一种增强发酵乳中蛋白质水解的方法
【专利摘要】本发明提供了一种增强发酵乳中蛋白质水解的方法，所述方法将经过热激修饰的瑞士乳杆菌按3％～8％(v/v)的接种量接种于灭菌处理的8％～15％(m/v)的牛乳中，厌氧培养得到发酵乳制品。本发明发酵过程中能够显著抑制菌体的产酸，发酵完成后不易产生苦味，菌体胞内和胞外蛋白水解酶系共同作用于乳蛋白，发酵结束后能产生较多种类的小肽段和一些功能性肽段，提高发酵乳中小肽的含量，加大乳中各蛋白质的水解程度，有利于肠道的消化吸收，有利于过敏性物质消除，并且所产生的生物活性肽有利于对身体机能的调节。
【专利说明】
一种增强发酵乳中蛋白质水解的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及食品加工领域，具体地说，涉及一种增强发酵乳中蛋白质水解的方法。
【背景技术】
[0002] 在牛奶中，酪蛋白是主要蛋白质，约占蛋白质总量的80%，相对于乳清蛋白，酪蛋 白在胃内酸和酶的作用下容易形成比较结实的乳凝块，不利于消化吸收，尤其是对于婴幼 儿和一些肠胃消化功能不好的病人，大大降低了牛乳蛋白的利用率。另外，肠道所吸收的肽 类主要是由10个以下氨基酸残基构成的寡肽，尤其是小肽。所以，如果能水解牛乳中的酪 蛋白成为分子量较小的寡肽将会大大促进牛乳的消化吸收，提高牛乳蛋白质的利用率。在 目前的技术中，较多采用添加乳清蛋白或酶解的方式来降低牛乳中酪蛋白的比例。添加乳 清蛋白是目前婴幼儿配方乳粉和一些儿童乳制品中广泛采用的方法，乳清蛋白是干酪制作 过程中产生的副产物，由于国内干酪产业发展缓慢，国内使用的乳清粉大多采用进口，另外 乳清与酪蛋白相比其营养价值较低，不适宜大规模添加。对酶解酪蛋白的研究，目前较多采 用单一蛋白酶或者两种或两种以上蛋白酶酶解的方式，所采用蛋白酶大多为胃蛋白酶、胰 蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶等等，其水解程度不易控制，容易产生较多苦味肽和其他 不良风味，影响产品感官特性，水解所产生的的小肽种类也较少。
【发明内容】
[0003] 为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种增强发酵乳中蛋白质 水解的方法。
[0004] 为了实现本发明目的，本发明首先提供一种增强发酵乳中蛋白质水解的方法，所 述方法将经过热激修饰的瑞士乳杆菌按3 %~8 % (v/v)的接种量接种于灭菌处理的8 %~ 15% (m/v)的牛乳中，厌氧培养得到发酵乳制品。
[0005] 作为优选，所述瑞士乳杆菌的接种量为4%。
[0006] 进一步地，所述厌氧培养的混合气配比为N2:C02:H 2= 90:5:5(v/v/v)，纯度为 99. 99 %，培养温度为30 °C~45 °C，培养时间为4h~16h。
[0007] 更为优选，所述方法将经过热激修饰的瑞士乳杆菌按4%的接种量接种于灭菌处 理的12%的脱脂乳中，37°C厌氧培养8h，得到发酵乳制品。
[0008] 更进一步地，所述经过热激修饰的瑞士乳杆菌的制备方法包括如下步骤：
[0009] 1)瑞士乳杆菌活化：将储存在-80°C冰箱的菌株取出，以3%的接种量，采用MRS 肉汤培养基在37°C厌氧条件下培养24h~36h，活化3代至活力恢复；
[0010] 2)瑞士乳杆菌的培养：将活化完成的菌株按3%的接种量接种于MRS肉汤培养基， 37°C厌氧高密度培养48h ;
[0011] 3)瑞士乳杆菌热激修饰前的准备：收获的菌体采用pH 7. 0的磷酸盐缓冲液冲洗 两次，然后重悬于pH 7. 0的磷酸缓冲液，并调整菌体浓度为1012cfu/mL左右；
[0012] 4)瑞士乳杆菌的热激：将准备的瑞士乳杆菌悬浮液在50°C~80°C条件下热激处 理5s~30s，得到热激修饰的瑞士乳杆菌，4°C存放备用。
