保护亲脂性营养物免于瘤胃降解的方法

保护亲脂性营养物免于瘤胃降解的方法
【专利摘要】本发明涉及的领域是增加亲脂性营养物(如多不饱和脂肪酸)的十二指肠流动和吸收，以增强其在动物产品如肉和奶中的含量。这种增加被推荐用来改善消耗动物产品的人类的和动物本身的健康。更具体地，本发明涉及制备蛋白质?苯酚基质包封的亲脂性营养物液滴的水包油乳液的方法。所述蛋白质?苯酚基质的形成需要从特定植物中提取的多酚氧化酶的存在以及二酚的加入这两个条件。当作为饲料供给时，后面的乳液可以保护亲脂性营养物免受存在于动物瘤胃中微生物的降解，因此使得这些未降解营养物可以进一步在动物的体内进行转移。此外，后面的乳液也可以在存储或加工过程中用于针对变质(例如由于氧化)保护亲脂性营养物。
【专利说明】保护亲脂性营养物免于瘤胃降解的方法
[0001] 发明的技术领域
[0002] 本发明设及的领域是增加亲脂性营养物(如多不饱和脂肪酸）的十二指肠流动和 吸收，W增强其在动物产品如肉和奶中的含量。运种增加被推荐用来改善消耗动物产品的 人类的和动物本身的健康。更具体地，本发明设及制备蛋白质-苯酪基质包封的亲脂性营养 物液滴的水包油乳液的方法。所述蛋白质-苯酪基质的形成需要从特定植物中提取的多酪 氧化酶的存在W及二酪的加入运两个条件。当作为饲料供给时，后面的乳液可W保护亲脂 性营养物免受存在于动物瘤胃中微生物的降解，因此使得运些未降解营养物可W进一步在 动物的体内进行转移。此外，后面的乳液也可W在存储或加工过程中用于针对变质(例如由 于氧化)保护亲脂性营养物。
【背景技术】
[0003] 瘤胃微生物为反当动物提供了利用结构性碳水化合物和非蛋白质氮的独特能力。 但是，微生物与反当动物的运种共生也导致亲脂性营养物(诸如某些维生素和多不饱和脂 肪酸(PUFA))在瘤胃中的降解，使得运些不再可用于吸收。运种对高品质营养物的低效率利 用会对反当动物的健康产生不良影响，并且会恶化动物产品质量。因此，已设想了瘤胃保护 (也称为瘤胃通过)营养物的施用。
[0004] 因为(n-3)PUFA对于人类和动物的健康益处，几种技术试图保护它们在瘤胃中不 被生物氨化(饱和化）。保护技术依赖于如将油滴包埋入甲醒交联蛋白质基质W，使用复合 凝胶(2)，形成化皂(2)或酷胺类(2)，非酶褐变(2)或者在Ξ酷基甘油醋中包封化S 6,013,286)。 然而，运些技术中的每一种显示出严重的缺点，设及保护功效、有毒物质的使用和/或加工 的限制。事实上，针对瘤胃生物氨化保护油类的最有效的技术之一是将油滴包埋入蛋白质 基质，随后甲醒处理W。运里，在甲醒和蛋白质基质中的氨基酸之间形成的络合物，产生保 护壳化S 3,925,560)。已经表明，使用经甲醒处理的富含运些脂肪酸的乳化油可^使乳脂 中亲脂性营养物水平提高一些。然而，甲醒是有毒的产品，在欧盟使用它是受严格规定 的（2011/391/抓）。
[0005] 如上所述，存在对通过PUFA的替代技术，如巧皂、酷胺制剂或者"复合凝胶"（US 2004/0058003)。然而，运些技术都没有效率。例如，由1)脂质液滴的分散相和2)凝胶的连续 (水)相中的交联蛋白质组成的复合凝胶的制备需要在80至125°C下加热约20至80分钟的步 骤。该加热步骤可W在复合凝胶中产生化合物的氧化反应。已知一些饲料补充物的氧化产 物是有毒的。因此，运是在包封营养物之前的生产过程中使用热的主要缺点。今天最常用的 另一种技术是将营养物包封在脂质基质中（US 6,013,286和Robinson等人W)。然而，运种 脂质基质可能显示出对如造粒、膨胀和挤压的技术处理有限的耐性(6)。
[0006] 对红Ξ叶草，已描述了一种基于多酪氧化酶(PP0)的自然机制，其能够保护存在于 叶绿体中的膜脂肪酸(Van Ranst等人(7))。高PFO活性被认为在运方面是必要的(化η Ranst 等W)"PP〇是苯酪和二酪氧化酶，导致酿的形成。后来的作者总结，由pro介导的二酪氧化引 起的蛋白质-苯酪络合物的中的包封可能有效地针对前瘤胃和瘤胃降解保护植物膜中存在 的脂质。Parveen等人w公开了许多从几种饲草、豆类、谷类或芸苔属物种中鉴别的苯酪，它 们可作为PPO活性的结果被氧化。但是，在对特定的（二)苯酪(或基底）的PPO活性程度和针 对降解的亲脂性营养物保护程度之间是否存在任何相关性是未知的！
[0007] 附图简述
[000引图1:在水包亚麻巧油乳液中C18:化-3的瘤胃生物氨化，使用来自不同植物源的富 含PP0的蛋白质提取物和不同浓度的4-甲基儿茶酪(0、12.5、25或501111)作为二酪剂在体外 溫育24h之后
[0009]图2:C18:化-3的瘤胃生物氨化，使用来自不同植物源的富含PP0的蛋白质提取物 和40mmol的4-甲基儿茶酪作为二酪剂在体外溫育24h之后
[0010]图3:在体外溫育24h后C18:：3n-3的生物氨化是受油和二酪浓度影响的。实施例2的 乳液(通过在25M化下5次通过微流化床器制备的)使用红Ξ叶草蛋白质提取物作为乳化剂， 并且包含4个不同的油浓度(每升蛋白质提取物中10、20、30或40g油），不同水平的额外酪蛋 白（每升蛋白质提取物中〇、1或2g额外酪蛋白；平均值表示)和不同的二酪浓度(0、12.5、25 或50mM 4-甲基儿茶酪）。误差条代表平均值的标准误差。a、b、\d表示p《〇.〇5(n = 3)时油浓 度和4-甲基儿茶酪浓度之间的生物氨化差异
[OOW 图4:根据对数曲线，保护效率随着4-甲基儿茶酪的量/平方米在水包亚麻巧油乳 液内液滴的界面表面积(mmol4-甲基儿茶酪/V)增大而增加，一旦每平方米存在于乳液中 的表面积上在系统中可用的4-MC超过0.25mmol就达到平台。如在图3中所述制备的乳液。 [0012] 图5:将4-甲基儿茶酪加入红Ξ叶草水包亚麻巧油乳液(通过在25MI^下5次通过微 流化床器制备的）和用4-己基间苯二酪使PPO失活之间的时间的增长导致C18:化-6和C18: 化-3生物氨化的降低，在体外溫育2地后
