专利名称：一种抗肿瘤免疫疫苗的制取方法
技术领域：
本发明属于医学领域的一种免疫疫苗的制取方法，特别涉及到通过融合方法制取抗肿瘤免疫疫苗的方法。
各种恶性肿瘤严重危害着人类的健康。目前治疗肿瘤的方法主要依靠手术切除，再配以相应的化学药物治疗以及放射治疗，这些传统的治疗肿瘤的方法尽管取得了很大成绩，但不能起到免疫的作用，并且化学药物治疗或放射治疗疗效有限，还往往带来严重的副作用，使治疗后的病人身体素质严重下降，继而并发其它疾病，并易导致肿瘤的转移和复发。发明人对肿瘤的免疫治疗已研究多年，并在1997年美国自然医学杂志(NATURE MEDICINE.VOLUME3.NUMBER5.May1997第558-561页)和1998年美国PNAS杂志(Proc.Natl.Acad.Sci.USA VOL.95,May1998第6229-6283页)发表过相应的论文。这些研究成果表明融合树突状细胞与肿瘤细胞可形成一个新的、具有免疫功能的细胞，但仍在技术上需要一一融合，而且大多数人体的肿瘤细胞难以在体外传代培养，因而影响了其融合细胞的制作，限制了其广泛应用。因而，提出一种能起到免疫疗效的疫苗制取方法，是肿瘤医学界和生物医学界共同追求的目标。
本发明的目的在于解决现有已报导的融合技术中的不足，针对肿瘤细胞具有特异抗原，而树突状细胞是天然的、功能强大的抗原递呈细胞，通过融合方法，提出一种制取抗肿瘤免疫疫苗的方法。
本发明是通过以下方案实现的先对非树突状细胞之间进行融合，再把融合的非树突状细胞与树突状细胞融合，从而得到具有细胞表面多种类抗原的融合细胞疫苗。
由于采用本发明方法制取的免疫疫苗除了具有肿瘤特异性抗原以外，仍保留了树突状细胞作为抗原传递细胞所需的各种表面抗原，并且在制取过程中通过对来自不同病人的同种肿瘤细胞或不同种肿瘤细胞的融合，从而使疫苗具有如主要组织相容性复合体Ⅰ和Ⅱ、共同刺激抗原、细胞表面多种类肿瘤抗原，达到诱发机体抗肿瘤能力和应用免疫治疗技术调动机体识别肿瘤抗原的能力，所以本发明集中多种肿瘤的共同性，使得融合得到的疫苗表面具有多种、多样性抗原表达，而达到其通用性，解决了治疗多种肿瘤病人所需免疫疫苗的制取方法，为改变传统的肿瘤治疗方法提供了重要的物质基础。
以下是对本发明的详细描述从哺乳动物中取得树突状细胞和非树突状细胞，这些哺乳类动物可以是鼠、人类、牛。非树突状细胞是这些哺乳类动物的肿瘤细胞。非树突状细胞之间的融合是来自同类不同哺乳动物同种肿瘤细胞的融合，也可以是来自同类不同哺乳动物不同种肿瘤细胞的融合，例如不同病人的同种肿瘤细胞之间的融合或不同病人的不同种肿瘤细胞之间的融合，非树突状细胞(如肿瘤细胞)之间融合后，产生融合的肿瘤细胞，将这样的肿瘤细胞再与树突状细胞融合，从而得到抗肿瘤免疫疫苗。采用本发明的方法制得的疫苗，具有细胞表面多种类抗原的特性。上述非树突细胞之间的融合以及将融合后的非树突状细胞与树突状细胞的融合，均采用化学方法融合或物理学方法融合或生物学方法融合以及受体指引型细胞融合法。物理学方法融合可采用电融合。树突状细胞和肿瘤细胞可来自同体或异体，可来自人类个体细胞。融合细胞疫苗的细胞表面抗原是多种类肿瘤抗原。
树突状细胞与非树突状细胞的化学方法融合具体包括以下过程a、培养一定量的树突状细胞；b、取得一定量的非树突状细胞，这些非树突状细胞是已经经过融合的，其细胞表面具有多种类抗原；c、将上述树突状细胞与非树突状细胞按比例通过一种融合剂接触在一起；d、细胞的融合需要一个培养过程，将上述接触在一起的细胞培养在一种培养基中，选择性培养所需的融合细胞疫苗。
树突状细胞与非树突状细胞电融合包括以下过程将树突状细胞与非树突状细胞按比例混合于5％葡萄糖溶液，把装该混合液的槽置于电脉冲仪的正负极之间，通过通电，在高压电脉冲的作用下，使得上述二种细胞在一瞬间接触，结合成融合细胞疫苗。这里的非树突状细胞是已经经过融合的。
上述化学方法融合或电融合中，树突状细胞与非树突状细胞的比例可以是1∶1-25∶1。
