carcinoma)，非上皮细胞肉瘤(sarcoma)以及它们的混合肿瘤。通过使用本发明有关蛋白质可治疗的肿瘤没有特别限定，虽然可以治疗上皮细胞癌、非上皮细胞肉瘤以及它们的混合肿瘤中的任一种，但对上皮细胞癌特别有效。
另外很多并不是癌的疾病通过本发明有关基因或蛋白质也可治疗，其代表性例子如青光眼、干癣等由于细胞过剩生长引起的疾病。
另外，如逆病毒由于只是在处于细胞增殖期的细胞中增殖，所以对HIV等逆病毒感染病、疣(包括性交性疣)、口头乳头瘤、进行性多病灶性脑白质病等那样的疾病，预料本发明有关基因也能有效地治疗。因为该基因可以通过抑制感染细胞增殖来抑制病毒的增殖。因此也可以作为抑制流感病毒、肝炎病毒(例如B型肝炎或C型肝炎)、EBV(Epstein-Barr virus)、乳头状瘤病毒等病毒增殖的抗病毒制剂使用。
本发明的反义多核苷酸或其衍生物由于具有刺激细胞增殖的活性，所以可以用于需要细胞增殖的疾病的治疗。例如以治疗创伤、烧伤等为目的皮肤组织细胞的增殖，以治疗心肌梗塞、脑梗塞等为目的的血管内皮细胞的增殖，以治疗肝硬变、肾功能衰竭等为目的的萎缩组织细胞的增殖等，以治疗被放射线照射、艾滋病等引起的淋巴细胞减少为目的的骨髓细胞的增殖。(作诊断试剂的用途)如上所述，本发明有关基因由于在包括癌细胞在内的无限增殖化细胞中其表达减少，所以可以作为该无限增殖化细胞的增殖为病因的疾病的范围广泛的诊断用标准参照物。特别是本发明有关基因可作为论断试剂物使用。另外由本发明有关基因表达的本发明相关的蛋白质由于它在包括癌细胞在内的无限增殖化细胞中的表达减少，所以该蛋白质也同样可以作为包括癌症论断试剂在内的上述诊断用标准参照物使用。
在诊断癌症等病症使用本发明相关的蛋白质时，制作针对该蛋白质的特异抗体，在分析时使用。作为抗原可以使用按照上述的基因工程技术大量生产的蛋白质或其一部分，得到的抗体无论是多克隆抗体，还是单克隆抗体都可以。这些抗体可以用于上述蛋白质的纯化、测定和识别等，特别是单克隆抗体用于评价该蛋白质是否存在于细胞、组织或体液中的免疫分析最合适。通过该抗体提供的该蛋白质的检测和/或测定能力作为评价肿瘤存在或病重程度非常有希望。(基因诊断)
在癌症等的基因诊断中使用本发明有关基因时，根据构成该基因的DNA序列，制作包括可与该DNA序列杂交的DNA或可与该DNA序列相对应的RNA序列杂交的RNA的多核苷酸，在分析中使用。为了达到该目的，可以使用上述的反义多核苷酸的全长或其一部分。这样的多核苷酸的长度理想的是10～2000碱基，更理想的是15～1000个碱基。这些多核苷酸可以用32P等放射性同位素、碱性磷酸酶等酶、荧光素等荧光化合物、或吖啶鎓酯等化学发光化合物任意标记。得到的标记多核苷酸可以在象southern和northern blotting那样的以往的分析中作为DNA和/或RNA探针用于分析中。这些探针在严格条件下可与上述基因杂交最理想。而短的10～50个碱基的多核苷酸例如可以在通过PCR法的诊断中作为引物使用。实施例以下举一些实施例更具体地对本发明进行说明，但本发明并不限定于这些实施例。(实施例1)与无限增殖化有关的基因的克隆1.原代纤维芽细胞株的培养从9周令的雌性胚胎中制备纤维芽细胞，获得原代纤维芽细胞株(KMS-6)(Namba，M.et al.，Int.J.Cancer，35275-280，1985)。细胞使用含有10％胎牛血清(FBS，三光纯药公司制造)的Eagle最低需要培养基(MEM，GIBCO公司生产)，或Dalbeco(ダルベツコ)改变Eagle培养基(DMEM，GIBCO公司生产)，于5％CO2浓度、37℃条件下进行培养。培养5～7天后直至细胞在培养板中几乎密集，然后稀释到1/4倍进行传代培养。2.通过60Co放射线处理建立无限增殖化细胞株对在semiconfluent中培养的KMS-6细胞照射200-400rads射线量的60Coγ，共照射13次，用共计2,800rads进行放射线处理。然后每次都稀释1/2倍后反复进行传代培养，最终大约进行了50次传代培养，获得了不表现出老化形态具有增殖能力的无限增殖化细胞株(KMST-6)(Namba等人，同前)。3.利用RDA法进行基因的克隆利用Acid-Guanidium-Phenol-Chloroform(AGPC)法从进行了45次传代，已老化的KMS-6细胞提取总RNA，使用Dyna beads(ダイナビ-ズ)(Dynal公司生产)纯化mRNA。同样从无限增殖化的KMST-6细胞提取、纯化mRNA。分别以各2μl的纯化的mRNA为模板，使用avian myelobastosis virus逆转录酶(AMV-RT)制备各自的cDNA。对从KMS-6制备的cDNA 1μg和从KMST-6制备的cDNA 1μg进行8小时的扣除反应。以没有被扣除反应除去的cDNA作为模板，用T4DNA聚合酶制备双链DNA。然后将它整合到质粒pT7Blue(Novagen公司生产)后，导入大肠杆菌(DH5α)，得到了由大约400个克隆构成的大肠杆菌文库。(实施例2)克隆REIC1.大肠杆菌文库的筛选为了从上述大肠杆菌文库中除去假阳性克隆，用别的无限增殖化细胞株OUMS-24F(Bai，L.et al.，Int.J.Cancer，53451-456，1993)的mRNA为基础制作的32P标记的cDNA探针，进行克隆杂交，结果得到除去呈阳性的克隆外的大约30个抑制无限增殖化基因克隆。2.DNA测序利用Sanger法(Sanger F.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467，1977)确定筛选得到的克隆的DNA。被鉴定的克隆带有纤连蛋白、α2型I酸溶原胶原(蛋白)等细胞外基质蛋白质、胶原酶、WS9-14等酶蛋白质、p21等细胞周期调节蛋白质等与老化有关的基因序列。经判断获得了其中与已知基因没有同源性，被认为是新基因的REIC(D93)。序列表中序列5给出了该DNA序列。(实施例3)克隆REIC(10-1)从克隆REIC(D93)的DNA序列预料到该克隆不是全长cDNA。因此以具有序列5记载的DNA序列的多核苷酸作为探针从人心脏cDNA文库(BRL公司生产)筛选具有更长DNA序列的cDNA片段的克隆。结果得到预料含有REIC(D93)的5’区的保持全长cDNA片段的克隆REIC(10-1)。对该cDNA克隆进行DNA测序，确定了其总DNA序列。序列表中序列3给出了该克隆的DNA序列。(实施例4)克隆REIC(10-2)使用通过Oligocapping法(Maruyama，K.and Sugano，S.，Gene，138171-174，1994)制备的人心脏cDNA文库(日本基因公司生产)，与实施例2一样以具有序列5记载的DNA序列的多核苷酸作为探针筛选具有更长DNA序列的cDNA片段的克隆。结果得到预料含有REIC(D93)的5’区的保持全长cDNA片段的克隆REIC(10-2)。对该cDNA克隆进行DNA测序，确定了其总DNA序列。序列表中序列4给出了该克隆的DNA序列。(实施例5)被克隆的cDNA的解析从实施例3和4的结果可以确认本发明有关基因完全含有序列5记载的DNA序列(分别相当于序列3碱基号的1848-2113、序列4碱基号的1820-2095)，另外在该序列的5’端含有编码具有350个氨基酸的蛋白质(序列1)的序列2记载的1050bp翻译区(分别相当于序列3碱基号的226-1275、序列4碱基号的198-1247)。该基因由于在无限增殖化细胞中表达低下，就象上述那样表现为Reduced Expression in Immortalized Cell(REIC)，以下称之为「REIC基因」或简单地称为「REIC」。