[001引图6:水包鱼油乳液中的C20: 5n-3和C22: 6n-3的瘤胃生物氨化，使用来自红立叶草 的富含PPO的蛋白质提取物和4-甲基儿茶酪(0或20mM)作为二酪剂在体外溫育24h后(灰条 代表没有加入4-甲基儿茶酪的，黑条代表具有终浓度为20mM的4-甲基儿茶酪乳液，误差条 代表平均值的标准误差(n = 3))
[0014]图7:在2% (w/v)新鲜或洗涂过的水包亚麻巧油乳液中C18:化-3的瘤胃生物氨化， 使用莱自红Ξ叶草的富含PPO的蛋白质提取物在不同浓度的4-甲基儿茶酪(0、12.5、25或 50mM)作为二酪剂，在体外溫育24h后
[001引图8:连续五天(第1天至第5天）补充后，对于Lu化ell ComM和PPO乳液(含有前面 提到的脂肪酸并且使用马铃馨块茎皮的蛋白质提取物和20mM 4-甲基儿茶酪将其保护)都 观察到了牛奶中反-10、顺-12共辆亚油酸浓度(g/lOOg检测的脂肪酸）的增加，随后在洗脱 期(第6天到第10天)降低浓度。误差条代表标准偏差(n = 4奶牛）
[0016] 图9:在连续五天向四头奶牛补充了 7克反-10、顺-12共辆亚油酸后，对于Lu化ell Combi和PPO乳液(含有前面提到的脂肪酸并且使用马铃馨块茎皮的蛋白质提取物和20mM 4-甲基儿茶酪将其保护)都观察到了膳食反-10、顺-12共辆亚油酸向牛奶的转移效率的增 加。误差条代表标准偏差(n = 4)。在处理天数下粗斜体所示的数值代表相应处理天数补充 的PK)乳液批次的体外瘤胃保护效率。
[0017] 图10:在连续五天(第1天至第5天)补充后，对于Lu化ell Combi和PK)乳液(含有前 面提到的脂肪酸并且使用马铃馨块茎皮的蛋白质提取物和20mM 4-甲基儿茶酪将其保护） 都观察到了乳脂百分率的降低，随后在洗脱期(第6天到第10天)增加浓度直至常规水平。误 差条代表标准偏差(n = 4奶牛）
[001引发明描述
[0019] 本发明设及W下令人惊讶的发现：1)可W经由在蛋白质溶液内乳化该营养物来针 对降解保护亲脂性营养物，其中一部分所述蛋白质具有PP0活性，W及2)在来自植物的蛋白 质提取物中测得的PP0活性与降解程度之间没有相关性。因此，除了红Ξ叶草提取物，只有 来自植物或植物部分的特定选择的提取物可W用于针对降解保护亲脂性营养物。例如，本 发明证明，具有与红Ξ叶草的PP0活性可比的PP0活性的某些植物物种（如茄（Solanum melongena L.)或茄子，或者，小果野蕉（Musa acuminate Colla)AAA组栽培品种Grand 化in(AAA group cv Grand化in)或香蕉，或者，西洋梨(Pyrus communis)或梨）没有或具 有非常有限的针对降解的保护效果，而其他具有与红Ξ叶草的PK)活性可比的（如(Solanum tuberosum L.)马铃馨或±豆）或明显更低的（如甘蓝(Brassica oleracea L.)品种诸如花 挪菜或西兰花)PP〇活性的植物物种确实具有运样的效果。尽管如此，当在二酪(如4-甲基儿 茶酪(methylcathechol))基质的存在下在没有PP0活性的蛋白质（如酪蛋白）溶液中乳化营 养物不针对降解保护时，一些PK)活性是必需的。
[0020] 因此本发明第一种情况设及基于从植物/植物物种的特定选择中提取的含多酪氧 化酶的蛋白质的使用来针对降解保护亲脂性营养物的方法。术语"降解"在第一种情况下是 指由在瘤胃中的强微生物代谢引起的瘤胃降解，诸如水解(包括脂解）、生物氨化和发酵，但 是也指在亲脂性营养物的转换过程期间的降解(诸如但不限于脂解和氧化）。
[0021] 更具体地，本发明设及用于针对降解保护亲脂性营养物的方法，其包括：
[0022] -制备乳化蛋白质的溶液，其中所述蛋白质的一部分具有多酪氧化酶活性，
[0023] -将所述亲脂性营养物加入所述乳化蛋白质的溶液，
[0024] -将所述亲脂性营养物在所述蛋白质溶液中乳化，W获得稳定的水包油乳液，W及
[0025] -在分子氧的存在下将一定量的二酪加入所述乳液，
[0026] 其中所述乳化蛋白质提取自选自W下物种清单的植物或其一部分：马铃馨 (Solanum tuberosum L.)、番茄（Solanum lycopersicum L.)、洋劑（Cynara scolymus L.)、渡菜（Spinacia oleracea L)和甘蓝（Brassica oleracea L.)物种。
[0027] 后一种方法的备选的实施方案中，也可W在将所述亲脂性营养物乳化在所述蛋白 质溶液中之前将二酪加入到所述乳化蛋白质的溶液。
[0028] 术语"亲脂性营养物"是指任何必须从环境中摄入的在生物体的新陈代谢中使用 的亲脂性化学物质。术语"亲脂性"是指所述营养物溶解在甘油醋(如脂肪和油)和非极性溶 剂如己烧或甲苯中的能力。运些非极性溶剂本身是亲脂性的。因此亲脂性营养物溶解在其 他亲脂性物质或化学物质中，而亲水性营养物倾向于溶解在水和其他亲水性物质或化学物 质中。术语亲脂性营养物是指源自植物或动物的或从化学过程中获得的任何油或脂肪。更 具体地，术语亲脂性营养物是指一种油，诸如但不仅限于亚麻子油、鱼油或者包含通常含有 80%的共辆亚油酸的和衍生自红花油的甘油醋的油（例如来自BASF的TOMLIN? TG80)，或 者是指脂溶性维生素，诸如但不仅限于维生素 A、D或E。术语"亲脂性营养物"可W还例如设 及任何ω -3和/或ω -6和/或ω -9和/或共辆多不饱和(甘油结合的）脂肪酸，W及诸如百里 酪的植物二次代谢物等。