非树突状细胞(如人体肿瘤细胞)之间的化学方法融合包括以下过程a、提取不同病人的同种肿瘤细胞或提取不同病人的不同种肿瘤细胞，这些细胞表面具有多种类肿瘤抗原。
b、通过一种融合剂将上述同种肿瘤细胞接触在一起或不同种肿瘤细胞接触在一起。
c、细胞的融合需要一个培养过程，将接触在一起的细胞培养在一种培养基中，选择培养融合细胞。
非树突状细胞(如人体肿瘤细胞)之间的电融合过程是将不同病人的同种肿瘤细胞或不同病人不同种肿瘤细胞置于5％葡萄糖溶液，把装该溶液的槽置于电脉冲仪的正负极之间，通过通电，在高压电脉冲的作用下，使得肿瘤细胞瞬间接触和结合。
实施例1用化学融合方法对不同病人的同种肿瘤细胞之间进行融合提取10例患乳腺癌病人的肿瘤细胞106-1010，通过聚乙二醇(PEG)融合剂将上述肿瘤细胞接触在一起1-5分钟，经过洗去PEG后，再置于RPMI-1640培养基中，培养7-10天，得乳腺癌融合细胞。这些融合细胞含不同个体抗原。
实施例2用化学融合方法对不同病人的不同种(同类)肿瘤细胞之间进行融合分别提取5例患乳腺癌病人的肿瘤细胞、5例患胃癌病人的肿瘤细胞，这些病人均属于患腺癌类，将上述的肿瘤细胞通过PEG融合剂接触在一起1-5分钟，洗去PEG后，再置于DMEM培养基中，培养7-10天，得腺癌类融合细胞。这些融合细胞含有不同种瘤的抗原。
实施例3用电融合方法对不同病人的不同种类肿瘤细胞之间进行融合分别提取5例患乳腺癌的病人的肿瘤细胞和5例患肉瘤病人的肿瘤细胞置于5％葡萄糖溶液，将装该溶液槽置于电脉冲仪的正负极之间。在电脉冲仪面板上设置了电压和电容。选择电容在2.5μFd以上档，双手指同时按压两个红色按键，直至听见持续的鸣叫声，方可松开手指(此过程最长可达15S)。至此，完成一次电脉冲。在高压电脉冲作用下，使上述肿瘤细胞瞬间接触，结合成融合细胞。这些融合细胞含有不同种类型肿瘤的抗原。
实施例4用化学融合方法对鼠的树突状细胞与肿瘤细胞的融合，来制取抗肿瘤免疫疫苗的方法树突状细胞来自于骨髓细胞的培养，具体地讲，骨髓细胞提取于长股骨，用氨盐解体了红细胞，另外，淋巴细胞、有核白细胞和Ia+阳性细胞用混合抗体而去除。这些抗体有①2.43，抗CD8抗体，②GK1.5，抗CD4抗体，③RA3-3A1/6.1，抗B220/CD45R抗体，④B21-2，抗Ia抗体，⑤RB6-8C5抗有核白细胞。存活的细胞被培养在6孔盘内，含有5％血清，50μM2-巯基乙醇，1mM N-2-羟乙基哌嗪-N-2乙磺酸(HEPES),2mM谷氨酸，10U/ml青霉素和10μg/ml链霉素培养基中，并含有500U/ml人工合成粒细胞-巨噬细胞(单核细胞)集落刺激因子(GM-CSF)和IL-4细胞因子。经过7天培养后，没有贴壁的和轻微贴壁的细胞被收集，然后重新培养在100mm细胞培养皿(106细胞/ml,8ml/皿)。没有贴壁的细胞培养30分钟后被洗掉，然后含GM-CSF和IL-4细胞因子的RPMI-1640培养基被加入贴壁细胞培养。18小时的再培养后，不贴壁的细胞为树突状细胞，可用于融合。将已经过融合的大肠腺癌细胞株(MC38腺癌细胞)与上述的树突状细胞按比率为1∶1-25∶1融合在50％聚乙二醇与磷酸盐缓冲盐水(PEG/PBS)(不含Ca2+、Mg2+,PH 7.4)的融合剂中，通过融合接触1-5分钟，细胞被培养在24孔盘内，培养在含有次黄嘌呤/氨基喋呤/胸腺嘧淀(HAT)选择培养基中10-14天。由于MC38肿瘤对HAT并不十分敏感，HAT只是用于减低MC38分裂，但不杀伤。MC38肿瘤细胞以贴壁生长，但是融合细胞不贴壁而已被收集，从而收集到肿瘤免疫疫苗。
实施例5用电融合方法融合人的树突状细胞与肿瘤细胞，制取抗肿瘤免疫疫苗的方法从正常人周围血中提取有核细胞，然后培养在含有10％胎牛血清的RPMI-1640培养基中，共30分钟，不贴壁细胞被轻轻地洗掉，然后贴壁细胞加入5％血清RPMI-1640培养基，并含有GM-CSF(1000U/ml)集落因子和IL-4(100U/ml)，培养5-6天后，大量的树突状细胞可用来融合。
