专利名称：包括空心“种子”、优选金属“种子”的治疗用递送系统及其应用的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及一种用于例如质粒、反义或有义寡核苷酸、病毒载体等这样的核酸序列的新型递送系统，它包括空心“种子”、优选金属“种子”，其中包囊有一种在例如肿瘤这样的靶部位上引起治疗作用的核酸序列或其它非放射性核素活性剂(优选细胞因子)、毒素或其组合物，以及任选的包囊有例如放射性核素或其它细胞毒性剂的另一种治疗剂。在一个特别优选的实施方案中，所述的核酸序列编码一种放射致敏(sensitizing)基因。本发明进一步涉及这类空心“种子”(优选金属“种子”)的递送系统作为治疗剂的应用、特别是作为用于治疗肿瘤的治疗剂的应用。
在包括化疗、免疫疗法和基因疗法在内的不同治疗手段中，后者看起来可以提供这种潜能，但是目前还存在阻止基因疗法便利实施的障碍的实际限制。系统性给予基因工程载体的方法为原发性和转移性疾病提供了治疗手段。然而，肿瘤生理学存在许多与化疗手段面临的相同障碍、特别是对于在给药区域中带有生成物的不均匀灌注的肿瘤更是如此。
导入能够在人体细胞中表达的DNA载体这一手段形成了基因疗法的基本前提。能够携带DNA进入细胞的载体的复杂组成，范围包括从质粒、非依赖性自我复制环状DNA分子到腺病毒和疱疹病毒。一般来说，将基因工程方法用于修饰病毒基因以便使病毒不能够复制。
已经研发出了将基因递送至癌细胞以用于表达细胞毒性或放射致敏剂的多种载体。通常将这些递送的载体用于将含有病毒的溶液直接注入肿瘤。目前，这是一种缓慢而难以控制的方法，它可以导致所述试剂不均匀地沉积在肿瘤内。这种肿瘤内的基因递送可以包括注入遍及肿瘤块内的单一或多个位置的步骤。将基因或细胞因子递送入肿瘤提供了一种特别有吸引力的选择。
对肿瘤、特别是较大肿瘤的辐射致敏已经成为一个长期目标，而其有效性部分受到肿瘤生理学的限制。例如，美国专利号US 4,891,165中公开了将放射性物质包囊入两个联锁金属套管的技术，其中所述的联锁金属套管由诸如钛、金、铂、不锈钢、钽、镍合金或铜或铝合金制成。美国专利号US 4,994,013中公开了一种放射性“种子”颗粒状物，它包括包敷了可吸附放射性物质的粘合剂物质的金属棒条。美国专利号US5,713,828中描述了一种种子形状的基质，它包括包敷了在肿瘤部位上使用的放射性物质的空心外层金属或合成管。该空心管带有开口或孔眼以及开口端，以便使诸如针头这样的手术器械从其中通过。将上述全部的种子”移植到受疾病侵袭的部位、然后照射。
将药物或遗传物质递送至肿瘤部位以用于辐射致敏的其它方法包括由美国专利号US 5,756,122中公开的那些方法，该文献中公开了脂质体包囊的核酸。将诸如反义DNA这样的高分子量多核苷酸包囊并递送至肿瘤部位。美国专利号US 4,674,480中也公开了用于递送至肿瘤部位的包囊的药物或核酸。在蛋白质、脂肪、细胞组织或聚合物内进行包囊。通过照射或热解使所需包囊的药物或核酸释放。
目前已经开发出了如上所述的以机械方式对“种子”和包囊物质进行间质(interstitial)递送以用于放置近距治疗源的放疗的技术。例如，通常通过在整个肿瘤块内均匀放置包囊的放射性颗粒样物来治疗前列腺癌、头颈癌、乳腺癌、胰腺癌和肉瘤。近来已经开发出了用于治疗前列腺癌的超声波引导的经会阴的放射性“种子”的放置技术和用于治疗成胶质细胞瘤的立体定位引导的放射性“种子”的放置技术。参见HohnH.H.，Juul N.，Pedersen J.E.，Hansen H.，Stroyer I.通过经直肠的超声检查控制的经会阴的125碘“种子”在前列腺癌中的植入”(Transperinal125iodine seed implantation in prostate cancer guided by transrectalultrasonography)，《泌尿科学杂志》(J.Urol.)，130283-286，1983；BlaskoJ.C.，Radge H.，Schmacher D.，“使用经直肠的超声波和模板引导的用于前列腺癌的经会阴皮下的碘-125植入”(Transperineal percutaneousIodine-125 implantation for prostatic carcinoma using transrectalultrasound and template guidance.)-《内分泌/高温肿瘤学》(Endocurie/hyperthermia Oncol.)，3131-139，1987；Hilaris B.S.“高剂量比例近距治疗的发展和一般原理”(Evolution and general principlesof high dose rate brachytherapy)，见于Nag S(编辑)《高剂量比例近距治疗》(High dose rate brachytherapy)教科书，Futura PublishingCompany Inc.，Armonk，NY，1994。一个特别是Best Industries，Inc.这样的公司已经成为含有放射性同位素的金属“种子”的设计、开发和制造领域的领导者。
