犬埃里希氏体的基因和疫苗的利记博彩app

专利名称：犬埃里希氏体的基因和疫苗的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及兽医病原体领域。本发明更具体地涉及细菌的犬病原体犬埃里希氏体的特定基因的序列，以及该技术在开发疫苗中的应用。
犬埃里希氏体是小的，专性胞内的革兰氏阴性细菌。该细菌是犬单核细胞埃里希病(CME)的致病因子，CME是一种主要感染犬的蜱传疾病。犬埃里希氏体最常见的载体是褐色犬蜱Rhipicephalussanguineus。该病最早于1935年描述于阿尔及利亚。随后，于1962年在美国得以确认，但目前已传播到世界上的很多地方。在越南战争期间，犬单核细胞埃里希病吸引了很多关注，当时有160条军犬死于犬埃里希氏体感染。当前，还没有抗犬埃里希氏体的免疫接种措施。该病是威胁生命的疾病，一直是兽医和宠物拥有者所关心的重要健康问题。
犬单核细胞埃里希病是传染性的血液病。该病的主要特征是细胞血液因子的减少。犬埃里希氏体在白血细胞(白细胞)中生长和繁殖，最终影响整个淋巴系统，并破坏多个器官。通过靶向白血细胞，这些细胞快速死亡。这些死亡的血细胞主要迁移至脾脏，结果使脾脏肿大。骨髓意识到白血细胞的丧失，开始工作以形成新的健康细胞。骨髓将不成熟的细胞发送出去，这些不成熟的细胞不能适当地工作。这些不成熟的细胞经常模仿白血病患者的那些细胞，因此该病被误诊为白血病。犬单核细胞埃里希病使犬易患多种癌症。
犬单核细胞埃里希病分三个时期。第一期即急性期很象是轻微的病毒感染。在急性期，大多数(如果不是全部的话)损害是可逆的，动物可能会恢复。此阶段的治疗最为有效，迫切需要早期检测。然而，如果不进行治疗，动物会发展成亚临床(第二)期和/或慢性(第三)期。当动物到达慢性期时，细菌生物体已定居于骨髓内。此期的很多犬遭遇大面积的内出血，或出现致命的并发症，如突然中风，心脏病突发，肾衰竭，脾破裂或肝脏衰竭。
可以在体外，在哺乳动物-衍生的细胞系(DH82)中培养犬埃里希氏体。连续维持这些细胞是困难的，因为在细胞培养物中必须每两周添加一次原代单核细胞(骨髓中发现的白血细胞)。培养物生长很慢，而培养基很昂贵。
有关犬埃里希氏体基因组中的基因的资料主要集中在16S rRNA基因上。以前的工作已测定了该基因的序列，所述基因是埃里希氏体家族成员以及世界上大多数生物中普遍存在的组分。该基因在所有生物中的高序列同源性使其难以成为疫苗开发的候选基因。如果希望得到抗此致命疾病的疫苗，必须在该基因组中寻找其它基因。
对16S rRNA基因的测序结果表明犬埃里希氏体与人埃里希病的新病原体恰菲埃里希氏体密切相关(98.2％同源性)。当用抗犬埃里希氏体，恰菲埃里希氏体和尤氏埃里希氏体(另一种人埃里希病的病原体)的抗血清探测时，犬埃里希氏体的Western印迹是相似的，表明这三种埃里希氏体之间有密切的抗原关系(Chen等，1994)。
已开发出间接荧光抗体试验(IFA)用于检测犬单核细胞埃里希病。IFA检测犬血液中抗入侵生物的抗体的存在。不幸的是，该试验不是总准确。有时，处于急性期的犬被检测为阴性，因为它们的免疫系统延迟形成抗体。如果慢性期的滴度低的话，会出现另一种错误的阴性结果。该试验的另一个缺点是可发现交叉-反应性。抗犬埃里希氏体的多克隆抗体可与恰菲埃里希氏体呈阳性反应，暗中破坏了该试验的特异性。已使用了另一种试验，即Giesma涂片来定位犬血液中实际存在的生物体。不幸的是，尽管使用了适当的染色技术和加强的胶片检查，但经常不能定位生物体。这些试验可能出现的错误使得必须为该疾病提供较好的诊断工具。
由于难以检测蜱咬伤，早期诊断感染，抑制宿主防御和该病持久感染的特性，因此犬迫切需要抗犬埃里希氏体的有效疫苗。
发明简述本发明公开了犬埃里希氏体基因的新序列资料。具体地说，已鉴定并测序了一个克隆。在此克隆内已鉴定出4种被称为ProA，ProB，ORF(功能未知的开放阅读框)和细胞色素氧化酶同系物的蛋白质。另外，已发现编码脂蛋白信号肽酶同系物的部分基因。
本发明的实施方案包括用此序列和蛋白质信息生产疫苗。本发明公开的蛋白质的抗原性很强。因此，它们作为疫苗可能是很有用的。通过此项新技术可以制备的疫苗类型包括DNA疫苗，重组疫苗和T细胞表位疫苗。