本发明涉及到的REIC基因的同源性的探索从在NCBI(NationalCenter for Biotechnology)Web网站上公开的资料库中使用相同的解析程序进行。
从BLAST的结果得到了具有与序列1的氨基酸序列相同或具有表现出同源性序列的蛋白质hDkk3和RIG7-1。hDkk3表现出100％的同源性，而RIG7-1表现出部分同源性，总体表现出的同源性只有43％。图1给出了hDkk3以及RIG7-1的氨基酸序列与REIC具有的氨基酸序列(序列1)的同源性比较。(实施例6)REIC在各种细胞株中表达量的解析对从Hep3B(肝细胞癌)、HuH6(肝芽瘤)、HuH7(肝细胞癌)、HuCCT1(胆管癌)、A549(肺癌)、HaCat(无限增殖化角化细胞)、HeLa(子宫颈癌)、Saos2(骨肉瘤)、T24(膀胱癌)以及U937(组织细胞性淋巴瘤)等11种癌细胞株和3种正常的纤维芽细胞(OUMS24、KMS-6、HSF412)和相对应的无限增殖化细胞(OUMS24F、KMST-6、SUSM1)制备的总RNA(10μg)用1％甲醛/琼脂糖凝胶进行电泳，固定于硝酸纤维素膜(HybribondN+、Amersham Pharmacia Biotech公司生产)上。然后使用用(α-32P)-dCTP标记的探针，进行REICcDNA片段的Northern杂交(42℃，12小时)。将膜浸入到含有5×SSC、50％甲酰胺、1×Denhardt水溶液、0.2％SDS、10硫酸葡聚糖、以及热变性的200μg/ml的鲑精DNA的缓冲液中，加入用放射性同位素标记的探针DNA，于65℃下进行杂交。然后再于55℃的2×SSC/0.5％SDS缓冲液中洗一次。图2给出了于X光片上自动发射自显影的结果。在正常细胞中可检测出大小约2.6kb的mRNA，表明该转录产物的大小与序列3或序列4记载的REIC cDNA的DNA序列的大小一致。虽然在各个无限增殖化细胞株中也可以看到REIC基因的表达，但与正常细胞株相比其表达量减少了。另外在除去T24之外的各个癌细胞株中可以确认REIC基因的表达正在消失。(实施例7)细胞增殖抑制实验1.表达质粒的制作作为基因表达的启动子使用带有EF-1α的质粒载体pTracer A(Invitrogen公司生产)。用EcoRI-XbaI切出在EF-1α启动子的下游的EcoRI-XbaI部位含有序列3记载的DNA序列的2.6kb的REICcDNA片段，对该片段进行亚克隆，得到表达质粒REIC/pTracer(图3)。2.3H胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入(无限增殖化KMST-6细胞)将无限增殖化KMST-6细胞接种到24孔板中，每孔2×104细胞。使用转染试剂Lipofectamine(GOBCO公司生产)，对5μg的表达质粒REIC/pTracer进行脂(质)转染。制备甲基-3H胸腺嘧啶脱氧核苷(1Ci/mmol)，进行细胞掺入实验(使得1μCi/孔)。12小时后，用冷却的PBS(-)洗获得的细胞。再于5％三氯乙酸中进行固定，用95％乙醇洗净。这样获得的细胞用0.3MnaOH溶解后，用HCl进行中和，用液体闪烁计数仪测定掺入的3H胸腺嘧啶脱氧核苷的放射活性。测定结果可以确认REIC基因具有抑制细胞增殖效果(图4)。作为对照，只将载体pTracerA脂转染到KMST-6细胞中。3.3H胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入(Saos2骨肉瘤细胞)将Saos2骨肉瘤细胞接种到24孔板中，每孔5×104细胞。使用磷酸钙法对2μg的表达质粒REIC/pTracer进行转染。制备甲基-3H胸腺嘧啶脱氧核苷(1Ci/mmol)，进行细胞掺入实验(使得1μCi/孔)。12小时后，用冷却的PBS(-)洗细胞。再于5％三氯乙酸中进行固定，用95％乙醇洗净。这样获得的细胞用0.3MnaOH溶解后，用HCl进行中和，用液体闪烁计数仪测定3H胸腺嘧啶脱氧核苷的放射活性。测定结果可以确认REIC基因具有抑制细胞增殖效果(图5)。作为对照，只将载体pTracerA脂转染到Saos2细胞中。(实施例8)识别REIC蛋白质的抗体的制作1.REIC蛋白质的体外翻译为了使REIC蛋白质作为GST融合蛋白质表达，用体外表达体系进行翻译。
以序列3记载的DNA序列为基础使用引物5’-TGGATCCATGCAGCGGCTTGGGGCCAC-3’和5’-TGAATTCAATCTCTTCCCCTCCCAGCAG-3’通过PCR对REIC的ORF区有选择地进行扩增。扩增的片段经BamHI、EcoRI消化，亚克隆到GST融合蛋白质表达载体pGEX-2T(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)的BamHI、EcoRI位点使REIC能够作为融合蛋白质表达，得到了表达质粒REIC/pGEX-2T(图6)。