[0013] 作为优选，所述步骤4)中将准备的瑞士乳杆菌悬浮液在67°C条件下热激处理 13s〇
[0014] 其中，所述MRS肉汤培养基的配方为：蛋白胨10. 0g，牛肉粉10. 0g，酵母粉5. 0g， 葡萄糖20. 0g，硫酸镁0. lg，醋酸钠5. 0g，柠檬酸铵2. 0g，磷酸氢二钾2. 0g，硫酸锰0. 05g， 土温 801. OmL，去离子水 1000mL，pH 6. 2。
[0015] 本发明还提供了前述方法制备得到的发酵乳。
[0016] 本发明的有益效果在于：
[0017] 本发明采用经过热激修饰的瑞士乳杆菌，用于乳制品的发酵，发酵过程中能够显 著抑制菌体的产酸，发酵完成后不易产生苦味，菌体胞内和胞外蛋白水解酶系共同作用于 乳蛋白，发酵结束后能产生较多种类的小肽段和一些功能性肽段，提高了发酵乳中小肽的 含量，增大乳中各蛋白质的水解程度，有利于肠道的消化吸收，有利于过敏性物质消除，并 且所产生的生物活性肽有利于对身体机能的调节。
【附图说明】
[0018] 图1为本发明人实施例1中不同接种量下发酵过程中的pH值变化。
[0019] 图2为本发明人实施例1中不同发酵温度下发酵过程中的pH值变化。
[0020] 图3为本发明实施例2所述发酵过程中pH值的变化。
[0021] 图4为本发明实施例2所述发酵过程中12% TCA-SN(a)和pH4. 6-SN(b)的变化 (12%^^-5^溶于12%三氯乙酸的游离氨基氮含量，？財.6-5^溶于？!14.6的游离氨基氮 含量）。
[0022] 图5为本发明人实施例2所述发酵过程中产生肽段的液相色谱串联质谱检测；其 中，a :热激组中不同发酵时间组的肽段分布；b :未热激组中不同发酵时间组的肽段分布； c :热激组和未热激组中9肽的个数随发酵时间的变化情况。
[0023] 图6为本发明人实施例2中对未热激组中3B组和热激组中5R组中识别多肽的统 计；其中，a :3B和5R组中多肽分布；b :3B和5R组中所识别的多肽在几种常见蛋白的覆盖 率；c :3B和5R组中所识别的多肽在几种常见蛋白中的分布。
[0024] 图7为本发明人实施例2中通过nanoLC-QE-MS/MS检测和Proteome Discoverer 1. 4分析鉴定出热激组5R组中的三条特异性活性肽段图谱，VRGPFPIIV(a)， QKALNEINQF(b), YQEPVLGPVRGPFPI (c) 〇
【具体实施方式】
[0025] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0026] 实施例中涉及的检测方法为：
[0027] 1) pH检测：数显式pH计检测。
[0028] 2)游离氨基氮检测：采用〇 -邻苯二甲醛（0ΡΑ)试剂法检测12% TCA_SN(12% (w/ v) TCA浓度下可溶性氮含量），pH4. 6-SN (pH4. 6下的可溶性氮含量）。
[0029] 3)小肽段检测：采用Thermo公司UltiMate 3000纳升高效液相色谱串联 Q-Exactive质谱检测。
[0030] 实施例1
[0031] 1、菌种活化。将-80°C保藏的菌株采用MRS肉汤培养基活化三代至活力恢复。
[0032] 2、菌株的高密度培养。将活化完成的菌株在MRS肉汤培养基中培养48h，采用大容 量冷冻离心机收获菌体，并用PH7. 0的磷酸缓冲液洗涤菌体两遍，最后菌体重悬于pH7. 0的 磷酸缓冲液，并调整菌体浓度为1012cfu/mL，4°C保藏备用。
[0033] 3、菌体热激处理。将菌体悬浮液通过
【申请人】已获得专利权的热激设备（公开号CN 101735965A)，在67°C处理13s，置于4°C保藏备用。
[0034] 4、不同接种量的发酵试验。将热激完成后的瑞士乳杆菌菌液按照2%、3%、4%、 5%、6%的接种量接种于灭菌脱脂乳培养基中，混合均匀，置于37°C厌氧培养箱培养。每隔 一段时间取样检测。