用抗犬埃里希氏体的多克隆抗体筛选文库。多克隆抗体产生自被携有犬埃里希氏体的蜱咬过的犬。用大肠杆菌宿主菌株裂解物预吸附多克隆抗体。以1,000个菌落形成单位的密度将文库铺于平皿上。将菌落转移至硝酸纤维素滤膜，用1ml预吸附的多克隆抗体探测每个滤膜。用由与碱性磷酸酶-缀合的山羊抗-兔IgG(Kirkegaard和PerryLaboratories，Gaithersburg，MD)组成的第二抗体鉴定阳性菌落，然后，用含有氮蓝四唑(NBT)和5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸(BCIP)的底物溶液显色。将阳性克隆重新筛选3次。
由此筛选方法分离出3个克隆(

图1)。最长的基因组片段(pCH4)编码4个完整的基因和1个部分基因。它完整地编码蛋白质ProA，ProB，ORF和细胞色素氧化酶同系物，并含有脂蛋白信号肽酶同系物的部分序列。ProA和ProB位于单个操纵子上。通过本领域已知的，并列入参考文献(Chang等，1987；Chang等，1989a；Chang等，1989b；Chang等，1993a；Chang等，1993b)的技术进行限制性内切核酸酶消化作图和DNA测序。简单地说，通过在ABI PRISM 377型DNA系统上进行自动化DNA测序来测定DNA序列。通过引物步移测定两条链上的完整核苷酸序列。测序反应的热循环利用了Taq DyeDeoxyTMTerminator Cycle测序试剂盒。通过使用国家生物技术信息中心(NCBI)的BLAST网络服务器，在数据库中搜索同源蛋白质(Althchul等，1990；Gish等，1993)。序列信息对犬埃里希氏体基因进行测序。克隆的片段含有5,300个核苷酸，并编码4种蛋白质。在羧基末端也有一个部分基因。SEQ.ID.NO.1是完整的核苷酸序列。SEQ.ID.NO.2和3是SEQ.ID.NO.1的核苷酸12至533的翻译产物，并编码细胞色素氧化酶同系物。细胞色素氧化酶对毒力至关重要，因此可用于候选疫苗。SEQ.ID.NO.4和5是SEQ.ID.NO.1的核苷酸939至2252的翻译产物，并编码ProA。SEQ.ID.NO.6和7是SEQ.ID.NO.1的核苷酸2258至3664的翻译产物，并编码ProB。初步证据表明ProA和ProB是蛋白酶。SEQ.ID.NO.8和9是SEQ.ID.NO.1的核苷酸4,121至4,795的翻译产物，并编码具有未知功能的蛋白质ORF。SEQ.ID.NO.10和11是SEQ.ID.NO.1的核苷酸4,884至5,300的互补序列的翻译产物，并编码脂蛋白信号肽酶同系物的部分序列。脂蛋白信号肽酶是膜蛋白，本性上不大适合疫苗开发。然而，在生产疫苗时，该蛋白质仍值得研究。过量表达ProA，ProB，ORF细胞色素氧化酶和脂蛋白信号肽酶同系物在T7启动子质粒中过量表达犬埃里希氏体抗原。pRSET载体允许在T7 RNA聚合酶的存在下在大肠杆菌中进行高水平的表达，所述聚合酶对T7启动子具有强亲和性。将抗原基因亚克隆至pRSET载体之后，将亚克隆转化至F′大肠杆菌JM109菌株。为了使蛋白质表达水平最高，将转化子培养至O.D.600＝0.3，暴露于IPTG(1mM)达1小时，然后以每个细胞5-10个噬斑形成单位(pfu)的感染复数(MOI)，用M13/T7噬菌体转染。时间进程研究表明在诱导后2小时达到最大诱导。
离心收集沉淀物，将细胞重新悬浮于6M胍(PH 7.8)。通过本领域已知的，并列入参考文献(Chang等，1993c)的技术，用弗式压碎器破碎细胞，以6000rpm旋转总裂解物以分离细胞碎片。按厂商(Invitrogen，San Diego，CA)说明，在变性条件下使用固定化金属离子亲和层析(IMIAC)纯化每种蛋白质。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质样品，用考马斯蓝染色之后进行观察。疫苗开发在本发明之前，未开发出抗犬埃里希氏体的疫苗。犬埃里希氏体是世界上很多地方的犬和密切相关的犬科动物所特有的。北美犬的风险也正在增加，使用本发明可能会每年挽救数千只犬的生命。极其需要一种犬埃里希氏体疫苗，该疫苗能引发抗这种蜱传犬病的细胞-介导的免疫力。DNA疫苗通过将感兴趣的基因亚克隆至真核质粒载体，可以构建DNA疫苗。候选载体包括但不限于pcDNA3，pCI，VR1012，和VR1020。该构建体被用作疫苗。