按照常规方法，对经REIC/pGEX-2T转化的大肠杆菌实施IPTG诱导处理，使融合蛋白质产生。将收集的大肠杆菌悬浮于PBS中，进行超声波处理后，将离心得到的上清加到谷胱甘肽葡聚糖4B柱(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)，纯化融合蛋白质。吸附在柱子上的上述融合蛋白质用纤维蛋白酶进行消化，洗脱。然后再次用谷胱甘肽柱去除未消化的融合蛋白质，得到含有多个多余氨基酸的REIC蛋白质。2.抗体上述1得到的纯化的蛋白质用生理盐水稀释，通过每隔2周取其中1mg注入到兔耳静脉对兔子进行免疫。2次免疫后，利用ECL免疫印迹法检测系统(Amersham Pharmacia Biotech公司生产)测定抗体效价。结果可以确认稀释1/2000后的抗体对上述蛋白质0.01μg有反应，所以再追加2次免疫。将通过采全血得到的血液于37℃下温育30分钟。除去凝固的血饼后用孔径0.45μm的膜进行无菌过滤，得到所期望的抗血清。(实施例9)利用抗体进行细胞核染色为了研究REIC基因在细胞内的分布，使用实施例8制作的抗REIC抗血清和作为对照的对染色体进行特异荧光染色的色素Hoechst33258(Molecular Probe公司生产)进行细胞的双重染色。首先用6孔培养皿对KMS-6进行培养。向培养基中添加Hoechst33258，浓度为100ng/ml后，培养1小时。用1％仲甲醛对经Hoechst33258染色的细胞进行固定，用上述抗血清进行处理后，用FITC标记的羊抗兔抗体(Sigma公司生产)染色。用激发波长360nm激发Hoechst33258，FITC标记的抗体用激发波长488nm激发。图7给出了通过该免疫荧光法测定的结果。由此可以确认上述抗血清对核特异染色，REIC蛋白质局限于细胞内的核中。(实施例10)REIC基因的染色体定位REIC基因的染色体定位通过利用例子人-仓鼠杂种细胞的化验盘(Standford G3 Human/Hamster RH Panel；Research Genetics公司生产)对辐射和杂交图(RH图)进行解析确定的。PCR用的引物是5’-GATTTAGATCTGGACCAGGC-3’(序列4中的1244-1263碱基)和5’-CTGAGCAACACTGCTGGATG-3’(相当于序列4中的1777-1796序列的反义链)。PCR经于94℃预加热3分钟后，进行30个循环反应，每一循环为94℃30秒，63℃30秒，72℃1分钟。用2％琼脂糖凝胶对反应液进行电泳，然后用溴乙锭(EtBr)进行染色，结果可以确认553bp的扩增产物(图8)。以PCR的结果为基础从Standford大学的RH数据库可以确认REIC位于人11号染色体的短臂15(11p15)。
另外以该信息为基础对GeneBank的STS基因组标准参照物和REIC基因的碱基序列进行比较时，确认REIC基因的3’非翻译区与标准参照物的D11S2388(11p15的基因基因组标准参照物)一致(图9、图10)。这些结果表明REIC基因位于11p15。另外图9中给出的LOH在各种癌组织中的频率是引自以下文献。乳腺癌(B)Winqvist，R.，et al.，Cancer Res.，53，4486，1993；食道癌(E)Dolan，K.，et al.，Br.J.Cancer，78，950，1998；胃癌(G)Baffa，R.，etal.，Cancer Res.，56，268，1996；肝细胞癌(H)Sheu，J-C.，etal.，Br.J.Cancer，80，468，1999；头颈部癌(HN)El-Naggar，A.K.，etal.，Clin.Cancer Res.，2，903，1996；和前列腺癌(P)Dahiya，R.，etal.，Int.J.Cancer，72，283，1997。(实施例11)临床样品中的REIC基因的表达1.临床样品的获得各种癌和非癌组织是经同意从在冈山大学医学部接受手术的34个患者中获得的。2.REIC基因的表达利用硫代氰酸酯法从上述1中得到的癌和非癌组织回收总RNA。回收的总RNA(10μg)用1％甲醛/琼脂糖凝胶进行电泳，固定于硝酸纤维素膜(HybribondN+、Amersham Pharmacia Biotech公司生产)上。然后使用用(α32P)-dCTP标记的探针，进行REIC cDNA片段的Northern杂交(42℃，12小时)。将膜浸入到含有5×SSC、50％甲酰胺、1×Denhardt水溶液、0.2％SDS、10硫酸葡聚糖、以及热变性的100μg/ml的鲑精DNA的缓冲液中，加入用放射性同位素标记的探针DNA，于65℃下进行杂交。然后再用55℃的2×SSC/0.5％SDS缓冲液洗膜，然后再于0.1×SSC/0.5％SDS缓冲液洗一次。于X光片上出现自动发射自显影的结果。结果表明在11例非小细胞肺癌患者中的10例(图11A情况1～6，8～11)、肝细胞癌患者13例中的4例(图11B情况8，9，11，13)、食道癌患者2例中的1例(图11C情况2)中REIC基因的表达量减少。而在3例大肠癌患者中没有发现REIC基因的表达量下降(图11E)。(实施例12)REIC基因的RFLP解析为了进行REIC基因的变异解析，进行了限制性片段长度多态性(Restriction fragment length polymorphism；RFLP)解析。首先按照下述方法从来自肝细胞癌的JHH-1、HuH6、HepG2、HLE、HuH7、PLC/PRC/5、Hep3B、JHH-7、JHH-2、JHH-6、JHH-4、JHH-5细胞株回收染色体DNA。另外作为阳性对照，从正常纤维芽细胞株KMS-6回收染色体DNA。1.染色体的DNA回收通过胰蛋白酶处理从2个培养皿回收铺满培养的各个细胞。将回收的细胞悬浮于1×TEN缓冲液(TEN50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mMEDTA、100mM NaCl)中，进行匀浆。向匀浆后的悬浮液中加入750μl的SDS(10％)和终浓度为500μg/ml的蛋白酶K(MERCK公司生产、20mg/ml)，缓慢颠倒混合，于55℃下温育1小时后，于37℃下温育过夜。进行2次酚和氯仿萃取，从回收的上清再进行2次酚和氯仿萃取，回收上清。向回收的上清中加入预先于-20℃制冷的10.2ml乙醇后混合，用巴斯德吸管吸取得到的线状DNA，除去多余的乙醇，使其干燥。向干燥的DNA加入适量的TE缓冲液(10mMTris-HCl(pH8.0)、1mM EDTA)，于室温下混合1～2天，对DNA进行溶解。2.RELP解析上述1回收的DNA经限制酶PstI消化后，用1％甲醛/琼脂糖凝胶进行电泳，固定于硝酸纤维素膜(HybribondN+、AmershamPharmacia Biotech公司生产)上。然后用(α-32p)-dCTP对序列3的REIC cDNA片段的全长进行标记的探针，进行Southern杂交(42℃，12小时)。将膜浸入到含有5×SSC、50％甲酰胺、1×Denhardt水溶液、0.2％SDS、20mM磷酸钠、以及热变性的100μg/ml的鲑精DNA的缓冲液中，加入用放射性同位素标记的探针DNA，于65℃下进行杂交。然后再用55℃的2×SSC/0.5％SDS缓冲液洗膜，然后再于55℃的0.1×SSC/0.5％SDS缓冲液洗一次。于X光片上出现自动发射自显影的结果。