同样，树突状细胞也可以在骨髓原始细胞中培养。具体说，这些前体细胞培养在一个RPMI-1640培养基中，含有5％血清，37℃,30分钟。然后，不贴壁的细胞被洗掉，新鲜的10％血清的RPMI-1640，含有GM-CSF(1000U/ml)和IL-4(100U/ml)，培养5-6天。结果培养出的树突状细胞可用于融合。
将上述培养出的树突状细胞与已经过融合的多发性骨髓瘤株肿瘤细胞按1∶1混合于5％的葡萄糖溶液，把这样的混合液置于电脉冲仪的正负极之间，重复实施例3的操作步骤，使得上述二种细胞在瞬间接触，结合成融合细胞疫苗。
实施例6、7改变树突状细胞与非树突状细胞的混合比例，分别为15∶1和25∶1，重复实施例5的步骤，同样制得抗肿瘤免疫疫苗。
本发明方法制取的融合细胞疫苗中至少有一个哺乳类树突状细胞，并具有(a)主要组织相容性复合体Ⅰ和Ⅱ，(b)共同刺激抗原，(c)细胞表面多种类肿瘤抗原。树突状细胞培养可来源于哺乳动物骨髓细胞或周围血、脐带血。非树突状细胞可采用非洲淋巴细胞瘤病毒转化细胞的培养(EBV转化)，以使之具有无限繁殖力。另外，可以将已知抗原基因转入非树突状细胞，增加其抗原性，并使得用已知抗体去追踪这个抗原。
权利要求
1.一种抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，由树突状细胞与非树突状细胞融合，其特征在于先对非树突状细胞之间进行融合，再与树突状细胞融合，从而得到具有细胞表面多种类抗原的融合细胞疫苗。
2.根据权利要求1所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于树突状细胞来自哺乳动物，非树突状细胞来自哺乳动物的肿瘤细胞。
3.根据权利要求2所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于哺乳动物是人类。
4.根据权利要求1所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于非树突状细胞之间进行的融合是来自同类不同哺乳动物同种肿瘤细胞的融合或来自同类不同哺乳动物不同种肿瘤细胞的融合。
5.根据权利要求4所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于肿瘤细胞的融合是来自不同病人的同种肿瘤细胞的融合或不同病人的不同种肿瘤细胞的融合。
6.根据权利要求1所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于树突状细胞与非树突状细胞的融合是采用化学方法融合或物理学方法融合或生物学方法融合以及受体指引型细胞融合法。
7.根据权利要求6所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于化学方法融合包括以下过程a、培养一定量的树突状细胞，b、取得一定量的非树突状细胞，该细胞具有多种类表面抗原，c、树突状细胞与非树突状细胞按比例通过一种融合剂接触在一起，d、将接触在一起的细胞培养在一种培养基中，细胞的融合需要一个培养过程，选择性培养融合细胞疫苗，融合细胞疫苗具有树突状细胞和非树突状细胞的特点。
8.根据权利要求6所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于物理学方法融合是电融合，具体过程是将树突状细胞与非树突状细胞按比例混合于5％葡萄糖溶液，将装该溶液的槽置于电脉冲仪的正负极之间，通过通电，在高压电脉冲的作用下，使得这二种细胞瞬间接触结合成融合细胞疫苗。
9.根据权利要求7或8所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于树突状细胞与非树突状细胞之间的比例是1∶1-25∶1。