新鉴定的基因中的每一种，ProA，ProB，ORF，细胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信号肽酶同系物可用于产生DNA疫苗(评论见Robinson，1997)。另外，这些蛋白质中的任何免疫活性部分都是潜在的候选疫苗。构建在表达载体中含有这些基因中的某一个的质粒。必须以正确的方向插入基因，从而使基因能在真核启动子的控制下被表达。可用的启动子包括但不限于巨细胞病毒(CMV)即早期启动子，人组织纤溶酶原激活物(t-PA)基因(鉴定于Degen等，1986)，和人延伸因子α(EF-1α)的启动子/增强子区域(鉴定于Uetsuki等，1989)。方向由限制性内切核酸酶消化和DNA测序鉴定。
通过对瞬时转染的COS细胞进行间接免疫荧光染色来证实这些基因产物的表达。将不含这些基因的相同质粒用作对照。将质粒DNA转化至大肠杆菌DH5α。通过氯化铯梯度纯化DNA，通过本领域已知的，并列入参考文献(Nyika等，1998)的标准技术测定浓度。
一旦纯化出载体，将含有DNA的载体悬浮于磷酸盐缓冲盐水溶液，直接注射至犬。可用针头经肌肉或静脉内进行接种。或者，可通过本领域已知的，并列入参考文献(Fynan等，1993)的技术，使用基因枪将包被有DNA的金珠转运至细胞。此类疫苗的基本原理是经接种的宿主在其细胞中表达质粒DNA，并产生能引起免疫应答的蛋白质。通过此技术，可使用新鉴定的基因中的每一种来产生疫苗。
CpG分子可用作疫苗中的佐剂。该技术是本领域已知的，并列入本文作为参考(Klinman等，1997)。佐剂是辅助抗原或增加针对抗原的免疫应答的物质。基元由未甲基化的CpG二核苷酸组成，所述二核苷酸的侧翼有2个5′嘌呤和2个3′嘧啶。已证实含有CpG基元的寡核苷酸可激活免疫系统，从而加强抗原-特异性免疫应答。在本发明中，通过混合CpG寡核苷酸与DNA疫苗，或使CpG基元与质粒DNA物理连接即可利用此效果。重组疫苗为了开发重组疫苗，将每种基因分别亚克隆至过量表达载体上，然后进行纯化以用于疫苗开发。在具有强启动子，如tac，T5或T7启动子的质粒中表达ProA，ProB，ORF，细胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信号肽酶同系物。或者，将这些蛋白质的免疫活性片段用于开发疫苗。按上述将这些基因中的每一种亚克隆至质粒，并转化至大肠杆菌菌株。
使用具有强启动子的载体过量表达重组蛋白质。用于此技术的载体包括pREST(Invitrogen Inc.，CA)，pKK233-3(Pharmacia，CA)和pET系统(Promega，WI)，但也可使用任何具有强启动子的载体。过量表达之后，纯化蛋白质并与佐剂混合。可用的佐剂包括但不限于氢氧化铝，QuilA或Montamide。通过本领域已知的，并列入参考文献(Chang等，1993c；Chang等，1995)的技术将纯化的蛋白质用作免疫原以免疫犬。简单地说，在大肠杆菌中表达各种蛋白质，并从中纯化蛋白质。然后，用纯化的重组疫苗和佐剂肌内或皮下注射犬。注射引发了免疫应答。T细胞表位疫苗由CD8+T淋巴细胞(CTL)介导的直接细胞毒性是抗细胞内病原体防御的主要机理。这些效应淋巴细胞通过识别与细胞表面上的MHC I类分子相连的短肽来消除感染细胞。外源抗原进入内体途径，并被呈递至与II类分子相关的CD4+T细胞，而内源合成的抗原被呈递至与MHC I类分子相关的CD8+T细胞。犬埃里希氏体是定居于单核细胞和巨噬细胞的胞内病原体。本发明开发出产生犬埃里希氏体-特异性CTL反应的新方法，所述CTL反应可从感染动物的单核细胞或巨噬细胞中消除生物体。
增加蛋白质疫苗的保护性反应的策略是用蛋白质的选择性表位进行免疫。其基本原理是表位疫苗含有最相关的免疫原性肽组分，而不含不相关的部分。因此，需寻找新鉴定的蛋白质中抗原性最高的部分。
为了从新发现的蛋白质中鉴定出T-细胞表位，起初通过进行电子检索来寻找与已知的T-细胞表位同源的序列。另外，进行充分的T-细胞表位作图。检测每一种蛋白质，ProA，ProB，ORF，细胞色素氧化酶同系物和部分脂蛋白信号肽酶同系物的免疫原性肽片段。通过本领域已知的技术对T细胞表位进行作图的方法列入本文作为参考(Launois等，1994；Lee和Horwitz，1999)。简单地说，在所研究蛋白质的整个长度上合成短的重叠肽序列(9-20个氨基酸)。使用已用感兴趣的蛋白质免疫过的健康犬来检测这些短的肽片段。检测这些犬的外周血单核细胞的T细胞刺激和IFN-γ诱导特性。那些能引发最强反应的片段是最佳的T-细胞表位候选疫苗。