[0029] 术语"制备乳化蛋白质的溶液"基本上设及任何在本领域中公知的方法，首先从特 定植物中提取蛋白质，并且其次将所述蛋白质溶解在合适的溶剂(如憐酸盐缓冲液）中，W 得到只有一相组成的均匀混合物。"制备乳化蛋白质的溶液"的非限制性实施例可W依靠， 如Van Ranst等人描述的用于蛋白质提取W评估PP0活性的方法W，并且包括:收获适当量 的特定植物材料，将所述植物材料与缓冲液、抗坏血酸(抗坏血酸抑制多酪氧化酶活性）W 及例如聚乙締化咯烧酬(pvp)的能够捕捉酪类的化合物通过共混机混合W得到混合物，过 滤并离屯、后面的混合物W获得上清液，添加丙酬至所述上清液并保持所获得溶液在约-18 °C的溫度下至少35分钟，离屯、所述溶液W获得粒料，并且重新溶解所述粒料在合适的缓冲 液中。也可W使用本领域技术人员已知的制备乳化蛋白质的溶液的其他方法。
[0030] 术语"蛋白质，其中所述蛋白质的一部分具有多酪氧化酶的活性"设及从如上所述 的特定植物提取的蛋白质，其中多酪氧化酶的活性存在是由于多酪氧化酶(PP0)的存在。 PP0是包括存在于植物、动物和真菌中的酪氨酸酶和儿茶酪氧化酶的广泛分布的一组酶。 PP0具有双核铜中屯、，并催化分子氧向苯酪中的已有径基的邻位插入W得到邻二酪W及其 进一步氧化成酿。所得的酿将容易与亲核试剂(诸如某些氨基酸和酪类等结构）反应。可W 通过分光光度法在来自植物的蛋白质提取物中测定植物材料中的PP0活性。因此蛋白质提 取物可W如上所述获得并且可W随后是使用例如脱盐柱或如上所述蛋白质沉淀的蛋白质 纯化步骤。然后可W用分光光度计使用诸如4-甲基儿茶酪的基质在缓冲液中测定活性。每 单位时间吸光度的增加被测量用于在蛋白质提取物中的多酪氧化酶活性，并被报道为酶活 性的光密度或单位的变化(也参见Van Ranst等人W和Van Ranst等人W)。测量PP0活性的 详细非限制性方法将在实施例中进一步说明。还可W使用本领域技术人员已知的测量PP0 活性的其他方法。
[0031] 术语"将所述亲脂性营养物加入至所述乳化蛋白质的溶液并且将所述亲脂性营养 物在所述蛋白质溶液中乳化，W获得稳定的水包油乳液"基本设及在现有技术中已知的任 何获得稳定的水包油乳液的方法。例如，可W将适当量例如20克亲脂性营养物加入至每升 上述植物提取物中，并且可W使用诸如高速UUraturra/的均化器均化，如在实施例部分 中所描述的。可W随后使运样得到的乳液通过微流化床(约5次）W生成具有小液滴尺寸的 稳定乳液。均匀化的乳液的处理可W在约l.SMPaW下的压缩空气压力W及在如实施例部分 描述的冷却条件下进行。也可W使用本领域技术人员已知的其他乳化方法，W及诸如在将 所述亲脂性营养物在所述蛋白质溶液中乳化之前将所述二酪加入至乳化蛋白质的溶液。
[0032] 在所述水包油乳液中的液滴尺寸在某些情况下小于或等于化m(即2、1、0.5、 0.1...或更少皿)。然而，也可W得到更大的液滴尺寸(例如约10皿），只要该乳液是稳定的！ 所述稳定乳液的粒度分布可W使用配备有300RF透镜的Masters izer (Malvern Instruments)或者使用任何其他方法或装置进行检查。可W将样品加入至分散单元，直至 达到10至15%的遮蔽水平并且可W使用多分散模型分析数据。液滴尺寸用W皿为单位的表 面或体积加权平均直径来表征。
[0033] 术语"在分子氧的存在下将一定量的二酪加入所述乳液"是指加入任何(例如蒸馈 水中的）二酪溶液，其在氧的存在下加入至所述乳液，从而经由在室溫下振摇乳液混合物约 24小时，引起蛋白质-苯酪络合和/或W达到约9/1的乳液/二酪溶液的浓度。乳液可W具有 约20mM二酪的最终浓度。后面的二酪可W是合成二酪如4-甲基儿茶酪、咖啡酸、绿原酸或任 何其他二酪。
[0034] 如前面提到的，本发明设及W下令人惊讶的发现:在来自植物的蛋白质提取物中 测定的PP0活性和瘤胃保护程度之间不存在相关性。因此，除了由Van Ranst等人建议W的 红Ξ叶草提取物，只有来自植物或植物部分的特定选择的提取可W用于针对间接保护亲脂 性营养物。植物或其部位的特定选择诸如但不限于根、块茎、叶、茎、花、皮、果实、果核、豆 芙、组织、果渣...，具体设及W下物种：马铃馨（Solanum tuberosum 1^.)(±豆），番茄 (Solanum lycopersicum L.)(西红柿），洋劑（Cynara scolymus L.)(朝鲜劑），渡菜 (Spinacia oleracea L)(渡菜）和芸苔属(Brassica)物种（十字花科蔬菜，白菜或芥菜)诸 如甘蓝(Brassica oleracea L.K花挪菜，西兰花，球芽甘蓝，白菜...）。术语"物种"包含比 种更低的任何分类级别，诸如所述物种的任一种的如亚种、品种、栽培品种等。
[0035] 因此，本发明进一步设及上述方法，其中所述植物或其部分是马铃馨块茎的皮，番 茄植物的茎和/或叶，花挪菜的茎、叶和小花W及渡菜的叶。
[0036] 本发明还设及上述方法，其中所述亲脂性营养物是油或脂溶性维生素。
[0037] 更具体地，本发明设及上述方法，其中所述油是包含多不饱和脂肪酸的油，或者其 中所述维生素是维生素 A、维生素 D或维生素 E，和/或，其中所述包含多不饱和脂肪酸的油是 亚麻子油、鱼油或包含含有共辆亚油酸的甘油醋的油。
[003引本发明还设及上述方法，其中所述二酪是4-甲基儿茶酪。
[0039] 本发明还具体地设及上述方法，其中所述水包油乳液是稳定。乳化稳定性是指乳 液的抵抗其性质随时间变化的能力。当液滴的尺寸（即，例如2至ΙΟμπι)不显著随时间变化 时，乳液是稳定的，。乳液中有四种类型的不稳定:絮凝、乳油化、聚结和奥斯特瓦尔德熟化。 当液滴之间存在吸引力时发生絮凝，所W其形成絮凝物，像葡萄束。当液滴相互撞击结合W 形成更大的液滴时发生聚结，因此滴的平均尺寸随着时间推移液而增加。乳液也可经历乳 油化，其中在浮力的影响下或者当使用离屯、机时在离屯、力的影响下，液滴上升到乳液顶部。