结果可以确认在HepG2、Hep3B和JHH-4 3个癌细胞株中等位基因消失。在癌细胞中不仅REIC基因的表达低下，而且有可能在REIC基因自身发生LOH(图12)。(实施例13)REIC基因与细胞周期的相关性为了确认REIC基因在细胞周期中表达量的变化，进行了以下的实验。将KMS-6细胞接种到10cm培养皿中，使每个培养皿中的细胞数为2×106个。将接种时的培养基中的血清浓度调整到0.5％，培养72小时，使细胞周期处于G0期(休止期)。然后加血清使其浓度为10％，通过刺激细胞使细胞周期开始。回收于添加后的0、0.5、1、3、6、12、24、48小时的总RNA和通常培养条件下的总RNA，通过Northern杂交对REIC基因的表达量的变化进行解析。结果可以确认在添加血清后12小时REIC基因的表达最低，然后REIC基因的表达再上升。作为对照对GAPDH基因的表达量的变化进行了解析，结果可以确认表达量一定，与细胞周期无关(图13)。同时根据实施例7-2确认3H胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入时，在添加血清后24小时3H胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入增加，而后3H胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入再减少(图13B)。
根据以上结果可以认为REIC基因通过在细胞周期的G0期强烈表达，而在停止细胞增殖的方向起作用，另外通过其表达量减少在细胞周期向着G1期的方向起作用。(实施例14)通过细胞增殖抑制剂诱导REIC基因的表达将JHH-1细胞接种到10cm培养皿中，使每个培养皿中的细胞数为2×106个。将作为上皮细胞增殖抑制剂的TGF-β添加到JHH-1细胞的培养液中，终浓度为2.5ng/ml。回收TGF-β添加前、添加后3、6、12、24、48小时的总RNA和通常培养条件下的总RNA。通过Northern杂交对回收的RNA解析解析时，可以确认TGF-β添加后24小时REIC基因的表达上升(图14)，表明REIC基因的表达与细胞增殖抑制有关。
从以上结果可以认为诱导REIC基因表达的化合物由于可以预料有抑制细胞增殖效果，所以在癌症治疗用的候补低分子化合物的筛选中使用REIC基因的表达是有用的。(实施例15)粘粒载体pAxCAREIC的制作设计在REIC的起始密码前设计BamHI位点的引物(REICS；5’-GGATCCAGAGCGGAAATGCAGCGG-3’(在相当于在序列4的190-206碱基的序列的5’端加上作为BamHI位点的GGATCC的序列))和在终止密码后设计EcoRI位点的引物(REICA；5’-GAATTCTAAATCTCTTCCCCTCCCAG-3’(在相当于在序列4的1230-1249碱基的序列的5’端加上作为EcoRI位点的GAATTC的序列))。然后以pTracer/REIC作为模板，通过PCR扩增REIC的编码区。PCR共进行30个循环反应，每一循环的反应条件为94℃30秒，63℃30秒，72℃1分钟。从凝胶回收约1.1kb的扩增产物，EcoRI、BamHI消化后亚克隆到pUC119，然后导入DH5α，对从氨苄青霉素抗性的克隆中提取的质粒碱基的序列进行解析。确认在插入序列中没有引入变异(pUC119/REIC、图15)。用EcoRI、BamHI消化pUC119/REIC回收约1.1kb片段。使用DNABlunting Kit(Takara(タカラ)公司生产)将回收的REIC的末端补平，亚克隆于含有CAG启动子的粘粒(pAxCAwt、图16)的SwaI位点。用ClaI消化得到的粘粒(pAxCAREIC、图17)，确认有无插入序列。另外用StuI、SpeI消化，确认插入的方向是5’-启动子、插入序列、多A信号序列。(实施例16)REIC表达重组腺病毒载体的制作REIC表达重组腺病毒载体按照COS-TPC法(Miyake，S.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.，93，1320，1996)制作。
使用磷酸钙法用实施例15制作的pAxCAREIC(8μg)和EcoT22I处理的COS-TPC(图18)(5μg)转染293细胞。于37℃、5％CO2条件下培养12小时后，将细胞接种到96孔板中，再继续培养10～15天。从细胞死亡的孔中回收包括死亡细胞在内的培养液，冻融6次后，将经5,000rpm、5min离心的上清作为一级病毒液保存在-80℃下。用一次病毒液感染293细胞、HeLa细胞，3天后在HeLa细胞没有看到变性，从293细胞完全死亡的克隆的293细胞回收包括死亡细胞在内的培养液，将冻融6次后的上清作为2级病毒液保存在-80℃下。按照实施例12记载的方法从制备2级病毒液时的细胞制备染色体DNA。该DNA经XhoI、ClaI消化后，进行琼脂糖凝胶电泳，确认腺病毒基因组以及REIC基因的有无。
用通过上述操作选择的克隆的2级病毒液感染293细胞，细胞死亡后回收包括死亡细胞在内的培养液，冻融6次后，将经3,000rpm、10min离心的上清作为3级病毒液保存在-80℃下。通过同样的操作进行扩大，最终制备4级病毒液，保存在-80℃下(Adeno-REIC)。(实施例17)确认有无野生型腺病毒混入用实施例16得到的4级病毒液感染HeLa细胞，3天后按照实施例12记载的方法制备染色体DNA。利用为了能够以制备的DNA作为模板扩增从EIA基因的起始密码到第1外显子的3’末端的序列而设计的引物组(5’-ATGAGACATATTATCTGCCACGGAGGTGTTATTAC-3’，5’-CCTCTTCATCCTCGTCGTCACTGGGTGGAAAGCCA-3’)，进行25次PCR循环反应。PCR后进行琼脂糖凝胶电泳，确认有无EIA基因扩增片段(214bp)。(实施例18)Adeno-REIC的基因导入效率的确认利用ECID50法(50％ Tissue Culture infectious Dose)测定Adeno-REIC的效价。将实施例16制备的Adeno-REIC进行阶段稀释，每次都稀释10倍，制备104倍稀释病毒液。将104倍稀释病毒液加到96孔板的1列中，稀释至11列，稀释311倍，最终制备了从104稀释到311的病毒液。12列作为非感染细胞的对照。加入293细胞，每孔3×104个细胞，于37℃、5％CO2条件下培养11～13天，判断有无细胞变性。利用Karber公式对进行统计学上的计算，结果可以确认上述Adeno-REIC的效价为6.6×109pfu/ml。