然而，就本发明者所了解到的而言，从未提出过将这类空心“种子”递送系统用于将核酸序列递送至(例如肿瘤细胞)这样的靶部位的技术方案。更确切地说，以举例方式，现有的实现基因递送的方法包括脂质体递送系统、导入表达所需核酸序列的细胞的技术，和将例如病毒或反义寡核苷酸这样的裸DNA直接注射在例如肿瘤这样的靶部位上的技术。如上所述，这类递送方法一般是无效的，因为它们作用缓慢且不易控制。由于所述的治疗用核酸序列一般不会达到例如肿瘤中细胞的所有所需的部位，由此上述方法是不理想的。
发明目的本发明的主要目的是避免用于在体内将核酸序列递送至例如肿瘤这样的靶部位的常规方法和材料中出现的难题。
本发明的一个更为具体的目的是提供一种体内递送例如病毒这样的核酸序列的新型系统，它包括小空心“种子”、优选金属或聚合物的小空心“种子”，其中包囊有至少一种例如病毒这样引起治疗作用的核酸序列和诸如放射性核素这样可选的另一种治疗剂。
本发明的另一个具体的目的是提供实现基因疗法的新型方法，由此将例如病毒中含有的所需核酸序列递送至靶部位，该方法通过在小空心“种子”、优选由金属或聚合材料制成的小空心“种子”中包囊所需的核酸序列来实现，通过诸如应用植入枪、导管、注射器等这样的方法且进一步包括立体定位手术、超声波、CT和MRI引导，可以将所述的空心“种子”精确插入所述的靶部位(例如肿瘤)，从而证实空心“种子”的有效的均匀间质分布和其中包含的核酸序列的递送。
本发明的另一个更为具体的目的是提供一种通过将给予放射致敏基因和电离辐射联用来治疗肿瘤的新型方法，该方法通过使用小空心“种子”、优选由金属或聚合材料制成的小空心“种子”来进行，这种空心“种子”可以递送包囊的放射致敏基因和电离辐射，其中可以以相同或不同的空心“种子”递送放射致敏基因和电离辐射。
本发明的另一个具体目的是提供一种用于将非核酸的治疗剂递送至靶部位的新型方法，所述的治疗剂特别是例如生物活性蛋白或多肽类这样的治疗剂，诸如细胞因子、生长因子、免疫毒素、治疗性抗体、激素等；该方法通过下列步骤来进行给予一种小空心“种子”、优选由金属或聚合材料制成的小空心“种子”，在所述的小空心“种子”中包囊有所述的治疗剂；且通过立体定位手术、超声波、CT或MRI引导而经肉眼观察方式确定所述装置的确切放置位置。
本发明的一个具体目的是提供用于治疗前列腺癌和脑肿瘤的改进方法，该方法包括 小空心“种子”、优选由金属或聚合材料制成的小空心“种子”的体内递送，这种小空心“种子”中包囊有治疗用核酸序列、特别是放射致敏基因，其任选地与电离辐射结合使用。特别将这些方法用于治疗患有放射或药物治疗后癌症复发的受治疗者。发明详述本发明提供了将核酸序列和其它治疗剂靶向至例如肿瘤这样的靶部位的新型方法和递送系统，所述的递送系统主要包括小空心“种子”、优选由金属、金属合金或例如可生物降解的聚合物这样的生物相容性聚合物制成的小空心“种子”，其中包囊有至少一种核酸序列或另一种例如生物活性蛋白或多肽这样的治疗剂，诸如细胞因子、激素、生长因子、免疫毒素、细胞毒素、抗体、治疗酶或其组合物/接合物等。根据本发明，通过诸如植入枪、注射器或导管这样的间质递送方法将小空心“种子”、例如由金属制成的小空心“种子”递送至例如肿瘤这样的组织内的精确部位，所述方法进一步包括以肉眼观察证实以便确保“种子”的精确(毫米精确度)放置的步骤，该步骤例如通过立体定位手术、超声波、CT或MRI引导来进行。这些“种子”、优选由金属或聚合材料制成的“种子”具有空心构型，其中排列有一个或多个能够使所述空心“种子”有效递送至所需部位的孔，其中它们通过扩散释放治疗剂(例如核酸序列)。
目前优选的构型是一种小管，优选由金属或聚合材料制成的小管，它可以在一端或两端开口，它具有的长度在0.02-2.0英寸、更优选0.05-0.5英寸且最优选0.16-0.25英寸范围内改变；它具有的直径在0.004-0.2英寸的范围、更优选0.01-0.10英寸的范围且最优选0.015-0.050英寸的范围；它具有的厚度在0.0005-0.5英寸、更优选0.001-0.2英寸且最优选0.002-0.008英寸的范围；且它带有例如圆形或矩形这样使所述治疗剂从所述管中扩散出来的一个或多个孔，这些孔的直径范围在0.006-0.18英寸、更优选直径范围在0.015-0.025英寸且最优选直径范围在0.01-0.03英寸。
本发明主题的空心“种子”递送系统的优选设计方式是一种具有0.197英寸长度、0.041英寸直径、0.0035英寸壁厚度且包括具有约0.020英寸直径的一个或两个孔的空心金属管。
然而，预计其它空心“种子”构型也可适用于本发明。它们的实例包括矩形、球形、正方形、长椭圆形及其组合形式。本发明主题的空心“种子”递送系统的最重要的方面在于它必须具有用于精确间质递送的一定大小，所述的精确间质递送例如可以通过立体定位手术、超声波、CT和MRI来证实；且所述的递送系统应进一步带有使包囊的治疗剂(例如病毒DNA)从其中受控扩散的一个或多个开口。这些开口也可以具有不同的构型，包括矩形、正方形、球形、长椭圆形及其组合形式。唯一关键的特征在于这类开口必须具有使包囊的治疗剂(例如核酸)以用于有效治疗所需的扩散速率扩散的一定大小和构型。
所述的“种子”优选由适合于体内应用且进一步显示出所需的机械特性的金属或金属合金构成，即可以将其制成所需的构型并将其以间质方式递送至诸如肿瘤这样的靶部位。这类金属和金属合金的实例包括这样一些物质，它们包括铂、钛、不锈钢、银、金和其它已知的生物相容性和/或组织可吸收的金属材料。由于成本、生物特性和机械特性的原因，所以用于构成所述的金属“种子”的优选的金属是不锈钢和高纯度的钛金属。