[0040] 虽然所加入二酪的量将取决于在水包油乳液中液滴的尺寸和/或油的量，但本发 明还设及上述方法，其中所述二酪的量为最少0.25mmol/m2所述水包油乳液内所述液滴的 界面表面积。
[0041] 本发明设及针对瘤胃降解保护亲脂性营养物的方法。针对瘤胃生物氨化保护的评 估可W通过W下方式进行:体外分批溫育，W评估对多不饱和脂肪酸(PUFA)的保护。因此， 可W在溫育烧瓶中厌氧条件下加入上述乳液、作为细菌的基质的例如干草、缓冲溶液和从 例如瘤胃造擾的（fis化lated)羊收集的瘤胃液。溫育遵从在约39°C下约24小时期间内的间 歇摇动，W便允许微生物活性和因此生物氨化。生物氨化的脂肪酸的量可W利用气相色谱 法或任何其他方法来分析并计算，例如在实施例部分所显示的。
[0042] 针对瘤胃生物氨化的保护评估也可在体内进行。例如，本发明的乳液可W施用于 瘤胃动物如牛或羊。例如，后面的乳液可W包括马铃馨块茎皮保护的（如上所述)含有反- 10，顺-12共辆亚油酸(CLA)和顺-9，反-11共辆亚油酸的混合物的可商购的甘油醋。即使当 W5至lOg/d的有限剂量施用时，反-10,顺-12共辆亚油酸也是乳脂合成的强效抑制剂，但只 有当其转移到乳腺时才是，而运需要在小肠中的吸附和针对瘤胃生物氨化的保护。因此，监 测简单的特性(乳脂含量)提供了瘤胃保护、后瘤胃吸附和向乳腺的转移的证据。
[0043] 此外，本发明设及上述方法，用于针对在所述营养物储存期间由于氧化或其他方 式的降解保护亲脂性营养物。氧化程度是可W通过例如使用丙二醒(MDA)测量和通过例如 固相微萃取气相色谱/质谱法（SPME-GC/MS)的挥发性组分的测量来测量，如例如通过所 述W或通过技术人员公知的任何其他方法。维生素 E的降解程度可W例如通过如实施例10 中所述的维生素 E的HPLC分析测定。
[0044] 因此本发明设及包括PP0、提取自特定的植物组织的蛋白质提取物的作为乳化剂 的用途，并且需要存在于该提取物中的蛋白质的快速吸附在亲脂性营养液滴的表面并将该 表面完全覆盖。后者特别要求PP0在油水界面的存在。如果不存在，在油水界面上PP0引起的 二酪向酿的转化W及蛋白质-苯酪胶囊的形成受到阻碍并且亲脂性营养物将几乎得不到针 对瘤胃降解如生物氨化的保护。为了获得pro在油水界面的最大吸附，PP0和其他乳化剂(如 其他蛋白质)之间的竞争应该尽可能低。有效的吸附需要蛋白质的一些解折叠，运通常不是 蛋白质的天然状态。然而，在吸附状态下酶活性的保留意味着对蛋白质天然结构的最小修 改。在吸附后经历非常小的构造结构上的变化的运样的（主要是球形）蛋白质在文献中通常 被称为"硬"蛋白质。与"软蛋白质"相反，前者在原生状态下表现出很小的构象灵活性，并且 通过分子间物理和共价键牢牢地结合在一起。在不同来源的蛋白质提取物中测定的PP0活 性和针对瘤胃降解/生物氨化的保护程度之间没有相关性，运可能与蛋白质结构差异和/或 蛋白质吸附时解折叠的程度有关。事实上，在本发明的范围内，除了其将二酪氧化为酿的能 力，PP0的乳化能力可能是同等重要的。后者乳化能力因此不应该在与其他"硬蛋白质"竞 争，并且当考虑通过将乳化蛋白质加入至存在于植物提取物中的蛋白质来增加乳化能力W 获得液滴尺寸的减小时，乳化能力是重要的。在运方面，本发明设及W下令人惊讶的发现： 为进一步稳定乳液不应加入酪蛋白，其是在哺乳动物乳汁中常见的一族有关的憐蛋白质。
[0045] 本发明因此还设及W上方法，其中不应用酪蛋白或当吸附在油水界面时与多酪氧 化酶竞争的任何其他蛋白质(诸如"硬"蛋白质)补充所述乳化蛋白质的溶液。"硬"蛋白质的 实例为β-乳球蛋白质、牛血清白蛋白质和球蛋白质...。"软蛋白质"的实例为酪蛋白。
[0046] 本发明还设及乳液，其包含通过上述任何方法可获得的二酪保护的亲脂性营养 物。后面的乳液可W最好通过其制造方法进行表征。因此后面的乳液包含溶剂，其中存在特 定尺寸的液滴(如上所述），并且其中所述液滴是由被酪络合蛋白质胶囊包围的亲脂性营养 物制成的，并且其中所述蛋白质包含ΡΡ0、植物蛋白质W及任选地补充的非竞争"硬"蛋白 质。
[0047] 此外，本发明设及饲料，其包含如上所述的任何乳液。术语"饲料"是指提供给反当 动物的食物，其包括但不仅限于压缩和颗粒化的饲料、油和乳液，其包含根据本发明的被包 封和保护的亲脂性营养物等组分。
[0048] 本发明因此还设及如上所述乳液或如上所述的饲料的用途，当与未喂食如上所述 乳液或饲料的动物中得到的量相比时，增加反当动物产品中的亲脂性营养物的总量。
[0049] 现在将通过W下非限制性实施例来说明本发明。 实施例
[00加]实施例la
[0051]使用来自五种不同的植物来源的富含PP0的蛋白质提取物W及四种不同浓度的4- 甲基儿茶酪作为二酪剂的水包亚麻巧油乳液针对瘤胃降解体外保护
[0化。材料和方法