一旦鉴定出可制备最佳表位的片段，构建支气管败血性博德特氏杆菌的重组腺苷酸环化酶，该酶携有犬埃里希氏体CD8+T细胞表位。支气管败血性博德特氏杆菌的腺苷酸环化酶毒素(CyaA)导致犬病并引发免疫应答。另外，CyaA较适合胞质内靶向。其对应于1706个残基长的蛋白质N-末端400个氨基酸残基的催化结构域(AC)可被传递至很多真核细胞，包括免疫系统的细胞。毒素内化不依赖于受体-介导的胞吞，这表明催化结构域可直接通过胞质膜传递至靶细胞的胞质溶胶。铜绿假单胞菌外毒素A(PE)是另一种毒素，它可通过本领域已知的，列入参考文献(Donnelly等，1993)的技术用于此方法，将肽或蛋白质传递至细胞。
已将外源肽(16个残基)插入CyaA AC结构域的多个位点，而不会改变其稳定性或催化和钙调蛋白-结合特性。因此，蛋白质工程可以设计和传递特异性刺激CTL的抗原。由于犬埃里希氏体在单核细胞内持续存在，因此，对特异性CD8+T细胞的诱导在犬埃里希病控制方面起着重要作用。
已克隆出支气管败血性博德特氏杆菌的腺苷酸环化酶(AC)毒素(cya)基因。根据支气管败血性博德特氏杆菌的密码子使用情况，设计合成的双链寡核苷酸，所述寡核苷酸编码ProA，ProB，ORF细胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信号肽酶同系物的9至20个氨基酸长的I类T细胞表位。将互补寡核苷酸插入克隆的cya AC-编码序列的高变区。在其它系统中，该技术是本领域已知的，并列入参考文献(Sebo等，1995；Guermonprez等，1999)。
对携有嵌合cya基因的重组质粒进行测序以测定插入表位的拷贝数和方向。从测序的质粒中选择在正确的方向上具有指定为T-细胞表位(CD8+)的完整插入物拷贝的质粒。新的嵌合蛋白质进入真核细胞的能力是确保表位细胞内靶向所必需的(Fayolle等，1996)。
可以两种方法中的一种产生疫苗。重组嵌合蛋白质可以被纯化并用于接种犬。或者，通过等位基因交换产生减毒的支气管败血性博德特氏杆菌菌株，通过框内插入腺苷酸环化酶，该菌株携有T-细胞表位或犬埃里希氏体基因。等位基因-交换是本领域已知的技术，并列入参考文献(Cotter和Miller，1994)。
最终，测定用腺苷酸环化酶-ProA，ProB，ORF，细胞色素氧化酶同系物或脂蛋白信号肽酶同系物嵌合蛋白质免疫的犬中抗犬埃里希氏体感染的保护作用。用PBS将野生型和重组AC和CyA稀释至工作浓度，将嵌合蛋白质肌内或皮下注射至犬中。或者，将T-细胞表位框内插入减毒支气管败血性博德特氏杆菌菌株的腺苷酸环化酶基因，给犬施用活细菌。
重组抗原是抗多种病原体的人和动物免疫的理想候选抗原。然而，严重的缺点是相对于天然抗原而言，重组抗原的免疫原性差。因此，开发新重组疫苗的主要挑战是拥有能增加抗原免疫原性的新佐剂系统。细胞因子是强有力的免疫调节分子。在本发明中可用作佐剂的细胞因子包括但不限于IL-12(白细胞介素-12)，GM-CSF(粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子)，IL-1β(白细胞介素-1β)和γ-IFN(γ干扰素)。
这些细胞因子对免疫的宿主具有消极的副作用，包括致热原的和/或促炎症的症状。因此，为了避免整个细胞因子蛋白质的副作用，另一种方法是使用具有所需免疫刺激特性的合成肽片段。IL-1β的九肽序列VQGEESNDK被赋予强有力的免疫-增强特性，在这里讨论它是为了阐明细胞因子增加免疫原性的用途。
将该九肽插入ProA，ProB，ORF，细胞色素氧化酶同系物，或部分脂蛋白信号肽酶同系物蛋白质，将其免疫原性与天然蛋白质的相比较。据报道，将该序列插入免疫原性差的重组抗原中可增加免疫后出现强保护性免疫应答的机会。该肽可增强抗T-依赖型和T-非依赖型抗原的体内免疫应答。犬IL-1β序列可模拟完整IL-1β分子的很多免疫调节活性，而明显缺乏该分子的很多不合乎需要的促炎症特性。使用该策略可增强ProA，ProB，ORF，细胞色素氧化酶，部分脂蛋白信号肽酶同系物和其它犬埃里希氏体抗原的免疫原性。