更优选钛金属的等级如美国物质检验协会F67-69中“涉及手术用的非合金Ti的标准说明”(″Standard Specifications for Unalloyed Ti forSurgical Implications″)中所指定。已经将这样等级的钛用于癌症的间质治疗的手术植入物。合适的钛物质的登记号包括NR-460-S-165-S、NR-460-S-160-S和GA-645-S-101-S。
如上所述，所述的空心“种子”还可以由聚合材料构成、优选由可生物降解的聚合材料构成。合适的聚合物对本领域技术人员来说是众所周知的且以举例的方式包括聚丙烯、聚丁烯、聚乙烯吡咯烷酮等。这类聚合物的合成及其在本发明所需的空心“种子”构型中的构造对本领域技术人员而言也是充分了解的。
用于本发明主题的“种子”递送系统的合适构型包含在附
图1-12中。然而，也可以将生物适合性聚合物用于生产这类“种子”。
附图2图示了含有用于储存本发明药物递送装置的小孔的单元(block)。
附图3图示了用于本发明的具有0.197英寸长度、0.0035英寸壁厚度、0.041英寸直径和具有0.020英寸直径的圆形孔的管。
附图4图示了具有0.197英寸长度、0.41英寸直径、0.0035英寸壁厚度和约0.020英寸直径的两个圆形孔的另一种管的设计方式。
附图5图示了具有0.197英寸长度的不同管形瓶样设计方式，它由不同直径的两部分组成，其中较长直径的部分(直径为0.041英寸)包括使包囊的活性剂扩散的孔(直径为0.020英寸)和进入较小直径部分(直径为0.02英寸)的锥形部分；且其中两部分的壁厚度均为0.0035英寸。
附图6图示了具有0.197英寸长度、0.0035英寸壁厚度、直径为0.020英寸的允许扩散的孔的另一种管形设计方式且管直径为0.041英寸。
附图7图示了具有0.197英寸总长度、0.0035英寸壁厚度和0.041英寸直径(较大的直径部分)的另一种管形设计方式(瓶样构型)，其中带有长度为0.039英寸的矩形开口。
附图8图示了具有0.197英寸总长度、0.0035英寸壁厚度、0.041英寸直径和长度为0.118英寸的矩形开口的另一种管形设计方式。
附图9描绘了具有0.197英寸长度、0.035英寸壁厚度、0.041英寸直径和长度为0.197英寸的矩形开口的另一种管形设计方式。
附图10描绘了具有0.197英寸长度、0.41英寸直径(总计)、0.035英寸壁厚度和长度为0.039英寸的两个矩形孔的另一种管形设计方式。
附图11描绘了具有0.197英寸总长度、0.041英寸直径(较大部分)、0.035英寸壁厚度、长度为0.039英寸的矩形开口和直径为0.020英寸的环状开口的另一种瓶样管形设计方式。
附图12描绘了具有0.197英寸总长度、0.041英寸直径、0.035英寸壁厚度和直径为0.020英寸的两个圆形孔的另一种瓶样管形设计方式。
带有不同类型孔眼的“种子”使得药物按照不同的速率释放，例如可以将矩形孔用于以快速速率释放待在肿瘤内释放的化疗药物。可以将球形/环状孔用于以相对缓慢的速率将生物制品递送至肿瘤部位。还可以给另外称作“基因种子”(″GeneSeeds″)的本发明主题的“种子”中填充含有遗传药物(病毒、质粒等)、化疗药、放射性核素、毒素、细胞因子、治疗酶、抗生素、抗体、及其偶联物/组合物等的药物混合物。所述的管优选由不锈钢、金、钛、铂或其它生物相容性金属或金属合金制成。这些管还可以由合适的生物相容性聚合材料制成。
本发明主题的空心“种子”递送系统的其它期望特征在于在将含有例如病毒这样的所需治疗剂的溶液置于管中后可以将其冷冻在极低的温度下(即约-70℃下)而不会影响所述空心“种子”的所需特性。因此，可以将本发明主题的“种子”保持冷冻至将它们导入患者体内为止，由此维持稳定性并将生物污染的风险降低到最低限度。可以将含有所述治疗剂的“种子”本身保存在冷冻状态下或可以将其放置在可以在极低温度下保存的特别制造的金属药筒中。适合于储存放射性“种子”的“种子”药筒在近距治疗工业领域中是可商购的(Best Industries，Inc.，Springfield，VA；Micks Radio Nuclear，Bronx，NY；Manan Medical，Northbrook，IL，etc.)且例如可以根据需要将其改变以便可以将它们保存在极低的温度下。
例如，可以将本发明的钛“种子”置于转移装置中，这种转移装置包括适合于在-70℃下冷冻的矩形铝单元，该单元中含有适合于插入钛金属“种子”的孔。
可以通过公知方法制备用于本发明的空心“种子”。在这类制造领域中有特定的专门技术的一个制造商是位于Virginia的自1977年以来已经制造和发放出医药装置和放射性同位素的BEST Industries，Inc.。该公司特别具有制造用于植入癌症患者体内的放射性“种子”的广泛经验。然而，本领域技术人员可以应用已知方法和物质构成用于本发明的金属“种子”装置。优选在制造后将该“种子”洗涤、高温蒸汽灭菌并在插入所需治疗剂前干燥。
然后给空心“种子”中包囊例如核酸序列或治疗用蛋白质或多肽这样所需的治疗剂、诸如细胞因子或诸如化疗药物、毒素、治疗酶、接合物或放射性标记的物质这样的其它细胞毒性物质。例如，通过将含有治疗剂的适宜直径的注射器针头(14G-26G针头)插入所述装置来进行该步骤。可以使用自动分散装置来进行该步骤。例如，然后优选将含有所述物质的金属“种子”冷冻在-70℃下，直至达到维持无菌性和稳定性的体内应用为止。