[0053] 执行一个Ξ步骤工艺:第一，将蛋白质从植物源提取;第二，使用运种蛋白质提取 物将富PUFA的油乳化；W及第Ξ，通过加入所合成的二酪引起蛋白质-苯酪络合物的生成： 首先，对于蛋白质提取物，分别采用不同的植物来源：红Ξ叶草（红车轴草（Trifolium pratense L.CV.Lemmon))、马铃馨块茎皮（马铃馨（Solanum tuberosum L.))、苹果(澳洲青 苹（Malus domestica Mill CV.Granny Smith))、香蕉果肉（小果野蕉（Musa acuminate Colla)AAA组栽培品种Grand 化in(AAA group cv Grand 化in))W及茄子（茄子（Solanum melongena L.))。植物材料是从田地里采摘的，或者当采不到时就在本地杂货店里购买。在 收获或切成小块后将材料在-80°C下立即冷冻。总之，将约150g冷冻植物材料、含有30mM抗 坏血酸(抑=7.0)的500ml 0.1M憐酸缓冲液、0.5g Triton X-100和Ig聚乙締基化咯烧酬在 共混机中充分混合Imin。过滤和离屯、（10000 X g，15min，4°C)后，将丙酬加入到上清液中，直 至化00ml丙酬/升总体积的浓度，并在-18°C下保持35分钟。离屯、（5000 X g，5min，4°C )后，将 粒料重新溶解于不含抗坏血酸的400ml lOmM憐酸盐缓冲液(pH=7.0)。将此浓缩的蛋白质 提取物用于测量PP0活性和蛋白质含量，如Van Ranst等人所述W。为确定PP0活性，在加入 4-甲基儿茶酪20、30、40秒之后，在400皿处测定吸光度(A) dPPO活性表示为Δ A/min/mg蛋白 质。将化lin-Ciocalteau试剂加入到具有铜和化K酒石酸盐的蛋白质提取物中，并在750nm 处测定吸光度来确定蛋白质的含量，将其表示为g蛋白质/升提取物。第二，将含有PP0的该 浓缩的蛋白质提取物用于乳化亚麻巧油（富含亚油酸(C18:2n-6)和α-亚麻酸(C18:3n-3))。 用高速叫traturrax(T25 Basicjka Werke，诗道芬，德国）生成粗乳液，每升蛋白质提取物 含20克亚麻巧油，其被放入微流化床器(microf luidizer) (Ml 10S，微流体公司，牛顿市，马 萨诸塞州，美国）并且通过5次W生成具有小液滴尺寸的稳定乳液。将超速分散的 (叫化aturraxed)乳液在1.8MPa压缩空气的气压下进行处理，其对应于25M化的液体压力。 在处理期间，使乳液通过浸入冰水浴的热交换器盘管从而冷却。粒度分布是在制备后立即 使用配有300RF透镜的Mastersizer S(马尔文仪器，马尔文，英国）检测的。使用了自动化样 品分散单元MS-17(马尔文仪器，马尔文，英国）。将样品加入到分散单元，直到达到10%至 15%的遮蔽水平为止。使用多分散模型对数据进行分析。由此，油的实折射率固定为 1.5295,而虚折射率被假定为0.1000。液滴尺寸是使用可用的软件(马尔文仪器，马尔文，英 国）W体积加权平均直径(d43) iSauter表面加权平均直径(d32)，平均体积加权分布值D[v， 0.5]W及90%百分点的体积加权分布D[v，0.9]表征的。比表面积（WmVg油计）是基于 930kg/m3的假定油密度P从Sauter平均直径计算得到的：SSA = 6/d32/p。最后，为了造成蛋白 质-苯酪络合，将10% (v/v)的蒸馈水中4-甲基儿茶酪溶液加入到乳液中，W达到9/1乳液/ 二酪溶液的浓度。测试乳液具有0、12.5、25或50mM 4-甲基儿茶酪的最终浓度。将乳液混合 物在室溫下振摇24小时，W允许PK)活性。将受保护的乳液储存在冰箱中直到进一步分析。
[0054] 进行体外分批次溫育W评估对各种乳液中的PUFA针对瘤胃生物氨化的保护。因 此，将1ml乳液、250mg干草、20ml缓冲溶液(每升蒸馈水含有3.58g Na2册化· 12出0，1.55g K此P〇4,0.124g MgCb.細2〇,8.74g 化肥〇3和Ig NH4HC03)W及5ml瘤胃流体加入到 125-ml 溫育瓶中。瘤胃液体是在早晨喂食前从Ξ只瘤胃造擾的羊中收集的，运些羊分别自由采食 干草，可W自由饮水。羊造擾术是由比利时的农业和渔业研究所（ILV0)的伦理委员会批准 的化C 2009,114)。将来自Ξ只羊的瘤胃内容物合并，并通过1mm孔径的筛子在39°C下连续 的C〇2冲洗下过滤。将溫育瓶用C〇2彻底冲洗w获得厌氧条件并且使用分批培养溫育箱 化dmund B恤ler GMBH，赫辛根，德国）在39°C下间断振摇溫育2地。体外瘤胃溫育2地后，烧 瓶从溫育箱中取出，并放置在冰水中，W停止微生物活性。在气体分析之后，测定pH 化anna Ins化uments，特姆塞，比利时）并将培养内容物取样用于挥发性脂肪酸(VFA)分析 。<11>未示出pH、气体和VFA的结果，是因为不同的实验处理和对照处理之间没有观察到差 异，运表明生物氨化的程度的变化不是由微生物活性的变化造成的。为了长链脂肪酸分析 (FA)，取5ml溫育液并冷冻干燥。每个处理将溫育重复Ξ次。
[0055] 通过碱催化接着酸催化的步骤将冷冻干燥的培养内含物的脂肪酸甲基化。加入含 有0.2mg/ml十Ξ烧酸（Sigma，迪更，比利时）的甲苯（2ml)作为内标。使用Multi-tube Vortex(VX-2500，VWR International,鲁议，比利时）将提取试管彻底满旋（vortex),随后 加入甲醇氨氧化钢(2ml，0.5MNa0田容于甲醇）。将试管满旋，在70°C下热水浴溫育化，并在冰 浴中再次冷却5min。在加入通过将10ml乙酷氯溶解在50ml冰冷的甲醇中制备的甲醇盐酸 (3ml)后，将试管满旋并在50°C下在空气烘箱中溫育30min。在冰浴中冷却5min，将己烧 (3ml)和用化肥化饱和的水溶液(4ml)加入，满旋并离屯、（5min，1111 X g)。将含有甲基化的 脂肪酸的上清液使用化steur吸管取出，并用含有玻璃棉、硅胶和活性煤、用己烧预洗涂过 的柱过滤。将过滤的溶剂使用化蒸发，再溶解在己烧（1ml)中，并转移到GC小瓶中随后使用 气相色谱分析。使用惠普6890气相色谱仪（惠普，布鲁塞尔，比利时）用溶胶凝胶-蜡柱(30m X 0.25mm X 0.25皿;SGE Anal}ftical Science,维多利亚州，澳大利亚），对脂肪酸进行了 分析。升溫程序如下：150°C，2分钟；3°C/分钟增加至250°C ;注射器溫度:250°C ;检测器溫度 280°C。对于该升溫程序，注射化L，其中分流/不分流比为50:1。基于它们的保留时间，相较 于外部标准（BR2和BR3，La;rodan Fine 化emicals AB，马尔默，瑞典；Supelco37，Supelco Anal^ical，宾夕法尼亚州，美国；PUFA-3，Matreya UX，喜峡，宾夕法尼亚，美国），鉴定脂 肪酸的峰。C18: 3n-3的体外瘤胃生物氨化计算为[(18:3在总C18FA中的比例)0h-( 18:3在总 C18FA中的比例)24h]/(18:3在总C18FA中的比例)〇h。