产业上利用的可能性就象以上说明的那样，本发明有关基因和它编码的本发明相关蛋白质由于在包括癌细胞在内的无限增殖化细胞中表达低下，或者消失，所以成了这些以细胞增殖为起因的疾病诊断有效的标准参照物，所以可以作为癌症论断试剂等论断试剂。
另外本发明相关的蛋白质由于具有细胞增殖抑制活性，所以可用于癌症等细胞异常增殖为起因的疾病的治疗。
另外，本发明有关基因由于在细胞内表达具有细胞增殖抑制活性的上述蛋白质，所以在基因疗法中应用，用于癌症等细胞异常增殖为起因的疾病的治疗。
另外本发明的反义多核苷酸由于刺激细胞增殖，所以可用于需要细胞增殖的疾病的治疗中。
序列表<110>Hisamitsu Pharmaceutical Co.，Inc.<120>细胞增殖抑制蛋白质、多核苷酸、与多核苷酸对应的反义核苷酸，以及细胞增殖抑制剂、癌症诊断试剂、癌症治疗剂和用于基因治疗的组合物<130>FP00-0196-00<150>JP 11-330604<151>1999-11-19<160>5<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>350<212>PRT<213>Homo sapiens<400>1Met Gln Arg Leu Gly Ala Thr Leu Leu Cys Leu Leu Leu Ala Ala Ala15 10 15Val Pro Thr Ala Pro Ala Pro Ala Pro Thr Ala Thr Ser Ala Pro Val20 25 30Lys Pro Gly Pro Ala Leu Ser Tyr Pro Gln Glu Glu Ala Thr Leu Asn35 40 45Glu Met Phe Arg Glu Val Glu Glu Leu Met Glu Asp Thr Gln His Lys50 55 60Leu Arg Ser Ala Val Glu Glu Met Glu Ala Glu Glu Ala Ala Ala Lys65 70 75 80Ala Ser Ser Glu Val Asn Leu Ala Asn Leu Pro Pro Ser Tyr His Ash85 90 95Glu Thr Asn Thr Asp Thr Lys Val Gly Asn Asn Thr Ile His Val His100 105 110Arg Glu Ile His Lys Ile Thr Asn Asn Gln Thr Gly Gln Met Val Phe115 120 125Ser Glu Thr Val Ile Thr Ser Val Gly Asp Glu Glu Gly Arg Arg Ser130 135 140His Glu Cys Ile Ile Asp Glu Asp Cys Gly Pro Ser Met Tyr Cys Gln145 150 155 160Phe Ala Ser Phe Gln Tyr Thr Cys Gln Pro Cys Arg Gly Gln Arg Met165 170 175Leu Cys Thr Arg Asp Ser Glu Cys Cys Gly Asp Gln Leu Cys Val Trp180 185 190Gly His Cys Thr Lys Met Ala Thr Arg Gly Ser Asn Gly Thr Ile Cys195 200 205Asp Asn Gln Arg Asp Cys Gln Pro Gly Leu Cys Cys Ala Phe Gln Arg210 215 220Gly Leu Leu Phe Pro Val Cys Thr Pro Leu Pro Val Glu Gly Glu Leu225 230 235 240Cys His Asp Pro Ala Ser Arg Leu Leu Asp Leu Ile Thr Trp Glu Leu245 250 255Glu Pro Asp Gly Ala Leu Asp Arg Cys Pro Cys Ala Ser Gly Leu Leu
260 265 270Cys Gln Pro His Ser His Ser Leu Val Tyr Val Cys Lys Pro Thr Phe275 280 285Val Gly Ser Arg Asp Gln Asp Gly Glu Ile Leu Leu Pro Arg Glu Val290 295 300Pro Asp Glu Tyr Glu Val Gly Ser Phe Met Glu Glu Val Arg Gln Glu305 310 315 320Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ser Leu Thr Glu Glu Met Ala Leu Gly Glu325 330 335Pro Ala Ala Ala Ala Ala Ala Leu Leu Gly Gly Glu Glu Ile340 345 350<210> 2<211> 1050<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 2atgcagcggc ttggggccac cctgctgtgc ctgctgctgg cggcggcggt ccccacggcc 60cccgcgcccg ctccgacggc gacctcggct ccagtcaagc ccggcccggc tctcagctac 120ccgcaggagg aggccaccct caatgagatg ttccgcgagg ttgaggaact gatggaggac 180acgcagcaca aattgcgcag cgcggtggaa gagatggagg cagaagaagc tgctgctaaa 240gcatcatcag aagtgaacct ggcaaactta cctcccagct atcacaatga gaccaacaca 300gacacgaagg ttggaaataa taccatccat gtgcaccgag aaattcacaa gataaccaac 360aaccagactg gacaaatggt cttttcagag acagttatca catctgtggg agacgaagaa 420ggcagaagga gccacgagtg catcatcgac gaggactgtg ggcccagcat gtactgccag 480tttgccagct tccagtacac ctgccagcca tgccggggcc agaggatgct ctgcacccgg 