在冷冻填充的管前，可以对其进行包敷以便确保对所述治疗剂的包囊，直到将所述“种子”递送至受疾病侵袭体内的所需部位为止。所述的包敷材料应使得它在进入体内时可热降解。这类包敷材料可以选自诸如聚葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮、聚(双(对羧基苯氧基)-丙烷)及其衍生的共聚物这样的聚合物和诸如明胶、人血清、白蛋白、纤维素等这样的生物聚合物。另一方面，所述的包敷材料可以在辐照时分解。这类包敷材料的实例参见美国专利号US 4,674,480，将该文献引入本文作为参考。美国专利号US 4,674,480中还公开了将抗体应用于所述“种子”表面上以便将该“种子”靶向至受疾病侵袭的身体内部的表达靶向的抗原的细胞。所述的包敷过程还可以包括鉴定或示踪所述“种子”的手段，诸如本领域技术人员公知的放射性标记。
可以通过本领域技术人员所公知的任一方法递送所述的治疗装置或“种子”。例如，可以通过使用植入枪、导管、注射器等植入或插入所述的管。优选“种子”的递送过程包括通过诸如立体定位手术、超声波、CT或MRI这样的方式对其放置位置进行肉眼观察确定的步骤。优选将所述“种子”彼此以接近的间隔放置，诸如以均匀分布的方式使“种子”之间的距离为3-5mm。正如本领域技术人员所公知的，其它分布方式可以根据面积和所治疗的特定疾病区域来选择。
在将“种子”递送后，该“种子”的内含物从其中扩散至受疾病侵袭部位中的组织周围。如果将包敷材料置于所述“种子”上，那么扩散会在所述包敷材料热降解或核降解后发生。
本文所述的“种子”中可以填充一种治疗物质，以便治疗不同的疾病、特别是癌症。可以通过对受疾病侵袭的组织放射致敏和/或通过对受疾病侵袭的区域实施遗传疗法来治疗癌症。本领域技术人员会理解治疗剂量取决于所选择的治疗剂、所治疗的癌症肿瘤的大小和部位和有关患者的年龄、体重和健康情况。通常递送的有效剂量约为0.1ml的用量(按体积计)。由此必须将治疗剂的浓度进行调整以便在由“种子”针对的肿块内释放有效量。典型的有效剂量在约0.00001克-10克活性剂、例如治疗用核酸序列、蛋白质或多肽的范围。
在优选的实施方案中，金属“种子”包括治疗用核酸序列、例如放射致敏基因、反义DNA、核酶、病毒、质粒等。在一个特别优选的实施方案中，将用所述“种子”递送放射致敏基因与电离辐射联用。放射致敏基因的实例在本领域中是公知的。
可以在本发明主题的“种子”中包含的合适病毒载体包括反转录病毒载体、腺病毒载体和单纯疱疹载体。
以举例方式，可以导入本发明主题的“种子”中的核酸序列包括那些编码血管生成抑制剂、细胞因子、编程性细胞死亡诱导物、细胞生长抑制剂、影响细胞周期的基因、毒素、激素、酶等的核酸序列。
可以导入本发明主题的“种子”递送装置的其它治疗剂(非核酸)的实例包括细胞因子，诸如TNFα、TNFβ；白细胞介素；干扰素，诸如α、β、γ；集落刺激因子；细胞毒素；激素；细胞生长抑制剂；治疗酶等。
在一个优选的实施方案中，将本发明主题的“种子”递送系统用于治疗癌症，例如包括那些中枢神经系统、前列腺、头颈、肝、胰腺、乳腺、子宫、肺、膀胱、胃、食道和结肠的癌症。
然而，本发明还应适合于治疗其它疾病，例如通过用消炎药靶向炎症部位的炎症疾病；通过用诸如抗生素、抗病毒药、抗真菌药等这样的抗感染药靶向感染部位的感染。例如，可以将本发明主题的“种子”递送系统以间质方式递送至肺以便对患有肺炎的人释放高剂量的抗生素。
如上所述，本发明特别优选的应用是用于治疗放疗后复发的癌症受治疗者。优选用含有放射致敏基因的“种子”和电离辐射治疗这些受治疗者。放射源可以是诸如铱-192、碘-125、钯-103、钇-90、铈-131、铈-134、铈-137、银-111、铀-235、金-148、磷-32、碳-14这样的放射性核素和铷、钙、铋、钡、钪、钛、铬、锰、铁、钴、镍、铜、锌、锆、铟、钇、镉、铟、非土族元素(the non-earths)、汞、铅、镅、锕和镎的其它同位素。其放射性剂量足以引起例如抗肿瘤作用这样的治疗作用。所述剂量随特定的放射性同位素和诸如所治疗患者的体重、疾病和总体情况的不同而改变。
本发明主题的空心“种子”递送系统用于递送例如核酸序列这样的治疗部分的功效会在异种移植动物模型中得到证实。例如，给小鼠植入诸如乳腺癌和鳞癌这样的人体肿瘤且然后用包括核酸序列或细胞因子的本发明“种子”和电离辐射源进行治疗。
在下面的实施例中描述了上述新型治疗装置。应理解本发明既不限于上述特定的实施方案也不限于下面所列的实施例，而是以本说明书为依据由下面的权利要求来定义。
实施例A.“种子”的设计本过程的第一步是使“种子”的设计最优化以便满足确定的临床需求。尽管我们已经制成了某些原型“种子”，但是可变的因素包括“种子”的大小、形状和提供用于扩散的入口的孔的数量。制造200粒“种子”的批量以便用于所述在动物肿瘤模型中进行的实验。