[0056] 缉里
[0057] 在表1中列出了PP0活性，表示为加入二酪基质后20s和40s之间吸光度的增加 （Δ A/min/mg蛋白质）。马铃馨块茎果皮与红Ξ叶草相比表现出对4-甲基儿茶酪类似的PP0活 性。苹果和茄子也显示活性，但活性较小。图1中表示了未添加二酪或4-甲基儿茶酪（12.5， 25，50mM)不同的PP0源乳液的体外瘤胃生物氨化。当没有二酪加入到该乳液时，观察到80到 90%的正常生物氨化值。4-甲基儿茶酪量的增加大幅度减少了C18:化-3的生物氨化。马铃 馨块茎皮提取物和红Ξ叶草一样导致相似的减少，但是，得到生物氨化的降低需要更少的 4-甲基儿茶酪的量。苹果提取物在较高的4-甲基儿茶酪浓度下也可W得到生物氨化的减 少，但是比红Ξ叶草或马铃馨块茎皮的强度低。值得注意的是，茄子提取物没有得到生物氨 化的减少，因此发现pro活性和生物氨化减少之间没有相关性。
[0058] 表1:使用来自5种不同的植物来源的蛋白质提取物制备的2% (w/v)的水包亚麻巧 油乳液的蛋白质和乳液的特征，其用于在体外针对瘤胃生物氨化进行保护。运些乳液用或 不用具有不同浓度的4-甲基儿茶酪处理W生成蛋白质结合的苯酪络合物从而获得瘤胃通 过产物
[0化9]
[0060] 0[4,3]，体积加权平均直径;0[3,2]，表面加权平均直径;0[乂，0.5]，50%中值体积 分布直径，运意味着50%的样本显示液滴的直径是所提到的值W下;D[v，0.9] ,90%体积分 布直径，运意味着90%的样本显示液滴的直径在所提到的值W下;SSA，比表面积(mVg油） [OOW] 实施例化
[0062]使用来自20种不同的植物来源的富含PP0的蛋白质提取物W及四种不同浓度的4- 甲基儿茶酪作为二酪剂的水包亚麻巧油乳液针对瘤胃降解体外保护 [006；3] 材料和方法
[0064] 乳液的制备和计算是与实施例1的情况可比的。再次执行一个Ξ步骤工艺，其中将 油使用蛋白质提取物乳化，随后加入所合成的二酪W生成蛋白质-苯酪络合物从而获得保 护。对20种不同的原料进行筛查试验:马铃馨块茎皮(马铃馨(Solanum tuberosum L.))，渡 萝皮和果肉（渡萝（Ananas comosus化.）Me;r;r .))，苹果皮（苹果栽培品种Jonagold或 Jonagored(Malus domestica Mill cv.Jonagold or Jonagored))，苹果果渣（苹果栽培品 种Jonagold(Malus domestica Mill cv.Jonagold)或不同栽培品种的混合物）此处 Jonagold处理是无氧压棒之后获得的，朝鲜劑（洋劑（切nara scolymus L.))，香蕉皮（小果 野蕉（Musa acuminnate Colla)AAA组栽培品种Grand 化in(AAA group CV Grand Nain))， 花挪菜的叶、小花、芽废弃物（=茎和叶）（花挪菜（1^"日331。3〇1日拘。日日1.(30醇日1'.13〇1：巧1：13 va;r.bot;rytis))，花挪菜的芽废弃物（花挪菜（BrassicaoleraceaL.conva;r.Bo1:rパis var. cymosa))，北海邮（邮（Crangon crangon L.))，无氧压棒获得的梨果渣（梨（Pyrus communis L.cv Conference))，番茄叶和茎（番茄（Solanum lycopersicum L.))，渡菜叶 (渡菜（Spinacia oleracea L.))，比利时菊宦根皮（peel)和根皮层（cortex)(菊宦 (Cichorium intybus L.))和胡萝h皮（胡萝K〇au州s ca;ro1:a subsp sativus化offm.)Sch ubl&G.Ma;rtens))。
[0065] 蛋白质提取物用于测量PPO活性和蛋白质含量。为了确定PPO活性，在400皿测试加 入4-甲基儿茶酪10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60秒后的吸光度，如￥曰111?曰1131等人所 述(8)。通过测定在具有最高R2值的线性区域的斜率计算PP0活性，并表示为nkatal/mg蛋白 质，由此使用标准酿系列来计算转换因子W表示nkatal中吸光度的增加/分钟。将化lin- Ciocalteau试剂加入到该蛋白质提取物的具有或不具有铜的NaK酒石酸盐，并且在750nm处 测量吸光度W确定该蛋白质和蛋白质结合苯酪含量，分别表示为g/升提取物和mg酪氨酸当 量/mg蛋白质，如由溫特斯等人所述。重复进行Ξ次测试。
[0066] 最后，为了造成蛋白质-苯酪络合，将10% (v/v)的蒸馈水中4-甲基儿茶酪溶液加 入到乳液中，W达到9/1乳液/二酪溶液的浓度。测试乳液具有为0、10、20或40mM 4-甲基儿 茶酪的最终浓度。将乳液混合物在室溫下振摇24小时，W允许PP0的活性，随后储存在冰箱 中，并随后溫育W测试针对瘤胃生物氨化的保护。