10.根据权利要求5所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于肿瘤细胞的融合是采用化学方法融合或物理学方法融合或生物学方法融合以及受体指引型细胞融合法。
11.根据权利要求10所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于化学方法融合包括以下过程a、提取不同病人同种肿瘤细胞或提取不同病人不同种肿瘤细胞，这些细胞表面具有多种类肿瘤抗原，b、通过一种融合剂将同种肿瘤细胞接触在一起或不同种肿瘤细胞接触在一起，c、细胞的融合需要一个培养过程，将接触在一起的细胞培养在一种培养基中，选择培养融合细胞。
12.根据权利要求7或11所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于融合剂是聚乙二醇。
13.根据权利要求7或11所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于培养基是RPMI-1640培养基或DMEM培养基。
14.根据权利要求10所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于物理学方法融合是电融合，具体过程是将不同病人的同种肿瘤细胞或不同种肿瘤细胞置于5％葡萄糖溶液，将装该溶液的槽置于电脉冲仪的正负极之间，通过通电，在高压电脉冲的作用下，使得肿瘤细胞瞬间接触和结合。
15.根据权利要求2或3所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于树突状细胞和肿瘤细胞来自同体或异体。
16.根据权利要求3所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于树突状细胞和非树突状细胞来自人类个体细胞。
17.根据权利要求1所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于融合细胞表面抗原是多种类肿瘤抗原。
18.根据权利要求1或7或8所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于融合疫苗具有(a)主要组织相容性复合体Ⅰ和Ⅱ，(b)共同刺激抗原，(c)细胞表面多种类肿瘤抗原。
19.根据权利要求7所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于树突状细胞的培养可来源于哺乳动物骨髓细胞或周围血，脐带血。
20.根据权利要求1或7或8所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于融合疫苗中至少有一个哺乳类树突状细胞。
21.根据权利要求1或2或16所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于非树突状细胞可采用非洲淋巴细胞瘤病毒转化细胞的培养。
22.根据权利要求1或2或16所述的抗肿瘤免疫疫苗的制取方法，其特征在于非树突状细胞可以将已知抗原基因转入。
全文摘要
本发明涉及一种抗肿瘤免疫疫苗的制取方法。通过先对非树突状细胞之间进行融合,再将融合后的细胞与树突状细胞融合,从而制取抗肿瘤免疫疫苗。本发明集中多种肿瘤细胞的共同性,使得融合后的免疫疫苗细胞表面具有多种、多样性抗原表达,从而使免疫疫苗适用于多种肿瘤病人的治疗。所以,本发明可用于制取具有多种类肿瘤抗原的免疫疫苗,为生产肿瘤新药物提供了方法。
文档编号A61P35/00GK1306859SQ0010179
公开日2001年8月8日 申请日期2000年2月3日 优先权日2000年2月3日
发明者龚建林 申请人:龚建林