通过插入包括犬埃里希氏体的ProA，ProB，ORF，细胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信号肽酶蛋白质的片段，由pBR322质粒衍生得到质粒pYFC199。该质粒含有唯一的HindIII位点，其中可在框内插入编码外源序列的插入物。退火编码犬IL-1β163-171肽的两个互补寡核苷酸AGGCTTGTTCAGGGTGAAGAAGAATCCAACGACAAAAGCTT和AAGCTTTTGTCGTTGGATTCTTCACCCTGAAC TTGCCA，用HindIII切割，并插入pYFC199 HindIII位点。测序携有嵌合IL-1β基因的重组质粒以测定插入表位的方向。
在犬中检测重组蛋白质作为疫苗的效力。将纯化的蛋白质腹膜内注射至犬。将无特定病原体(SPF)的犬分成5组给一组施用重组的支气管败血性博德特氏杆菌腺苷酸环化酶，其携有衍生自ProA，ProB，ORF，细胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信号肽酶同系物的犬埃里希氏体CD8+T细胞表位，给一组施用重组的支气管败血性博德特氏杆菌腺苷酸环化酶作为对照，给一组施用ProA，ProB，ORF，细胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信号肽酶同系物蛋白质+犬IL-1β163-171插入物，给一组施用衍生自ProA，ProB，ORF，细胞色素氧化酶同系物或部分脂蛋白信号肽酶同系物的T细胞表位，给最后一组施用PBS作为阴性对照。
给所有动物免疫4次(每次30-40μg)。最后一次免疫后10天，用107个犬埃里希氏体攻击犬。在攻击后的第5天，将每只犬的约1ml血液采集至EDTA管中。通过培养和PCR来检测与对照组相比，免疫组是否消除了生物体。使用衍生自克隆基因的两个引物扩增这些犬的组织或血液样品中的基因产物。也可以设计内部引物以用作寡核苷酸探针，与PCR基因产物杂交。
本发明提供了迫切需要的抗犬埃里希氏体细菌的疫苗。该疫苗可用于保护全世界的犬免患犬单核细胞埃里希病。
因此，应理解本文所述的本发明的实施方案只是阐明了本发明原理的应用。本文中提到的阐述性实施方案的细节并不想限制权利要求书的范围，其自身列举了被认为是本发明所必需的那些特征。
序列表<110>常永福<120>用于疫苗开发的犬埃里希氏体基因<130>crf2322<150>U.S.09/358,322<151>1999-07-21<160>11<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>5300<212>DNA<213>犬埃里希氏体<400>1gatcaaataa aatgaaacca agaataagaa acactattta tggattaata gcaataatac 60tatctatgat atgtttagtg tacgcttctg taccactata tagtatattt tgtaaagtaa 120caggttatgg aggtacagta agaacaagta atatatcaaa ttctaaaata ggtaacacta 180ttattaaagt cagatttaat gcagatatac acaaacaact gccatggaaa ttctatccag 240aagtatctca tgtatttgta aaaccaggag aacaaaaatt gattttctac cgcgcagaaa 300atctacttga tgaggacact tcaggaatgg ctgtatataa tgttacacca cataaagtag 360gaaaatattt taataaggta gcttgttttt gtttcaccaa acaaacatta taccctcatc 420aaaaaactat aatgccagta tcatttttta tagatccagc catagaaaca gatcctgaaa 480ctgctgacgt aaaactcatc actctttcat atgtattctt taagtacaaa gaataaactt 540catataccgt acattataaa ctgattaaaa aaaataacta ttaatattga gcaaaataat 600ttatctattc aacagattct tttcaattag agagtattca aaaacactac aactactgct 660tgcaactttc tatcactgat atataaaagt gaaataaatt taaaaaactt tagttttaat 720agaagaattt tattaaaagc 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1.