[0035] 5、不同温度下的发酵试验。将热激完成后的瑞士乳杆菌菌液按照步骤4中所得接 种量接种于灭菌脱脂乳培养基中，混合均匀，置于31°(：、34°(：、37°(：、40°(：、43°(：厌氧培养箱 培养。每隔一段时间取样检测。
[0036] 6、结果显示，随着接种浓度的加大和发酵温度的升高，pH值所反映的菌体代谢活 性的增加，如图1所示，接种量较小时，菌体发酵活力较弱，pH值变化不大，随着接种量的加 大，菌体发酵活力增强，同时考虑添加量与经济的关系，选择4%的添加量为好。如图2所 示，发酵温度较低时，菌体活动较慢，加上热激效应对菌体的影响，温度较低不利于菌体生 长，不利于发酵活动的进行，而温度较高时，菌体生长较为迅速，不利于热激作用对菌体内 酶的释放，故选用37°C为试验发酵温度。
[0037] 实施例2
[0038] 1、菌株活化。将_80°C保藏的菌株采用MRS肉汤培养基（购自北京路桥技术有限 责任公司，商品名称：MRS肉汤）活化三代至活力恢复。
[0039] 2、菌株的高密度培养。将活化完成的菌株在MRS肉汤培养基中培养48h，采用大容 量冷冻离心机收获菌体，并用pH 7.0的磷酸缓冲液洗涤菌体两遍，最后菌体重悬于pH 7.0 的磷酸缓冲液，并调整菌体浓度为1012cfu/mL，4°C保藏备用。
[0040] 3、菌体热激处理。将菌体悬浮液通过
【申请人】已获得专利权的热激设备（公开号CN 101735965A)，在67°C处理13s，置于4°C保藏备用。
[0041] 4、热激菌体发酵。将12% (w/v)脱脂乳培养基灭菌完成后，按4% (v/v)接种量 接种热激处理后的菌液，混合均匀，置于37°C厌氧培养箱培养。每隔一段时间取样检测。
[0042] 5、发酵过程中的pH值、12% TCA-SN、pH4. 6-SN和多肽的检测。
[0043] 检测方法：
[0044] 5. 1 pH 值检测
[0045] 采用数显式pH计，经过标准pH值溶液校准。
[0046] 5. 2 12% TCA-SN 值和 pH4. 6-SN 值的检测
[0047] 12% TCA-SN的制备取3mL牛乳样品与3mL 24% TCA溶液混合均匀，室温下静置 30min，在5000Xg，4°C条件下离心20min，再经过慢速定量滤纸过滤所得，-20°C放置备用。
[0048] pH4. 6-SN的制备取3mL牛乳样品，用1M NaOH溶液或者1M盐酸溶液调整pH值 为4. 6,室温下静置30min，在5000 X g，4°C条件下离心20min，再经过慢速定量滤纸过滤所 得，-20 °C放置备用。
[0049] 检测采用邻苯二甲醛法（0ΡΑ法）检测。邻苯二甲醛试剂的配制：准确称取0. 040g 邻苯二甲醛溶解于lmL甲醇溶液中，称取0. 950g四硼酸钠（Na2B407 ·10Η20)，0. 5g十二烷基 磺酸钠，加入1〇〇 μ L β -疏基乙醇，溶解后定容至50mL，现配现用。取100 μ L样品滤液，加 入2mL现配的邻苯二甲醛试剂，室温条件下精确反应2min，测定在340nm波长下的吸光度。
[0050] 5. 3 发酵乳中多妝的 Nano-LC-Q-Exactive-MS/MS 检测
[0051] 样品的制备：取lmL制备的12% TCA-SN溶液，经过Waters公司Oasis HLB固相萃 取小柱处理，洗脱液经过冷冻干燥后复溶于0.1 % (v/v)的甲酸水溶液。在10000Xg、4°c 条件下离心10min，取上清液进行液相色谱串联质谱检测。