原型“基因种子”由一种金属管组成，该金属管由适合于医疗应用的具有0.005英寸厚度的高纯度钛金属制成。低重量、高强度的肽是用于多数可植入装置的金属的选择。使用如美国物质检验协会F67-69中“涉及手术用的非合金Ti的标准说明”(″Standard Specifications forUnalloyed Ti for Surgical Implications″)中所指定的钛金属等级。已经将相同等级的钛用于间质治疗癌症的手术植入物。请参照经证实来源的登记号和装置的文件号NR460-S-165-S、NR-460-S-160-S和GA-645-S101-S。该管可以是一端封闭的或可以是两端开口的。钛管可以含有一个或两个直径为0.5mm的孔(参见附图1)。我们会研究不同的设计方案以便确定用于基因递送的最佳“种子”构型。我们所考虑的不同设计包括下列方案
a.钛管的一端开口、带有两个直径为0.5mm的孔；b.钛管的两端开口、带有两个直径为0.5mm的孔；c.钛管的一端开口、带有一个直径为0.5mm的孔；d.钛管的两端开口、带有一个直径为0.5mm的孔。
我们已经选择了下列设计方案用于这些最初的研究使用钛管的长度为5mm且直径为1.0和2.0mm。可以将约1-4μl体积的病毒溶液方便地置于所述“种子”内。通过改变该管的长度或直径可以改变置于“种子”中的遗传物质的体积。
无菌的“种子”适合于在加载病毒时冷冻以便易于储存和维持病毒的存活，参见Nyberg-Hoffman C，Aguilar-Cordova E.“递送过程中腺病毒载体的不稳定性及其相关的临床研究”(Instability of adenoviralvectore during transport and its implication for clinical studies)-《天然药物》(Nature Med)5955-957，1999。由于一般将病毒以冷冻方式保存(-70℃)，所以适合于根据需要起预载储存容器作用的“基因种子”的适合性是一个附加的优点。将含有病毒物质的肽“种子”置于特定的转移装置内。这些转移装置是适用于在-70℃下冷冻的矩形铝单元。这些单元中含有用于储存“基因种子”的小孔(附图2)。
“基因种子”起递送装置的作用以便冷冻生物材料并将其以冷冻状态运送至医院，直到准备给患者使用为止。如果需要，可以将“基因种子”置于特别制成的金属药筒内并保存在极低的温度下。用于储存放射性“种子”的“种子”药筒已经是近距治疗业中可得到的且可以将这些药筒进行改进以便于在低温下应用。B.“种子”的制造将高纯度的钛管(医疗用等级的金属)切成所需的大小(±3％)。然后将这些“种子”用含有温和洗涤剂的水溶液洗涤、随后用丙酮和无菌注射用水洗涤。将经洗涤的“种子”在110℃下的烘箱内干燥约2小时。进行高温蒸汽灭菌以便确保无菌。使“种子”冷却至室温。使用适合于自动控制的特别设计的递送装置向该“种子”中加入病毒溶液。将包含“基因种子”的递送装置以冷冻方式保存在-70℃下，直到准备给动物使用为止。可以以手工方式制备少量的“种子”以便最初的前期临床研究。一旦确定了合适的构型，就可以使用Best Industries Inc.开发的专有技术大规模生产“基因种子”且近来将这种大规模的生产过程用于生产碘和钯近距治疗的“种子，参见”Suthanthiran K.“用于包囊放射性物质的装置和方法”(Device and method for encapsulating radioactive materials)-1990年1月2日的美国专利号US 4,891,165。该方法使用了一种将药物添加到“种子”中的自动配药装置。特别令人关注的是目前可得到的大部分放射性“种子”植入技术可直接适用于“基因种子”。C.基因载体导入能够在人体细胞中表达的DNA载体形成了基因疗法的基础。能够携带DNA进入细胞的载体的组成复杂，范围从质粒、独立自我复制的环状DNA分子到腺病毒和疱疹病毒。一般来说，将基因工程用于修饰病毒基因以便使病毒不能够复制。
近来开发的用于癌症疗法的有条件复制溶瘤载体为治疗对标准形式的疗法而言已经成为相当顽固性的癌症引入了一条新的途径，参见Kenney S，Pagano J，S“作为溶瘤剂的病毒“治疗用”病毒的新时代？”(Viruses as oncolytic agentsa new age for“therapeutic”viruses？)-《国家癌症研究院杂志》(J.Nat.Cancer Inst.)861185-1186，1994。此外，考虑到有复制缺陷的载体和化疗药在注射后立即对其肿瘤组织产生最高的浓度，然后随特定活性剂的不同以速率依赖性方式下降，所以将复制限制到癌症组织的条件复制型溶瘤载体在一段时间内可以倍增，并在整个肿瘤范围内扩散而达到改善的治疗作用。已经开发出了各种策略用于以有效杀伤癌症而不会对正常组织产生损害的方式来设计这类载体，参见Martuza R.L.，Malick A.，Markert J.M.，Ruffner K.L.，Coen D.M.，1991“使用遗传过程的病毒突变体对人体神经胶质瘤的实验性治疗”(Experimental therapy of human glioma by means of a geneticallyengineered virus mutant)-《科学》(Science)，252854-856，1991；Markert J.M.，Coen D.M.，Malick A.，Mineta T.，Martuza R.L.“神经系统肿瘤治疗过程中的广谱病毒疗法”(Expanded spectrum of viraltherapy in the treatment of nervous system tumors)-《神经外科学杂志》(J.Neurosurg.)77590-594，1992。单纯疱疹具有作为载体的多个优点，包括1)感染来自不同种类的各种细胞类型的能力；2)已有多种动物模型测试功效和安全性；3)已有抗病毒药物；4)较大的尺寸(153Kb)，可以支持大的和多重DNA插入片段；5)可以产生高滴度的病毒。