含有选自下列的所述DNA的重组DNAa)编码具有如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；b)编码具有如SEQ.ID.NO.5所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；c)编码具有如SEQ.ID.NO.7所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；d)编码具有如SEQ.ID.NO.9所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；e)编码具有如SEQ.ID.NO.11所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；和f)编码能引发抗犬埃里希氏体免疫应答的蛋白质的上述DNA的任何部分。
2.权利要求1的重组DNA，其中所述DNA编码至少一种免疫原性表位。
3.含有选自下列的所述蛋白质的重组蛋白质a)具有如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的蛋白质；b)具有如SEQ.ID.NO.5所示氨基酸序列的蛋白质；c)具有如SEQ.ID.NO.7所示氨基酸序列的蛋白质；d)具有如SEQ.ID.NO.9所示氨基酸序列的蛋白质；e)具有如SEQ.ID.NO.11所示氨基酸序列的蛋白质；和f)能引发抗犬埃里希氏体免疫应答的上述蛋白质的任何部分。
4.权利要求3的重组蛋白质，其中所述蛋白质包括至少一种免疫原性表位。
5.疫苗，其中所述疫苗保护犬抗犬埃里希氏体感染。
6.权利要求5的疫苗，其含有a)载体，该载体能表达插入所述载体中的重组DNA，使得当在适当宿主中提供所述载体时可以表达重组蛋白质；和b)插入所述载体中的重组DNA，其中所述DNA选自i.编码具有如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；ii.编码具有如SEQ.ID.NO.5所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；iii.编码具有如SEQ.ID.NO.7所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；iv.编码具有如SEQ.ID.NO.9所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；v.编码具有如SEQ.ID.NO.11所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；和vi.编码能引发抗犬埃里希氏体免疫应答的蛋白质的上述DNA的任何部分。
7.权利要求6的疫苗，其中所述DNA进一步含有编码CpG基元的DNA。
8.权利要求6的疫苗，其中所述DNA进一步含有选自下列的启动子a)巨细胞病毒(CMV)即早期启动子；b)人组织纤溶酶原激活物基因(t-PA)；和c)人延伸因子α(EF-1α)的启动子/增强子区域。
9.权利要求6的疫苗，其中所述载体选自a)pcDNA3；b)pC1；c)VR1012；和d)VR1020。
10.权利要求6的疫苗，其中通过选自下列的方法将所述疫苗施用于所述宿主a)肌内注射；b)静脉内注射；和c)基因枪注射。
11.权利要求10的疫苗，其中所述宿主是犬。
12.权利要求5的疫苗，其含有a)选自下列的重组蛋白质i.具有如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的蛋白质；ii.具有如SEQ.ID.NO.5所示氨基酸序列的蛋白质；iii.具有如SEQ.ID.NO.7所示氨基酸序列的蛋白质；iv.具有如SEQ.ID.NO.9所示氨基酸序列的蛋白质；v.具有如SEQ.ID.NO.11所示氨基酸序列的蛋白质；和vi.能引发抗犬埃里希氏体免疫应答的上述蛋白质的任何部分。