[0052] 色谱条件：采用Thermo公司UltiMate 3000纳升高效液相色谱系统，上样量 1 μL，富集柱：C18 Acclaim PepMaplOO column (100 μmX2cm，nanoViper，C18,5 μm， 100 A: Thermo Scientific)，分析柱：Acclaim PepMap RSLC 75ymX15cm，nanoViper， C18, 2 μ m，100 A; Thermo Scientific，流动相 A :水：乙腈：甲酸=98:2:0. 1 (v/v/v)，流 动相B :水：乙腈：甲酸=20:80:0. l(v/v/v)，流速：0. 25yL/min，洗脱梯度：B相初始保持 4% 4min，在95min内线性增加到35%，再在10min内增加到90%。在下一个上样前，用初 始浓度平衡8min，总分析时间为120min。柱温35°C。
[0053] 质谱条件：高效液相色谱串联Thermo公司Q Exactive液相四极杆轨道讲傅里叶 转换高分辨质谱系统。在正极模式下，电压2. 5Kv，m/z扫描范围是200-3000。完成后经过 Thermo 公司 Thermo Proteome Discoverer 1. 4 分析，分析数据库来源于 www. ncbi. org，软 件参数为：裂解位点：unspecific enzyme ;片段离子mass tolerance :0· 02Da ;每个识别肽 段的precursor mass tolerance : 10ppm ;有效肽段的q-value小于0· 05,最低肽段长度：4 个氨基酸残基。
[0054] 6、实验结果
[0055] 6. 1发酵过程中的pH值变化。
[0056] 通过热激处理后，经过MRS培养基计数显示，菌体存活数为109cfu/mL。在6h的发 酵时间内，与未热激组相比，热激组菌体产酸明显受到抑制，在发酵16h后二者才没有显著 差异（见图3)。
[0057] 6. 2发酵过程中可溶性氮的变化
[0058] 12% TCA-SN表示的是可溶性小肽（含有2-20个氨基酸残基）的含量。如图4a 所示，在随着培养时间的进行，热激组和未热激组都呈逐渐增加趋势，在6h的培养时间内， 热激组增加缓慢，未热激组增加较为迅速，热激组的12% TCA-SN的值在6h-10h内增加迅 速，并在18h后进入平台期，未热激组在10h后进入平台期。在发酵过程中，热激处理的瑞 士乳杆菌产酸能力受到明显抑制，同时其水解产生小肽和氨基酸的能力也受到抑制，12% TCA-SN的值增加缓慢，但是蛋白质在热激菌体的作用下持续水解，肽段也在持续增多。这主 要是菌体经过热激处理后，菌体细胞壁变薄、细胞膜的通透性增强，菌体内大量的蛋白水解 酶系会缓慢的释放出来，牛乳蛋白在胞外蛋白水解酶系的作用下，大分子蛋白水解成多肽 段，多肽在胞内酶系的作用下会进一步水解成小分子肽段和氨基酸。经过热激处理后，菌体 细胞壁上附着的一些热敏感性酶系会受到较大影响，这也可能是导致小肽生成量减少的原 因之一。
[0059] pH4. 6-SN表示的是除去不溶性蛋白的部分。不像12% TCA-SN仅包含小分子肽 段，pH4. 6-SN还会有部分可溶性小分子蛋白的存在，如图4b所示，热激处理的瑞士乳杆菌 在6h-10h内迅速增加，在12h后即达到平台期，并且与未热激组没有显著差异。在热激组 12% TCA-SN减少的同时，pH4.6-SN的值却与未热激组没有显著差异表明有更多的大分子 多肽的生成。这主要是胞外蛋白水解酶系的作用范围，可能是菌体经过热激处理后，细胞壁 的通透性增强，使胞外蛋白酶系更多更快的渗透出去，促进牛乳中蛋白的水解，生成更多的 蛋白多肽。
[0060] 6. 3 发酵过程中多肽的 Nano-LC-Q-Exactive-MS/MS 检测
[0061] 发酵过程中生成的肽段经过Nano-LC-Q-Exactive-MS/MS的检测，在所识别的多 肽中选取相对分子质量在3kDa以下的多肽进行统计分析。
