专利名称：一种riz基因药物组合物及其用于癌症治疗的用途的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及癌症的治疗方法，特别是一种采用肿瘤抑制基因-RIZ基因的药物组合物，此基因具有抑制肿瘤细胞生长的功能，可用于癌症基因治疗。
据美国肿瘤协会统计，美国在1996年新诊断的癌症病人有一百五十万，同年因癌症导致的死亡人数为五十万。每年美国用于癌症治疗的费用超过百亿美元。癌症严重危害人类健康。近十年开发的化疗药物对许多肿瘤都有较好治疗效果，但副作用很强。随着这些药物的不断使用，癌症细胞因其遗传物质的不稳定性，逐渐形成抗药性。因而寻找新的革命性的治疗癌症的手段成为现代医学的当务之急。
进入二十一世纪后，随着人类基因组工程的即将完成，人类将掌握生命结构和功能的大量信息，对这些信息的处理(后基因组工程)和应用开发将使科学家更深入认识疾病起因和进一步开发基因治疗方法。基因治疗是近年兴起的生物工程新技术，可用于治疗各种遗传病、癌症和病毒感染。基因治疗是利用适当载体将正常基因DNA或能抑制疾病的核糖核酸(DNA或RNA)转入病人细胞，以达到治疗疾病的效果。
肿瘤细胞是由正常细胞经过一系列的突变而形成的，在这过程中很重要的一步是这些细胞丧失了原来正常细胞中对细胞周期进程有抑制作用的基因产物，即肿瘤抑制基因蛋白。当这些蛋白质由于基因突变或基因重组而丢失后，正常细胞便开始无限生长和繁殖，在动物和人体内形成肿瘤。在已知的肿瘤抑制基因当中，最常见的突变是在P53和眼底瘤抑制基因RB基因上，大约百分之五十以上的肿瘤都有P53基因缺陷，因而利用正常的P53基因来做肿瘤基因治疗成为当今医药领域的一大热点。在美国和世界各地进行的十几类临床试验中，P53基因治疗对多种P53基因缺陷形肿瘤有极明显的治疗效果，很可能成为第一个被美国FDA批准的基因治疗药品。与此同时，科学家们又在不断发现新的肿瘤抑制基因。
本发明的目的是提供一种采用新的肿瘤抑制基因-RIZ基因的药物组合物。
本发明的另一个目的是提供一种上述RIZ基因的药物组合物的用于治疗结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌及内皮细胞癌等癌症的用途。
本发明的RIZ基因的药物组合物中含有RIZ基因和载有RIZ基因的载体；其中，所述载体可以是裸体质粒、腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)、逆转录病毒(retrovirus和lentivirus)等基因治疗载体。
所述载体还可包括可通过基因重组、化学修饰及其它方法达到特异性基因转导功能的物质。
所述载体内可有一个拷贝正常的RIZ基因或突变体RIZ基因，具有抑制肿瘤细胞生长的作用。
本发明的RIZ基因的药物组合物可用于治疗结肠癌、乳腺癌、前列腺癌及其它癌症。
本发明的RIZ基因的药物组合物RIZ基因的药物组合物还可用于治疗MSI阳性的结肠癌、胃癌、内皮细胞癌及其它癌症。
本发明的RIZ基因的药物组合物临床应用时可通过直接注射、导管引导及其它方法转导到肿瘤细胞中。
所述的RIZ基因是在酵母双体杂交中发现的与眼底瘤抑制基因(RB)有相互作用的锌结合蛋白(Zinc Finger)，属于PR(PRDI-BFI-RIZ-1)或SET(Suvar3-9，Enhancer-of zeste，Trithorax)相关蛋白，在染色体介导的基因激活和抑制过程中起作用。RIZ基因有两个变体，RIZ1和RIZ2，两者区别在于RIZ1在N-端有PR结构，RIZ2没有。RIZ1(PR+)被认为是位于一号染色体1p36位置的最佳肿瘤抑制基因候选者，这一位点在超过十二种人类肿瘤中发现有缺损。RIZ1基因在人类多种肿瘤细胞中，包括乳腺癌、肝癌、结肠癌和神经陆细胞中没有表达，其突变的比率和P53基因在人体肿瘤中的突变比率相似，因而它是继发现P53以来肿瘤抑制基因领域中最重要的成果。