540gacagtgagt gctgtggaga ccagctgtgt gtctggggtc actgcaccaa aatggccacc 600aggggcagca atgggaccat ctgtgacaac cagagggact gccagccggg gctgtgctgt 660gccttccaga gaggcctgct gttccctgtg tgcacacccc tgcccgtgga gggcgagctt 720tgccatgacc ccgccagccg gcttctggac ctcatcacct gggagctaga gcctgatgga 780gccttggacc gatgcccttg tgccagtggc ctcctctgcc agccccacag ccacagcctg 840gtgtatgtgt gcaagccgac cttcgtgggg agccgtgacc aagatgggga gatcctgctg 900cccagagagg tccccgatga gtatgaagtt ggcagcttca tggaggaggt gcgccaggag 960ctggaggacc tggagaggag cctgactgaa gagatggcgc tgggggagcc tgcggctgcc 1020gccgctgcac tgctgggagg ggaagagatt 1050<210> 3<211> 2660<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 3ggcggagagg gagcctggtg ggcgggcggg gcgcgtcttg cgggctccct cgggtaccgg 60cgctgccgca ccccgccgcg ctcccgcacc cgcggcccgc ccaccgcgcc gctcccgcat 120ctgcacccgc agcccggcgg cctcccggcg ggagcgagca gatccagtcc ggcccgcagc 180gcaactcggt ccagtcgggg cggcggctgc gggcgcagag cggagatgca gcggcttggg 240gccaccctgc tgtgcctgct gctggcggcg gcggtcccca cggcccccgc gcccgctccg 300acggcgacct cggctccagt caagcccggc ccggctctca gctacccgca ggaggaggcc 360accctcaatg agatgttccg cgaggttgag gaactgatgg aggacacgca gcacaaattg 420cgcagcgcgg tggaagagat ggaggcagaa gaagctgctg ctaaagcatc atcagaagtg 480aacctggcaa acttacctcc cagctatcac aatgagacca acacagacac gaaggttgga 540aataatacca tccatgtgca ccgagaaatt cacaagataa ccaacaacca gactggacaa 600atggtctttt cagagacagt tatcacatct gtgggagacg aagaaggcag aaggagccac 660gagtgcatca tcgacgagga ctgtgggccc agcatgtact gccagtttgc cagcttccag 720tacacctgcc agccatgccg gggccagagg atgctctgca cccgggacag tgagtgctgt 780ggagaccagc tgtgtgtctg gggtcactgc accaaaatgg ccaccagggg cagcaatggg 840accatctgtg acaaccagag ggactgccag ccggggctgt gctgtgcctt ccagagaggc 900ctgctgttcc ctgtgtgcac acccctgccc gtggagggcg agctttgcca tgaccccgcc 960agccggcttc tggacctcat cacctgggag ctagagcctg atggagcctt ggaccgatgc 1020ccttgtgcca gtggcctcct ctgccagccc cacagccaca gcctggtgta tgtgtgcaag 1080ccgaccttcg tggggagccg tgaccaagat ggggagatcc tgctgcccag agaggtcccc 1140gatgagtatg aagttggcag cttcatggag gaggtgcgcc aggagctgga ggacctggag 1200aggagcctga ctgaagagat ggcgctgggg gagcctgcgg ctgccgccgc tgcactgctg 1260ggaggggaag agatttagat ctggaccagg ctgtgggtag atgtgcaata gaaatagcta 1320atttatttcc ccaggtgtgt gctttaggcg tgggctgacc aggcttcttc ctacatcttc 1380ttcccagtaa gtttcccctc tggcttgaca gcatgaggtg ttgtgcattt gttcagctcc 1440cccaggctgt tctccaggct tcacagtctg gtgcttggga gagtcaggca gggttaaact 1500gcaggagcag tttgccaccc ctgtccagat tattggctgc tttgcctcta ccagttggca 1560gacagccgtt tgttctacat ggctttgata attgtttgag gggaggagat ggaaacaatg 1620tggagtctcc ctctgattgg ttttggggaa atgtggagaa gagtgccctg ctttgcaaac 1680atcaacctgg caaaaatgca acaaatgaat tttccacgca gttctttcca tgggcatagg 1740taagctgtgc cttcagctgt tgcagatgaa atgttctgtt caccctgcat tacatgtgtt 1800tattcatcca gcagtgttgc tcagctccta cctctgtgcc agggcagcat tttcatatcc 1860aagatcaatt ccctctctca gcacagcctg