13.权利要求12的疫苗，其中所述疫苗进一步含有选自下列的佐剂a)氢氧化铝；b)QuilA；和c)Montamide。
14.权利要求12的疫苗，其进一步含有与所述重组蛋白质可操作相连的细胞因子。
15.权利要求14的疫苗，其中所述细胞因子选自a)白细胞介素-1β(IL-1β)；b)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；c)γ干扰素(γ-IFN)；d)IL-1β蛋白的氨基酸VQGEESNDK；和e)能引发抗犬埃里希氏体的改善免疫原性反应的上述任何细胞因子的任何部分。
16.权利要求12的疫苗，其中通过选自下列的方法将所述疫苗施用于宿主a)肌内注射；和b)皮下注射。
17.权利要求16的疫苗，其中所述宿主是犬。
18.权利要求5的疫苗，其含有包括T细胞表位的重组蛋白质，其中所述T细胞表位含有选自下列的蛋白质的氨基酸肽片段a)具有如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的蛋白质；b)具有如SEQ.ID.NO.5所示氨基酸序列的蛋白质；c)具有如SEQ.ID.NO.7所示氨基酸序列的蛋白质；d)具有如SEQ.ID.NO.9所示氨基酸序列的蛋白质；e)具有如SEQ.ID.NO.11所示氨基酸序列的蛋白质；和f)能引发抗犬埃里希氏体免疫应答的上述蛋白质的任何部分。
19.权利要求18的疫苗，其中所述氨基酸肽片段含有9至20个氨基酸。
20.权利要求18的疫苗，其进一步含有编码蛋白质的重组DNA，所述蛋白质能被内化至真核细胞，包括免疫系统的细胞。
21.权利要求20的疫苗，其中所述能内化至真核细胞的蛋白质含有选自下列的毒素a)支气管败血性博德特氏杆菌的重组腺苷酸环化酶；和b)铜绿假单胞菌的重组外毒素A(PE)。
22.权利要求18的疫苗，其中通过选自下列的方法将所述疫苗施用于宿主a)肌内注射；和b)皮下注射。
23.权利要求22的疫苗，其中所述宿主是犬。
24.鉴定抗犬埃里希氏体的T细胞表位的方法，其包括a)在蛋白质的整个长度上合成重叠的肽片段，其中所述蛋白质选自i.具有如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的蛋白质；ii.具有如SEQ.ID.NO.5所示氨基酸序列的蛋白质；iii.具有如SEQ.ID.NO.7所示氨基酸序列的蛋白质；iv.具有如SEQ.ID.NO.9所示氨基酸序列的蛋白质；v.具有如SEQ.ID.NO.11所示氨基酸序列的蛋白质；和vi.能引发抗犬埃里希氏体免疫应答的上述蛋白质的任何部分；b)检测所述肽片段以测定所述肽片段是否在宿主动物中引发免疫应答；和c)如果所述片段引发了免疫应答，则将所述肽片段鉴定为所述的犬埃里希氏体T细胞表位。
25.权利要求24的方法，其中所述肽片段含有9至20个氨基酸。
26.产生抗犬埃里希氏体的疫苗的方法，其包括a)选择能表达插入所述载体的重组DNA的载体；和b)将重组DNA插入所述载体，使得当在适当宿主中提供所述载体时，可以表达重组蛋白质，其中所述DNA选自i.编码具有如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；ii.编码具有如SEQ.ID.NO.5所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；iii.编码具有如SEQ.ID.NO.7所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；iv.编码具有如SEQ.ID.NO.9所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；v.编码具有如SEQ.ID.NO.11所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；和vi.编码能引发抗犬埃里希氏体免疫应答的蛋白质的上述DNA的任何部分。
27.权利要求26的方法，其中所述DNA进一步含有编码CpG基元的DNA。
28.权利要求26的方法，其中所述DNA进一步含有选自下列的启动子a)巨细胞病毒(CMV)即早期启动子；b)人组织纤溶酶原激活物基因(t-PA)；和c)人延伸因子α(EF-1α)的启动子/增强子区域。
29.权利要求26的方法，其中所述载体选自a)pcDNA3；b)pC1；c)VR1012；和d)VR1020。