[0062] 以肽段中所含的氨基酸残基数为横坐标，以此长度下的肽段个数为纵坐标，各选 取3组具有典型肽段分布的时间点绘制直方图如图5所示。在不同的发酵时间，肽段的长 度分布明显不同，4R (发酵6h)和5R (发酵8h)包含有较多的9-12个氨基残基的肽段，其中 5R组最多（如图5a所示），在发酵前期包含9-17个氨基酸残基的多肽数较多，肽段越长， 其数目越少，随着发酵时间的进行，包含9-17个氨基酸残基的多肽数逐渐降低，21个左右 的氨基酸残基逐渐增多，经过12_14h发酵后（7R组，8R组）肽段分布趋于稳定。有研究表 明，酪蛋白在经过6h左右的消化后，含有6-9个氨基酸残基（相对分子质量在750到1050Da 之间）的多肽含量较多，乳清蛋白经过6h消化后，含有9-15个氨基酸残基（相对分子质量 在1050到1800Da之间）的多肽含量较多，所以，肠道中含有9个左右氨基酸残基的多肽较 易于消化吸收。发酵过程中的9肽含量的变化如图5c所示，经过热激处理后，与未热激组 相比，菌体发酵牛乳产生9肽的含量增加了 27. 78%，虽然这一结果延迟了 4个小时。
[0063] 瑞士乳杆菌发酵牛乳过程中，蛋白水解酶系随着发酵时间的进行不断分泌，并在 热激修饰的作用下不断加强，并且经过热激修饰后，菌体生长减慢，菌体本身所利用的肽减 少，导致多肽的大量积累。小肽的不断快速积累并在8h左右达到峰值，随着在菌体的正常 快速生长下，小肽不断被利用，并达到稳定。
[0064] 如图5a/b所示，可以明显的看出肽段分布数包含8-13个氨基酸残基的I区和包 含17-25个氨基酸残基的II区两个部分。在发酵前期，I区占主要部分，并且随着发酵时间 的进行，I区峰值不断升高，在发酵8h(5R)处达到最大值，随后I区峰值降低，II区峰值不 断升高。在II区大分子肽段的生成上，未热激组含量较高，这个可能是因为在发酵过程中， 未热激组中的牛乳蛋白在菌体胞外酶的作用下水解成大的肽段，热激组能够利用释放的胞 内酶对大肽段进一步水解，而未热激组不能，从而导致这部分肽段相对热激组有较高含量。
[0065] 6. 4对发酵过程中3B和5R组进行对比
[0066] 将未热激组中3B组和热激组中5R组的多肽个数与长度的关系置于图6a中，它们 是各自组中9个左右氨基酸残基数肽段含量较多的发酵时间段。5R组肽段含量整体高出 于3B组，尤其是9肽的含量上，5R组比3B要高出27. 78%。这表明，经过热激处理的瑞士 乳杆菌发酵牛乳时，所产生的多肽不管是数量还是种类都比未热激组要高，这都是蛋白水 解酶系的作用，经过了复杂的蛋白酶系的作用，生成了更多的小肽。
[0067] 在所鉴定出的相对分子质量低于3kDa的多肽中，3B组含有924种多肽段，而5R组 含有1183种，高出28. 03%。两组肽段经过比对后发现，5R组有549种3B组不含有的特异 性多肽。
[0068] 在蛋白中的鉴定出的多肽覆盖率上，与未热激组相比，热激组肽段在α_乳白蛋 白和β-乳球蛋白的覆盖率从14%提高到18%，在酪蛋白上的覆盖率从78%提高到99%， 尤其是对β -乳球蛋白，所识别的多肽中热激组肽段覆盖率比未热激组提高了 87. 58 % (如 图6b所示），这表明瑞士乳杆菌经过热激修饰后，在发酵过程中对β -乳球蛋白的水解特异 性增强了，这都将有助于α -乳白蛋白、β -乳球蛋白和酪蛋白作为牛乳过敏原的过敏性的 降低与消除。在几种主要蛋白质所生成的肽段数目上，热激组5R组比未热激组3Β中各蛋 白所生成的肽段数目高出21. 47% (如图6c所示）。
[0069] 6. 5通过nanoLC-QE-MS/MS鉴定出的5R组中的特异性活性肽
[0070] 将5R组和3B组中所鉴定出的多肽与NCBI数据库中做对比，我们发现了一批瑞士 乳杆菌发酵产生的生物活性肽，其中，5R组和3B组共同含有的有16个多肽（表1)，由经过 热激修饰瑞士乳杆菌特异性产生的有3个（表2)。