Robert Martuza博士已经开发出了一种载体G207，它是一种复突变的条件复制型单纯疱疹1型病毒，它缺失了34.5基因和使ICP6的基因失效的lacZ插入片段的拷贝，参见Chou J.，Kern E.R.，Whitley R.J.，Roizman B.“对g 34.5基因、即一种在培养物中生长非必需的基因具有神经毒力的单纯疱疹1型病毒的图谱”(Mapping of herpes simplexvirus-1 neurovirulence to the，a gene nonessential for growth in culture)-《科学》(Science)，2501262-1266，1990；Goldstein D.J.，Weller S.K.“单纯疱疹1型病毒诱发的核苷酸还原酶活性对病毒生长和DNA合成而言是非必需的ICP6 lacZ插入突变体的分离和特征记述”(Herpessimplex virus 1-induced ribonucleotide reductase activity is dispensablefor virus growth and DNA synthesisisolation and characterization of anICP6 lacZ insertion mutant)-《病毒学杂志》(J.Virol.)，62196-2051，1988。G207可以在癌细胞内生长并杀伤癌细胞，而不会对包括神经细胞在内的正常细胞产生毒性。最初设计G207是为了治疗恶性神经系统肿瘤。其功效最初在恶性神经胶质瘤和恶性脑膜瘤模型中得到了证实，而安全性已经在将G207接种入小鼠脑和已知对HSV-1高度敏感的灵长类的脑后得到证实，参见Mineta T.，Rabkin S.D.，Yazaki T.，HunterW.D.，Martuza R.L.“用于治疗恶性神经胶质瘤的减毒的复突变的单纯疱疹1型病毒”(Attenuated multimutated herpes simplex virus-1 for thetreatment of malignant gliomas)-《天然药物》(Nature Medicine)1938-9，1995；Yazaki T.，Manz H.J.，Rabkin S.D.，和Martuza R.L.“用一种具有复制活性的复突变的单纯疱疹1型病毒G207治疗人体恶性脑膜瘤”(Treatment of human malignant meningiomas by G207，areplication-competent multimutated herpes simplex virus-1)-《癌症研究》(Cancer Research)，554752-4756，1995；Hunter W.D.，Martuza R.L.，Feigenbaum F.，Todo T.，Mineta T.，Yazaki T.，Toda M.，Newsome J.T.，Platenberg R.C.，Manz H.J.，Rabkin S.D.“减毒的有复制活性的单纯疱疹I型病毒突变体G207在非人的灵长类中进行大脑内注射的安全性评估”(Attenuated，replication-competent，herpes simplex virus type-Imutant G207Safety evaluation of intracerebral injection in nonhumanprimates)-《病毒学杂志》(J.Virology)(即将出版)1999。
然而，G207的生长并不局限于神经系统癌症。已经证实G207可以在人乳腺癌、鳞状细胞头颈癌和人前列腺癌细胞中生长良好，且在几种动物模型中的瘤内递送后是有效的。此外，G207在激素敏感性和激素抗性前列腺癌和已经患有或在放疗前尚未患有的肿瘤中是有效的。因为G207可以在肿瘤细胞中复制且可以从细胞到细胞进行扩散，所以它比使用具有复制缺陷的载体能够更好地在肿瘤中分布。就前列腺癌而言，瘤内给予G207的功效已经得到证实，且在近期结束的研究中已经在用于HSV毒性测试的两种标准动物模型中小鼠(Balb/c)和非人灵长类(aotus)证实了瘤内接种G207是安全的。有条件复制的疱疹病毒是对适合于这种前列腺癌症疗法的革新形式而言理想的新型载体。目前G207的I期研究已经完成，它证明可以将这种有条件复制的疱疹载体以高达3×109pfu的滴度直接接种入人脑而没有神经或系统毒性。目前正在计划进行G207对恶性神经胶质瘤的II期试验。我们预计在下一年度内提交用于放射后局部复发的G207瘤内接种的人体试验的IND。本文设计的研究可以扩展这种基本原理以便在前列腺、脑或其它肿瘤和组织内更准确地递送所述载体。D.实验1.用于病毒载体和细胞因子的间质递送的“基因种子”的最优化设计给附图1中所述的4种不同类型的“基因种子”填充病毒溶液并冷冻在-70℃下。以间质方式将这些“种子”植入带有肿瘤异种移植物的小鼠体内(前列腺肿瘤模型)。熔化和病毒溶液的释放快速发生。在植入后选择的时间点处死动物并切下肿瘤。使用组织化学方法评价扩散和病毒进入肿瘤细胞的程度。最佳设计方案是使病毒物质缓慢释放，从而使得肿瘤细胞内的胞内摄取率达到最大值。