经研究发现，RIZ基因在卫星染色体不稳定性阳性(MSI+)肿瘤中亦起重要作用，因为在MSI+的结肠癌、食道癌、内皮癌和胰腺癌中经常能找到RIZ突变。MSI+肿瘤是由于硷基配对错误修复系统失灵造成的，家族性的非息肉性结肠癌和超过15％的自发性结肠癌、胃癌、内皮癌和胰腺癌是MSI阳性。MSI+致瘤的原理是卫星染色体中的基因因密码子移位造成此基因失活，引发肿瘤。在MSI(+)肿瘤中发现RIZ基因中有两处突变位点，这些突变造成RIZ蛋白翻译提前终止，不再带有PR结构。这进一步证明RIZ1中的PR结构对抑制肿瘤细胞生长有重要作用。
当我们将RIZ基因利用腺病毒载体转入到各种肿瘤细胞中时，肿瘤细胞在体外的生长受到抑制，而且这些肿瘤细胞不再能在动物体内形成肿瘤。特别是，当我们利用基因治疗的方法将RIZ基因导入到已经在小鼠生长的肿瘤中时，RIZ基因几乎百分之百抑制肿瘤的生长，并且在几只小鼠中，肿瘤发生萎缩；而在P53基因治疗没有效果的MSI+肿瘤中，RIZ基因也起作用，这些试验充分证明了RIZ基因作为肿瘤抑制基因，具有被开发成为一个广泛的肿瘤治疗药物的潜力。
下面结合具体的临床实验进一步描述本发明。
实验材料和方法
①细胞株和体外腺病毒转导具有RIZ突变体的人类结肠细胞株HCT116由ATCC获得，培养基是DMEM加10％胎牛血清。这些细胞培养条件是37℃，5％CO2恒温细胞培养箱。没有任何基因的Adnull由国立肿瘤研究所的Prem Seth赠送。Adnull和带有RIZ基因(Adriz)和P53基因(Adp53)的腺病毒载体在293细胞上增殖。
②体内腺病毒转导无胸腺雌性nu/nu裸鼠由Jackson实验室购置(BarHarbor，Maine)。透过皮下注射将在100毫升PBS中的两百万肿瘤细胞接种到一个小鼠身上。经过六天培养，平均肿瘤直径达0.5厘米。治疗前，先根据肿瘤大小将动物随机分组，每组5-11只小鼠。在这些带有肿瘤的小鼠中，每隔一天，分别注射100毫升PBS、Adnull、Adp53或AdRIZ1病毒提取液(含8×1010病毒颗粒)，一共注射四次。每周测量肿瘤大小2-3次。肿瘤体积表达方式为a×b2×0.5，其中a是肿瘤长度，b是宽度(以毫米计算)。不同治疗组在不同时间治疗大小通过Student T实验方法来比较。
③组织学和免疫组织化学组织样品先在10％福尔马林溶液中固定，然后在石蜡中包埋，用1∶400稀释的1637抗血清进行RIZ的免疫染色，用1∶200稀释的兔子AB545抗血清进行P53的免疫染色。二级抗体是过氧化酶标记的羊抗兔IgG。Apoptag原位细胞凋亡检测试剂由Intergen购得。样品根据试剂盒中方法进行检测。简单步骤如下；去石蜡，将组织重新充水，用蛋白酶处理，与TdT培养，用Avidin-过氧化酶，DAB显色。组织切片用Hematoxylin反相染色。
实验结果和讨论为确定RIZ1基因治疗在体内MSI阳性肿瘤中的治疗效果，我们测试了带有重组RIZ1基因的腺病毒载体对已经存在的肿瘤的抑制作用。作为对照，我们也研究了在MSI阳性肿瘤中没有突变的带有重组P53基因腺病毒载体对这些肿瘤的抑制作用。在此实验中，我们选择了HCT116结肠肿瘤细胞株，因为此细胞带有同源RIZ1基因突变和野生型P53基因。同时这些细胞在体外可被RIZ1基因诱导细胞周期阻隔和细胞凋亡。我们将HCT116肿瘤细胞通过皮下注射到裸鼠体内。带有HCT116肿瘤的裸鼠分别接受PBS、Adnull、AdRIZ1或Adp53肿瘤内和肿瘤外周注射。接受PBS、Adnull或Adp53注射的裸鼠身上的肿瘤持续增长，然而接受AdRIZ1注射的裸鼠身上的肿瘤生长明显减缓，见
图1。
图1.