[0067] (：18:311-3的保护效率计算为[(18:311-3的生物氨化)未概户-(18:311-3的生物氨 化)概谢]]/ (18: 3n-3的生物氨化)规户。
[006引缉里
[0069] 蛋白质提取物和所测试的乳液的乳液特征示于表2。在提取物中蛋白质浓度最高 的为马铃馨块茎皮和北海邮，其他植物蛋白质源表现出低得多的蛋白质浓度。在提取物中 蛋白质结合苯酪含量特别高的是洋劑，反映在蛋白质提取过程中的高络合活性，与所有其 他其中蛋白质结合的苯酪浓度普遍较低的蛋白质来源相反。PP0活性表示为nkatal/mg蛋白 质，在加入4-甲基儿茶酪作为二酪基质之后，其中最高的是洋劑、番茄植物材料、梨果肉和 马铃馨块茎皮。苹果提取物表现出中等的PP0活性，而相比之下，所有其他蛋白质来源则呈 现对4-甲基儿茶酪低至几乎没有PK)活性。乳液特征表明，发现通常小的液滴尺寸具有提高 的蛋白质提取物中的蛋白质含量。
[0070] 表3中列出在乳液中溫育24小时后C18:化-3的生物氨化百分比。在生物氨化和4- 甲基儿茶酪浓度之间观察到明显的趋势:在水包亚麻巧油乳液中施加4-甲基儿茶酪浓度的 增加导致较小的生物氨化值。基质浓度的增加最初反映为生物氨化的睹峭下降，但是，一旦 生物氨化达到低水平，施加高浓度的二酪也观察不到进一步的影响。图2示出了对于最高施 加酪浓度(40mM 4-甲基儿茶酪)针对生物氨化的保护的百分数。从该图很清楚发现具有最 高保护潜能的为花挪菜小花和叶、渡菜叶和马铃馨块茎皮。西兰花和花挪菜废物（=叶和 茎），洋劑和番茄植物废物（=叶和茎)材料显示中等保护值，但所有其他的蛋白质源导致低 于10 %的保护水平。
[0071] 值得注意的是，在提取物的PP0活性和针对生物氨化保护的伴随水平之间发现没 有直接的联系。运是一个惊人的结果，因为假说一直是高PP0活性是获得高级别保护的先决 条件。运在花挪菜和渡菜上体现的最好，其导致高水平的保护，但显示低PK)活性。其他蛋白 质来源，如胡萝h和比利时菊宦根，显示与花挪菜和渡菜类似的PP0活性，但是几乎没有引起 任何保护。可能认为PP0在提取物中存在对获得保护是必要的，但在PP0活性或不同蛋白质 来源的蛋白质水平与针对瘤胃生物氨化的保护水平之间没有联系。
[0072] 表2:使用来自20种不同的植物来源的蛋白质提取物制备的2 % (w/v)的水包亚麻 巧油乳液的蛋白质和乳液的特征，其用于在体外针对抗瘤胃生物氨化进行保护。运些乳液 用或不用具有不同浓度的4-甲基儿茶酪处理W生成蛋白质结合的苯酪络合物从而获得瘤 胃通过产物
[0073]
[0074]
[00巧]0[4,3]，体积加权平均直径;0[3,2]，表面加权平均直径;0[乂，0.5]，50%中值体积 分布直径，运意味着50%的样本显示液滴的直径是所提到的值W下;D[v，0.9] ,90%体积分 布直径，运意味着90%的样本显示液滴的直径在所提到的值W下；SSA，比表面积(mVg油）； N.A.，无法提供
[0076] 表3:使用来自不同来源的蛋白质提取物在不同浓度4-甲基儿茶酪（0、10、20或 40mM)作为二酪剂的水包亚麻巧油乳液在体外溫育24小时后C18:化-3的瘤胃生物氨化（％ ) (N=3)
[0077]
[007引
[0079] SD，标准偏差；％生物氨化（BH)是由下列公式计算的：％BH=100*[(C18:3)oh- ((：18:3)2化）]/((：18:3)化其中(：18:3为溫育前（0小时）或溫育后（24小时）测得的(：18:3占总 C18脂肪酸的比率
[0080] 实施例2
[0081] 使用来自20种不同的植物来源的富含PPO的蛋白质提取物W及四种不同浓度的4- 甲基儿茶酪作为二酪剂的水包亚麻巧油乳液针对瘤胃降解体外保护，其中加入额外的酪蛋 白作为乳化剂
[00剧材料和方法
[0083] 乳液的制备和计算是与实施例1的情况可比的。进行组合设置，W评估油浓度、额 外的酪蛋白加入和不同二酪基质浓度的组合效果。使用4x3x4因子设计来测试4种浓度的油 (10、20、30和40g亚麻巧油/升红Ξ叶草蛋白质提取物），3种蛋白质浓度(0、1或2g额外酪蛋 白酸水解产物/升乳液）^及4种二酪浓度（^获得具有0、12.5、25或5〇11114-甲基儿茶酪的 最终浓度的测试乳液）dC18 :化-3的保护效率计算为[(18: 3n-3的生物氨化)漸涨-(18:化-3 的生物氨化)側彻]/(18:化-3的生物氨化)漸期户。
[0084] 使用SAS(SAS Ente;rp;rise Guide 5.1，SAS Institute Inc.，卡里，北卡罗来纳 少H，美国）的MIX抓程序进行了结果分析，使用SAS的化IN程序完成非线性回归。在统计分析 之前，求出技术重复的平均值。因此，设计没有允许所有相互作用的评估，但确实允许评估 相互作用的所有(n-1)方式(way)(测试的因子数为η)。因此，使用下面的模型:Yij=y+0i+ 門+Dk+0i X門+0i X Dk+門X Dk+ε i j，其中Oi为油浓度的影响（i = 10、20、30或40g/升红Ξ叶 草蛋白质提取物），門额外蛋白质的影响（j = 〇、l或2g额外酪蛋白/升乳液），Dk为乳液中二 酪浓度的影响化=0、12.5、25或5011^4-甲基儿茶酪）。所有提及的差异指定在0.05显著性 水平并使用化k巧多重比较测试评价最小二乘法之间的差异。
[0085] 缉里