[0071] 在5R组中所特有3个活性肽中，VRGPFPIIV来自于β-酪蛋白（图7a)，具有抗高 血压的特性；QKALNEINQF来自于a -S2酪蛋白（图7b)，具有多种生物活性，比如ACE抑制 活性，PEP抑制活性，抗氧化活性等；和来自于β -酪蛋白的YQEPVLGPVRGPFPI (图7c)，具有 抗囷活性。
[0072] 表1在5R组和3B组中同时出现的生物活性肽
[0074]
[0075] xThe peptide-spectrum matches
[0076] 2 单位：min
[0077] 表2在5R组中所特有的生物活性肽
[0078]
[0079] xThe peptide-spectrum matches
[0080] 2 单位：min
[0081] 虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在 本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因 此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
【主权项】
1. 一种增强发酵乳中蛋白质水解的方法，其特征在于，所述方法将经过热激修饰的瑞 士乳杆菌按3%~8% (v/v)的接种量接种于灭菌处理的8%~15% (m/v)的牛乳中，厌氧 培养得到发酵乳制品。2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述瑞士乳杆菌的接种量为4%。3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述厌氧培养的混合气配比为N2: C02:H 2 = 90:5:5，v/v/v，纯度为99. 99 %，培养温度为30°C~45°C，培养时间为4h~16h。4. 根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法将经过热激修饰的瑞士乳杆菌 按4%的接种量接种于灭菌处理的12%的脱脂乳中，37°C厌氧培养8h，得到发酵乳制品。5. 根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述经过热激修饰的瑞士乳杆菌的制备 方法包括如下步骤： 1) 瑞士乳杆菌活化：将储存在-80°C冰箱的菌株取出，以3%的接种量，采用MRS肉汤 培养基在37°C厌氧条件下培养24h~36h，活化3代至活力恢复； 2) 瑞士乳杆菌的培养：将活化完成的菌株按3%的接种量接种于MRS肉汤培养基，37°C 厌氧高密度培养48h ; 3) 瑞士乳杆菌热激修饰前的准备：收获的菌体采用pH7. 0的磷酸盐缓冲液冲洗两次， 然后重悬于PH7. 0的磷酸缓冲液，并调整菌体浓度为1012cfu/mL左右； 4) 瑞士乳杆菌的热激：将准备的瑞士乳杆菌悬浮液在50°C~80°C条件下热激处理 5s~30s，得到热激修饰的瑞士乳杆菌，4°C存放备用。6. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中将准备的瑞士乳杆菌悬浮 液在67°C条件下热激处理13s。7. 根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述MRS肉汤培养基的配方为：蛋白 胨10. 0g，牛肉粉10. 0g，酵母粉5. 0g，葡萄糖20. 0g，硫酸镁0. lg，醋酸钠5. 0g，柠檬酸铵 2. 0g，磷酸氢二钾 2. 0g，硫酸锰 0. 05g，土温 801. OmL，去离子水 1000mL，pH6. 2。8. 权利要求1~7任一项所述方法制备得到的发酵乳。
【文档编号】C12R1/225GK106031388SQ201510117951
【公开日】2016年10月19日
【申请日】2015年3月17日
【发明人】陈历俊, 张咚咚, 姜铁民, 周伟明
【申请人】北京三元食品股份有限公司