在裸鼠异体肿瘤模型中利用AdRIZ1腺病毒载体对卫星染色体不稳定性阳性的结肠瘤进行基因治疗。将有RIZ1基因突变的人类结肠瘤HCT116细胞注射到裸鼠的侧腹部，治疗前，带有肿瘤的裸鼠根据肿瘤大小进行随机分组。每隔一天，在肿瘤内或肿瘤外周分别注射PBS，对照Adnull、Adp53或AdRIZ1。共注射四次，每次剂量为每个动物8×1010病毒颗粒。箭头指示注射时间，每周两次测量肿瘤体积，连续测量四周。
我们随后研究了RIZ1和P53在体内表达对肿瘤细胞凋亡的影响。我们将HCT116肿瘤细胞注射到裸鼠体内，让异体肿瘤生长一个月。然后在已经生长的肿瘤中注射病毒悬浮液。注射两天后，将肿瘤取出，在石蜡包埋的组织切片中进行RIZ1、P53和DNA片段的免疫组织化学染色。如图2所示。
图2在腺病毒转导的肿瘤细胞中进行RIZ1、p53和细胞凋亡的免疫组织化学染色分析。在体内已形成肿瘤的HCT116细胞在注射AdRIZ1、Adp53、Adnull或对照缓冲液两天后进行RIZ1、p53或Apoptag细胞凋亡原位检测(TUNEL分析)。
在AdRIZ1或AdP53注射部位周围的大多数肿瘤细胞分别有很强的RIZ1或P53染色。而且注射了AdRIZ1，而不是PBS、Adnull或AdP53的肿瘤细胞有强烈的Apoptag染色，表明在表达RIZ1的细胞中有细胞凋亡。我们的动物实验证明用带有RIZ1的腺病毒载体来处理MSI阳性的结肠细胞异体肿瘤具有抑制肿瘤生长的治疗效果。RIZ1病毒转导的HCT116异体肿瘤由于RIZ1表达引发细胞凋亡，这与以前在体外观测到的结果相一致。由于P53基因在MSI阳性肿瘤中没有效果，AdP53在此实验中没有抑制肿瘤生长和诱导细胞凋亡的作用，跟预测的结果一样。虽然P53基因治疗在有P53突变的肿瘤基因治疗中表现出极大的潜力，但对大多数带有野生型P53基因的MSI阳性的结肠癌、胃癌和内皮细胞癌不起作用。据我们所知，我们的实验是第一次成功用基因治疗的方法抑制MSI阳性的异体肿瘤。这为基因治疗MSI阳性肿瘤提供了一个成功典例。
在人类肿瘤中存在两种RIZ1失活现象RIZ1基因非表达和密码子错位突变。虽然在MSI阴性肿瘤中只发现RIZ1基因非表达，在MSI阳性肿瘤中两种RIZ1失活现象都存在。在至少30-50％的MSI阳性的结肠癌、胃癌和内皮细胞癌中有RIZ1失活现象。而且，RIZ1是转录因子，可能与研究最多的RB和P53基因具有类似的工作原理。因此在RB和P53基因治疗中得到的经验可以直接运用到RIZ1基因治疗中来。这些发现和我们现在提供的动物实验结果，表明RIZ1基因治疗可应用到MSI阳性肿瘤中来。
权利要求
1.一种RIZ基因的药物组合物，其特征是含有RIZ基因和基因载体。
2.如权利要求1所述的RIZ基因的药物组合物，其特征是所述载体是裸体质粒、腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno-Associated Virus，AAV)、逆转录病毒(retrovirus和lentivirus)基因治疗载体。
3.如权利要求1所述的RIZ基因的药物组合物，其特征是所述载体还包括通过基因重组、化学修饰及其它方法达到特异性基因转导功能的物质。
4.如权利要求1所述的RIZ基因的药物组合物，其特征是所述载体内有一个拷贝正常的RIZ基因或突变体RIZ基因，具有抑制肿瘤细胞生长的作用。
5.一种如权利要求1-4所述的RIZ基因的药物组合物的用途，其特征是用于治疗结肠癌、乳腺癌、前列腺癌。
6.一种如权利要求1-4所述的RIZ基因的药物组合物的用途，其特征是用于治疗MSI阳性的结肠癌、胃癌、内皮细胞癌。
全文摘要
本发明为一种RIZ基因的药物组合物及其用于治疗癌症的用途。本组合物中含有RIZ基因和裸体质粒、腺病毒(Adenovirus)、腺相关病毒(Adeno－Associated Virus,AAV)、逆转录病毒(retrovirus和lentivirus)等基因治疗载体。本发明的RIZ基因的药物组合物可用于治疗结肠癌、乳腺癌、前列腺癌及其MSI阳性的结肠癌、胃癌、内皮细胞癌及其它癌症;效果显著,无毒副作用。
文档编号A61P35/00GK1354017SQ0013247
公开日2002年6月19日 申请日期2000年11月21日 优先权日2000年11月21日
发明者黄石 申请人:黄石