使用不同类型“种子”进行的实验“种子”设计 药物 肿瘤模型A.两个孔/一端开口 1.病毒1.前列腺肿瘤B.两个孔/两端开口C.一个孔/一端开口D.一个孔/两端开口2.人体前列腺肿瘤模型系统我们使用来自无胸腺小鼠中的LnCaP的人前列腺癌细胞系衍生的肿瘤来研究将“基因种子”用于递送含有lacZ的载体G207的功效，将其与预先进行的直接接种载体的实验步骤的功效进行比较。就每个时间点而言使用三只小鼠。如方法部分中所述生成肿瘤。当肿瘤的大小为100mm3或100mm3以上时，给它们接种“基因种子”或用含有病毒或缓冲溶液的针头进行标准接种，且使用病毒的体积和pfu相似。目标约为106-2×107pfu，而实际的用量将根据所用“基因种子”的容量和病毒溶液的滴度来决定。在接种后的第1、2、3和7天处死动物并检查肿瘤切片中lacZ表达的分布。另外进行苏木精和伊红染色以便确定坏死的区域并观察细胞形态。预实验已经证实在进行间质注射后病毒不会产生系统性作用，不过，也可以将包括肺、肝和脑在内的动物器官进行切片并评分。
实验1使用下列实验达到的特定目的I
作为“基因种子”植入后时间函数的肿瘤内病毒分布的评估
每个时间点使用三只小鼠。在最初的实验中对所有的时间点而言均进行对照组和设计方案A的实验。以所得数据为基础在植入后最相关的时间点处研究设计方案B、C和D。这种策略应减少必需的小鼠总数。类似地，在选择的时间点处也使用设计方案B、C和D进行对照组的实验。预计的结果预计非复制载体在早期时间点处达到最高分布。由于G207是一种条件复制型载体，所以预计在后期的时间点处达到最高分布。一旦检查了设计方案A的测试样品和对照品，则我们的实验方案应作相应地修改。这些实验仅使用1粒“种子”/肿瘤，预计肿瘤中使用的多重“种子”将类似地取决于用于病毒释放的最理想的单一“种子”设计。以106pfu/“种子”填充“种子”，对照组包括仅含有缓冲液的“种子”且直接将病毒溶液注入肿瘤。进行分布方式的比较。
实验2使用下列实验达到的特定目的II肿瘤生长的延缓将基于来自实验#1的数据的最佳“种子”设计方案用于肿瘤生长延缓研究。1.对照组#1带有肿瘤的小鼠2.对照组#2“种子”中的PBS3.对照组#3直接进行肿瘤内注射的病毒4.“基因种子” 含有病毒的(最佳设计)如上所述注入120-150mm3肿瘤。每个实验组使用8只小鼠。将全部动物监测30天并将肿瘤体积作为时间的函数绘图3次。在第30天或肿瘤体积超过1cm3时处死动物。
预计的结果/数据的解释我们预计肿瘤生长延缓发生在“基因种子”中和直接进行肿瘤内注射的动物体内。如果需要，使用1粒“种子”以上/肿瘤再进行实验。肿瘤生长延缓与直接肿瘤注射相比较的观察结果是，证实“基因种子”用于病毒载体递送的最终分析结果。显示出超过直接注射的“基因种子”的优越性的改进的分布实验可能需要较大肿瘤模型系统形式的较大肿瘤且可以在II期计划中予以考虑。
方法细胞系将LNCaP细胞维持在37℃下和5％CO2中的含有5％牛血清的IMEM中，向所有培养基中添加青霉素和链霉素并测试以便确保不含支原体污染。
皮下肿瘤模型全部动物的操作过程均需要得到Georgetown大学动物保护和应用委员会(Georgetown University Animal Care and UseCommittee)批准。通过腹膜内注射由84％制菌盐水、10％戊巴比妥钠(1mg/mlAbbott Laboratories，Chicago，IL)和6％乙醇组成的溶液，或吸入最低2-3肺泡浓度的甲氧氟烷使小鼠麻醉(对人体肿瘤实验而言为6-7周龄的雄性BALB/c无胸腺裸鼠)。通过皮下协腹注射0.1ml的5×106LNCaP细胞与等体积的Matrigel和LNCaP细胞的混悬液来诱发LNCaP肿瘤。用精确至0.1mm的体外测径器测量肿瘤并计算体积(V＝H×L×W)。一旦肿瘤体积达到约120-150mm3，则给肿瘤接种5-10ul含有107噬斑形成单位(pfu)的G207或病毒缓冲液(150mM NaCl，20mM Tris，pH 7.5)。使用“种子”进行的实验可能需要放置1-2粒“基因种子”以便递送相当的数量的pfu。对照组使用不含病毒的“基因种子”。在肿瘤块产生后记录肿瘤体积，当肿瘤体积大于1cm3时处死动物。
肿瘤和组织的X-gal染色将样品骤冻在用干冰冷却的异戊烷中。由每份样品制备10um厚度的恒冷箱切片。将切片固定在2％低聚甲醛的PBS溶液中10分钟、用PBS洗涤3次，并在4℃下与含有2mM氯化镁、0.01％脱氧胆酸钠和0.02％ Nomidet P(NP)-40的PBS一起保温10分钟。在32℃下将切片与底物溶液(含有1mg/ml X-gal、5mM铁氰化钾、5mM亚铁氰化钾、2mM氯化镁、0.01％脱氧胆酸钠和0.02％ NP-40的PBS)一起进一步保温3小时，然后用水洗涤一次并用含有2mM EDTA的PBS洗涤两次。在封固前将切片用苏木精和伊红对比染色。