gggagggggt cattgttctc ctcgtccatc 1920agggatctca gaggctcaga gactgcaagc tgcttgccca agtcacacag ctagtgaaga 1980ccagagcagt ttcatctggt tgtgactcta agctcagtgc tctctccact accccacacc 2040agccttggtg ccaccaaaag tgctccccaa aaggaaggag aatgggattt ttcttttgag 2100gcatgcacat ctggaattaa ggtcaaacta attctcacat ccctctaaaa gtaaactact 2160gttaggaaca gcagtgttct cacagtgtgg ggcagccgtc cttctaatga agacaatgat 2220attgacactg tccctctttg gcagttgcat tagtaacttt gaaaggtata tgactgagcg 2280tagcatacag gttaacctgc agaaacagta cttaggtaat tgtagggcga ggattataaa 2340tgaaatttgc aaaatcactt agcagcaact gaagacaatt atcaaccacg tggagaaaat 2400caaaccgagc agggctgtgt gaaacatggt tgtaatatgc gactgcgaac actgaactct 2460acgccactcc acaaatgatg ttttcaggtg tcatggactg ttgccaccat gtattcatcc 2520agagttctta aagtttaaag ttgcacatga ttgtataagc atgctttctt tgagttttaa 2580attatgtata aacataagtt gcatttagaa atcaagcata aatcacttca actgctaaaa 2640aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 2660<210> 4<211> 2632<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 4gaggtagggg ctgagagagg cttgaggtgg aagtgggggt cgggcactct gacctggtcg 60aggaggggct agggtttgaa ccggggacag agtctaggtg agctggggct gggagctatt 120agcgtagagg atccgggttc ggttgctctg gcgagggctc cagcatcaca ggcggcggct 180gcgggcgcag agcggagatg cagcggcttg gggccaccct gctgtgcctg ctgctggcgg 240cggcggtccc cacggccccc gcgcccgctc cgacggcgac ctcggctcca gtcaagcccg 300gcccggctct cagctacccg caggaggagg ccaccctcaa tgagatgttc cgcgaggttg 360aggaactgat ggaggacacg cagcacaaat tgcgcagcgc ggtggaagag atggaggcag 420aagaagctgc tgctaaagca tcatcagaag tgaacctggc aaacttacct cccagctatc 480acaatgagac caacacagac acgaaggttg gaaataatac catccatgtg caccgagaaa 540ttcacaagat aaccaacaac cagactggac aaatggtctt ttcagagaca gttatcacat 600ctgtgggaga cgaagaaggc agaaggagcc acgagtgcat catcgacgag gactgtgggc 660ccagcatgta ctgccagttt gccagcttcc agtacacctg ccagccatgc cggggccaga 720ggatgctctg cacccgggac agtgagtgct gtggagacca gctgtgtgtc tggggtcact 780gcaccaaaat ggccaccagg ggcagcaatg ggaccatctg tgacaaccag agggactgcc 840agccggggct gtgctgtgcc ttccagagag gcctgctgtt ccctgtgtgc acacccctgc 900ccgtggaggg cgagctttgc catgaccccg ccagccggct tctggacctc atcacctggg 960agctagagcc tgatggagcc ttggaccgat gcccttgtgc cagtggcctc ctctgccagc 1020cccacagcca cagcctggtg tatgtgtgca agccgacctt cgtggggagc cgtgaccaag 1080atggggagat cctgctgccc agagaggtcc ccgatgagta tgaagttggc agcttcatgg 1140aggaggtgcg ccaggagctg gaggacctgg agaggagcct gactgaagag atggcgctgg 1200gggagcctgc ggctgccgcc gctgcactgc tgggagggga agagatttag atctggacca 1260ggctgtgggt agatgtgcaa tagaaatagc taatttattt ccccaggtgt gtgctttagg 1320cgtgggctga ccaggcttct tcctacatct tcttcccagt aagtttcccc tctggcttga 1380cagcatgagg tgttgtgcat ttgttcagct cccccaggct gttctccagg cttcacagtc 1440tggtgcttgg gagagtcagg cagggttaaa ctgcaggagc agtttgccac ccctgtccag 1500attattggct gctttgcctc taccagttgg cagacagccg tttgttctac atggctttga 1560taattgtttg aggggaggag atggaaacaa