30.权利要求26的方法，其中通过选自下列的方法将所述疫苗施用于所述宿主a)肌内注射；b)静脉内注射；和c)基因枪注射。
31.权利要求30的方法，其中所述宿主是犬。
32.产生抗犬埃里希氏体的疫苗的方法，其包括a)选择能表达插入所述载体的重组蛋白质的载体；b)将重组DNA插入所述载体，使得当将所述载体转化至细菌菌株时，可以表达所述重组蛋白质，其中所述DNA选自i.编码具有如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；ii.编码具有如SEQ.ID.NO.5所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；iii.编码具有如SEQ.ID.NO.7所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；iv.编码具有如SEQ.ID.NO.9所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；v.编码具有如SEQ.ID.NO.11所示氨基酸序列的蛋白质的重组DNA；和vi.编码能引发抗犬埃里希氏体免疫应答的蛋白质的上述DNA的任何部分；c)从所述细菌菌株中收集所述重组蛋白质。
33.权利要求32的方法，其中所述疫苗进一步含有选自下列的佐剂a)氢氧化铝；b)QuilA；和c)Montamide。
34.权利要求32的方法，其中所述疫苗进一步含有选自下列的启动子a)tac；b)T5；和c)T7。
35.权利要求32的方法，其中所述细菌菌株是大肠杆菌。
36.权利要求32的方法，其中所述载体选自a)pREST；b)pET；和c)pKK233-3。
37.权利要求32的方法，其中所述疫苗进一步含有与所述疫苗可操作相连的细胞因子。
38.权利要求37的方法，其中所述细胞因子选自a)白细胞介素-1β(IL-1β)；b)粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；c)γ干扰素(γ-IFN)；d)IL-Iβ蛋白的氨基酸VQGEESNDK；和e)能引发抗犬埃里希氏体的改善免疫原性反应的上述任何细胞因子的任何部分。
39.权利要求32的方法，其中通过选自下列的方法将所述疫苗注射至所述宿主a)肌内注射；和b)皮下注射。
40.权利要求39的方法，其中所述宿主是犬。
41.产生T细胞表位疫苗的方法，其包括a)选择包括T细胞表位的重组蛋白质，其中所述T细胞表位含有选自下列的蛋白质的氨基酸肽片段i.具有如SEQ.ID.NO.3所示氨基酸序列的蛋白质；ii.具有如SEQ.ID.NO.5所示氨基酸序列的蛋白质；iii.具有如SEQ.ID.NO.7所示氨基酸序列的蛋白质；iv.具有如SEQ.ID.NO.9所示氨基酸序列的蛋白质；v.具有如SEQ.ID.NO.11所示氨基酸序列的蛋白质；和vi.能引发抗犬埃里希氏体免疫应答的上述蛋白质的任何部分；b)从所述蛋白质中鉴定所述T细胞表位；c)将所述T细胞表位掺入能将所述表位表达为蛋白质的构建体；和d)收获所述蛋白质。
42.权利要求41的方法，其中所述氨基酸肽片段含有9至20个氨基酸。
43.权利要求41的方法，其中能表达所述表位的所述构建体进一步含有编码蛋白质的重组DNA，所述蛋白质能被内化至真核细胞，包括免疫系统的细胞。
44.权利要求43的方法，其中所述能内化至真核细胞的蛋白质含有选自下列的毒素a)支气管败血性博德特氏杆菌的重组腺苷酸环化酶；和b)铜绿假单胞菌的重组外毒素A(PE)。
45.权利要求41的方法，其中通过选自下列的方法将所述疫苗注射至宿主a)肌内注射；和b)皮下注射。
46.权利要求45的方法，其中所述宿主是犬。
全文摘要
本发明提供了得自犬埃里希氏体基因组的5300个核苷酸的序列。在此克隆片段中,共编码了4种蛋白质,ProA,ProB,ORF,和细胞色素氧化酶同系物,并且在羧基末端编码部分脂蛋白信号肽酶同系物。这些蛋白质的抗原特性使它们可用于产生疫苗。本发明的实施方案包括产生DNA疫苗,重组疫苗和T细胞表位疫苗。
文档编号A61P31/04GK1367832SQ00810608
公开日2002年9月4日 申请日期2000年7月20日 优先权日1999年7月21日
发明者常永福 申请人:科内尔研究基金会