统计学分析体内功效在本研究中测定的参数包括肿瘤的体积和存活率。使用Kaplan Meier法和Log Rank检验与对照组进行存活率比较。使用F检验与对照组进行肿瘤大小的比较。E.动物模型所有动物操作过程均在Georgetown大学医学院(GeorgetownUniversity School of Medicine)IACUC批准的方案下进行。该方案已经经过了反复评论。将6-7周龄的雄性BALB/C无胸腺裸鼠用于人体肿瘤(LNCap)异种移植。具体的注射过程描述在方法部分的“皮下肿瘤模型”中。
基于对实验#16条臂(arms)×7个时间点×3只动物/时间点＝126只动物和实验#24条臂(arms)×8只动物/臂(arms)×2次实验＝64只动物的计算结果，需要两百(200)只动物。重要的是使用异种移植模型动物，因为我们要研究间质肿瘤递送系统。
使用无菌设备和溶液进行所有的动物注射。对动物的麻醉过程描述在“皮下肿瘤模型”部分中。
按照美国兽医协会(the American Veterinary Medical Association)的安死术专门小组的建议使用CO2窒息法实施安死术。选择它的原因有(a)CO2的快速抑制和麻醉作用充分得到确立；(b)低廉、非炎性和非爆发性且当使用适当设计的设备时对人员的危害程度最低；(e)不会在生产食品的动物体内导致组织残留物的蓄积；(d)不会使细胞结构变形。
作为本文典型的本发明如下面的权利要求中所述。
权利要求
1.一种用于通过间质药物递送将治疗剂递送至受治疗者中靶部位的方法，该方法包括下列步骤(i)生产一定大小的空心″种子″，这种大小使得可以将这类“种子”体内插入靶部位，且在这类空心“种子”的内部包囊有至少一种非放射性核素治疗剂，这种治疗剂可以因所述“种子”中存在分散的一个或多个孔而从所述“种子”中扩散出来；(ii)在所述受治疗者中的精确靶部位上插入一种或多种含有所述治疗剂的“种子”，和(iii)使所述治疗剂从所述“种子”中扩散至所述的靶定部位上。
2.权利要求1所述的方法，其中所述的“种子”具有在一端或两端上开口的管状构型。
3.权利要求1所述的方法，其中所述的“种子”具有的长度在0.002英寸-2英寸的范围、直径在0.004英寸-0.2英寸的范围、壁厚度在0.0005英寸-0.5英寸的范围，且该“种子”带有平均直径在0.0001-0.1英寸范围的一个或多个孔。
4.权利要求1所述的方法，其中所述的空心“种子”由金属或金属合金制成，其包括至少一种选自铂、不锈钢、钛、银和金的金属或金属合金。
5.权利要求1所述的方法，其中所述的“种子”由生物相容性聚合材料组成。
6.权利要求1所述的方法，其中优选将所述的“种子”递送至组织或器官内的特定靶部位，且其中通过选自立体定位引导、CT、超声波和MRI的一种方法而以肉眼方式确定精确的放置位置。
7.权利要求1所述的方法，其中将所述的空心“种子”植入到肿瘤内的一个或多个部位上。
8.权利要求7所述的方法，其用于治疗前列腺癌、头颈癌、脑癌、乳腺癌、肝癌或胰腺癌。
9.权利要求1所述的方法，其用于使治疗剂靶向至包括癌症损害、感染或炎症在内的部位。
10.权利要求1所述的方法，其中所述的插入方法(ii)允许将所述“种子”放置在靶部位的约1毫米之内。
11.权利要求1所述的方法，其中所述的空心“种子”包含一种核酸序列。
12.权利要求11所述的方法，其中所述的核酸序列是病毒、病毒载体、质粒、反义寡核苷酸或核酶。
13.权利要求12所述的方法，其中所述的核酸序列是一种病毒载体。
14.权利要求1所述的方法，其中所述的治疗剂是一种细胞因子。
15.权利要求1所述的方法，其中所述的治疗剂是一种放射致敏基因。
16.权利要求15所述的方法，其中所述的空心金属“种子”进一步包括一种放射性同位素。
17.一种药物递送系统，它包括下列组成(i)具有一定大小的小型空心″种子″，这种大小使得可以以高精确度将这类“种子”体内插入靶部位；且在这类空心“种子”的内部包囊有(ii)至少一种治疗剂；和(iii)进一步带有在所述空心“种子”中分散的一个或多个孔，所述孔具有一定直径的可以使所述包裹的治疗剂受控扩散。
18.权利要求17所述的药物递送系统，其中所述的治疗剂是核酸序列、细胞因子、激素、生长因子、毒素或抗体。
19.权利要求16所述的药物递送系统，其中所述的空心“种子”是一种一端或两端开口的空心管。
20.权利要求19所述的药物递送系统，其中所述的管具有的长度在0.002-3英寸的范围、直径在0.004-0.4英寸的范围，且壁厚度在0.0005-0.5英寸的范围。
21.权利要求17所述的药物递送系统，其中所述的孔具有的平均直径在0.0001-0.2英寸的范围。
22.权利要求17所述的药物递送系统，它包含细胞因子或核酸。
23.权利要求17所述的药物递送系统，其中所述的“种子”由一种金属制成。
24.权利要求17所述的药物递送系统，其中所述的“种子”由一种生物相容性聚合物制成。
全文摘要
本发明提供了空心金属“种子”，其中包囊有一种例如核酸或细胞因子这样的治疗剂，该治疗剂可以通过所述“种子”中分散的一个或多个孔从所述“种子”中扩散出来，且由此被递送至例如肿瘤细胞这样的靶部位。可以优选使用立体定位引导、超声波、CT或MRI将这些空心金属“种子”精确地递送至例如肿瘤内的靶部位。
文档编号A61M36/04GK1391490SQ00813261
公开日2003年1月15日 申请日期2000年8月21日 优先权日1999年8月25日
发明者A·德特西罗, M·琼, M·R·萨布拉曼尼 申请人:乔治敦大学