tgtggagtct ccctctgatt ggttttgggg 1620aaatgtggag aagagtgccc tgctttgcaa acatcaacct ggcaaaaatg caacaaatga 1680attttccacg cagttctttc catgggcata ggtaagctgt gccttcagct gttgcagatg 1740aaatgttctg ttcaccctgc attacatgtg tttattcatc cagcagtgtt gctcagctcc 1800tacctctgtg ccagggcagc attttcatat ccaagatcaa ttccctctct cagcacagcc 1860tggggagggg gtcattgttc tcctcgtcca tcagggatct cagaggctca gagactgcaa 1920gctgcttgcc caagtcacac agctagtgaa gaccagagca gtttcatctg gttgtgactc 1980taagctcagt gctctctcca ctaccccaca ccagccttgg tgccaccaaa agtgctcccc 2040aaaaggaagg agaatgggat ttttcttttg aggcatgcac atctggaatt aaggtcaaac 2100taattctcac atccctctaa aagtaaacta ctgttaggaa cagcagtgtt ctcacagtgt 2160ggggcagccg tccttctaat gaagacaatg atattgacac tgtccctctt tggcagttgc 2220attagtaact ttgaaaggta tatgactgag cgtagcatac aggttaacct gcagaaacag 2280tacttaggta attgtagggc gaggattata aatgaaattt gcaaaatcac ttagcagcaa 2340ctgaagacaa ttatcaacca cgtggagaaa atcaaaccga gcagggctgt gtgaaacatg 2400gttgtaatat gcgactgcga acactgaact ctacgccact ccacaaatga tgttttcagg 2460tgtcatggac tgttgccacc atgtattcat ccagagttct taaagtttaa agttgcacat 2520gattgtataa gcatgctttc tttgagtttt aaattatgta taaacataag ttgcatttag 2580aaatcaagca taaatcactt caactgctaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aa 2632<210> 5<211> 266<212> DNA<213> Homo sapiens<400> 5cattttcata tccaagatca attccctctc tcagcacagc ctggggaggg ggtcattgtt 60ctcctcgtcc atcagggatc tcagaggctc agagactgca agctgcttgc ccaagtcaca 120cagctagtga agaccagagc agtttcatct ggttgtgact ctaagctcag tgctctctcc 180actaccccac accagccttg gtgccaccaa aagtgctccc caaaaggaag gagaatggga 240tttttctttt gaggcatgca catctg 26权利要求
1.由对序列表中序列1记载的氨基酸序列进行取代、缺失、或附加一个或多个氨基酸后的氨基酸序列构成的，且具有细胞增殖抑制活性的蛋白质。
2.由对从序列表中序列2记载的DNA序列、序列3记载的DNA序列和序列4记载的DNA序列构成的DNA序列组中选择的DNA序列进行取代、缺失、或附加一个或多个DNA后的DNA序列组合物，且具有细胞增殖抑制活性的多核苷酸。
3.从由序列表中序列2记载的DNA序列、序列3记载的DNA序列和序列4记载的DNA序列构成的序列组中选择的DNA序列编码的RNA。
4.含有从由序列表中序列2记载的DNA序列、序列3记载的DNA序列和序列4记载的DNA序列组合物序列组中选择的DNA构成的DNA的反义DNA或其衍生物的反义多核苷酸。
5.含有权利要求3记载的RNA的反义RNA的反义多核苷酸。
6.一种细胞增殖抑制剂，其特征是由含有序列表中序列1记载的氨基酸序列的蛋白质组成。
7.一种细胞增殖抑制剂，其特征是由含有序列表中序列2记载的DNA序列的多核苷酸组成。
8.一种细胞增殖抑制剂，其特征是由含有序列表中序列3记载的DNA序列的多核苷酸组成。
9.一种细胞增殖抑制剂，其特征是由含有序列表中序列4记载的DNA序列的多核苷酸组成。
10.一种癌治疗剂，其特征是由含有序列表中序列1记载的氨基酸序列的蛋白质组成。
11.一种癌治疗剂，其特征是它是由含有序列表中序列2记载的DNA序列的多核苷酸组成。
12.一种癌治疗剂，其特征是由含有序列表中序列3记载的DNA序列的多核苷酸组成。
13.一种癌治疗剂，其特征是由含有序列表中序列4记载的DNA序列的多核苷酸组成。
14.一种癌论断试剂，其特征是将含有序列表中序列1记载的氨基酸序列的蛋白质作为标准参照物使用。
15.一种癌论断试剂，其特征是将权利要求1记载的蛋白质作为标准参照物使用。
16.一种癌论断试剂，其特征是将含有由序列表中序列2记载的DNA序列、序列3记载的DNA序列和序列4记载的DNA序列组合物序列组中选择的DNA序列的多核苷酸作为标准参照物使用。
17.一种基因治疗用组成物，其特征是将含有由序列表中序列2记载的DNA序列、序列3记载的DNA序列和序列4记载的DNA序列组合物序列组中选择的DNA序列的多核苷酸作为治疗基因。
18.权利要求17记载的基因治疗用组成物，其特征是所述治疗基因包含在病毒载体中。
19.权利要求18记载的基因治疗用组成物，其特征是所述病毒载体是腺病毒载体。
全文摘要
分离在包括癌细胞在内的无限增殖化细胞中表达减少、消失的基因，确定其DNA序列，再通过该基因的表达使细胞增殖抑制蛋白质产生，上述基因和蛋白质可以用作癌症等疾病的基因诊断、基因治疗在内的论断试剂或治疗药。
文档编号A61K48/00GK1402784SQ00816603
公开日2003年3月12日 申请日期2000年8月30日 优先权日1999年11月19日
发明者難波正义, 辻俊也 申请人:久光制药株式会社