[0086] 图3给出了结果的概述。乳液中加入4-甲基儿茶酪导致瘤胃溫育24小时后C18:^- 3的生物氨化的降低，其中4-甲基儿茶酪的浓度的增加导致生物氨化的进一步降低（p< 0.001)。当在水包油乳化液中包含更多油时，PUFA被更广泛地氨化(p<0.001)。值得注意的 是，伴随更高的油浓度的此生物氨化的增加是在每个水平的4-甲基儿茶酪中出现的（p< 0.001)，但是在中等的二酪浓度出现生物氨化的最大显著差异。保护更高量的油显得更困 难，因为为了获得降低生物氨化和伴随增加的保护效率，需要更大量的4-甲基儿茶酪。而出 乎意料的是，对于酪蛋白（P<〇.001)也出现生物氨化的差异，与油浓度(P = 〇.372)无关，但 与二酪(p = 0.029)相关。加入Ig酪蛋白/升蛋白质提取物没有导致生物氨化的增加 (p = 0.947 )，然而，当加入2g酪蛋白/升蛋白质提取物时，观察到了与没有酪蛋白或1 g酪蛋白/升 相比虽然小但显著的生物氨化的增加(P<〇.001)。因此，尽管乳液液滴尺寸减少，更多蛋白 质导致更高水平的生物氨化(表4)。增加油浓度导致更大量的生物氨化，与乳液液滴尺寸的 增加和比表面积的减小相联系。对于C18:化-6和C18:化-3分别为0.716和0.795最高保护效 率出现在最低油浓度(lOg油/升)和最高4-甲基儿茶酪浓度(50mM)。
[0087] 建议的是，PP0不得不存在于接近油界面处W诱导交联。从运个角度可W解释保护 效率通过加入酪蛋白而减少。事实上，运一观察与最初预期的是相反的，因为添加酪蛋白从 而提供足够的乳化剂来得到足够小的液滴尺寸从而获得稳定的乳液。当乳液通过微流化床 器时，乳化液滴尺寸减小，导致水包油表面积增加。显然，运种较大的表面积需要更多的乳 化剂，运意味着不得不从连续相抽出更多的蛋白质并且并入乳液的界面。事实上，在具有更 大的脂肪含量且因此具有增加的比表面积的乳制品乳液中，报道了所吸附的蛋白质的分数 的增加然而，无序的"软"蛋白质如酪蛋白，比球状"硬"蛋白质趋向于更容易地吸附到 乳液界面，因为运些蛋白质更快解折叠，导致界面张力的更快降低。在红Ξ叶草提取物 中的酶如PPO与其他蛋白质是典型的球状蛋白质。当红Ξ叶草"硬"球状蛋白质和如酪蛋白 的"软"蛋白质同时存在时，由于竞争吸附，酪蛋白与PPO相比可更高的程度并入界面 。<14>因此，酪蛋白对保护效率的运种负面影响上可W表明为了形成保护，PPO实际上不得不 存在于油界面上。
[0088] 此外，不仅二酪和PP0的存在对于针对生物氨化进行保护是重要的，而且二酪的量 也发挥作用，其中更大的二酪的量产生更好的瘤胃保护。运可能是由于在界面上形成了更 致密的苯酪交联蛋白质层，导致更好地保护的乳液。所需的二酪的量很可能取决于乳液的 总界面面积，运反映为比表面积(表4)。实际上，可能是因为二酪的短缺，看来针对生物氨化 保护更高量的油更加困难（图3)。因此，在图4中，在乳液中二酪基质的量/单位乳液界面面 积(mmol 4-甲基儿茶酪/V)与保护效率数据相关。实验数据点呈对数增加，一旦每平方米 存在于乳液中的表面积上可在体系中存在的4-MC超过0.25mmol则达到平台。运表明，针对 生物氨化的保护效率可能是通过有效乳液包封导致的，因为保护效率随二酪基质的量/单 位乳液界面面积的增加而增加。
[0089] 表4:使用红Ξ叶草蛋白质提取物制备的水包亚麻巧油乳液的蛋白质和乳液的特 征，其用于在体外针对瘤胃生物氨化进行保护。运些乳液用或不用具有不同浓度的4-甲基 儿茶酪(〇、12.5、25或5〇11^)处理^生成蛋白质结合的苯酪络合物从而获得瘤胃通过产物
[0090]

[0091] CAS，酪蛋白；D [4，3 ]，体积加权平均直径;D[ 3，2 ]，表面加权平均直径;D [ V，ο . 5 ]， 50%中值体积分布直径，运意味着50%的样本显示液滴的直径是所提到的值W下；D[v， 0.9]，90%体积分布直径，运意味着90%的样本显示液滴的直径在所提到的值W下;SSA，比 表面积(mVg油）
[0092] a油乳化的量，Wg/升蛋白质提取物计
[0093] b额外酪蛋白的量，Wg/升蛋白质提取物计，在乳化之前加入到乳液的连续相中
[0094] 实施例3
[00M]使用来自马铃馨块茎皮的富含PPO的蛋白质提取物W及4-甲基儿茶酪作为二酪剂 的水包亚麻巧油乳液针对瘤胃降解体外保护，其中使用或不使用牛血清白蛋白质 [00%] 材料和方法
[0097]为了评估作为附加乳化剂"软"和"硬"的蛋白质之间的区别，在当前实验中使用牛 血清白蛋白质作为"硬"蛋白质的实例。从实施例2的发现，建议"软"蛋白质酪蛋白的加入将 "硬蛋白质"PPO从油-水界面竞争掉(outcompete)，导致在加入4-甲基儿茶酪后生物氨化降 低的减少。将牛血清白蛋白质(BSA)加入到含PP0的蛋白质提取物来制备40.0 mg蛋白质/g油 的10%的水包油乳液(与含有38mg蛋白质/g油的对照相比）。对乳液的液滴尺寸的变化和受 保护的乳液的生物氨化在体外进行了评估。如实施例1中所述制备乳液，不过使用转子/定 子均化(而不是微流化床器)并且乳液含有10%而不是2%的油。
[009引缉里
[0099] BSA的加入显著降低原始乳液的平均液滴尺寸(6对8μπι)，但与对照处理的差异在 保护反应后消失(两种乳液的平均液滴尺寸均为8μπι)。在瘤胃生物氨化的程度上没有观察 到差异，平均保护程度为71%。加入有限量的如牛血清白蛋白质的硬蛋白质没有影响针对 瘤胃生物氨化的保护，运表明相比于例如酪蛋白的"软"蛋白质在"硬"蛋白质的情况下附加 乳化剂的恶化效应是更少的。尽管如此，本实验更重要的发现是，含有10%的油液滴尺寸为 祉m的乳液的保护效率是71%。运在大大高于基于实施例2所期待的结果，其中上的表 面加权平均直径将保护效率降低至35% W下。与实施例2对比，将马铃馨块茎皮代替红Ξ叶 草用作PP0的来源。运支持了 W下令人惊奇的发现:对于针对瘤胃生物氨化保护多不饱和脂 肪酸的命运来说PP0来源的差异性，所述命运与PP0没有关系(在本实施例中22化at/g油，运 与实施例2中测得的活性水平是可比的）。
[0100] 实施例4
[0101] 使用来自红Ξ叶草的富含PP0的蛋白质提取物W及4-甲基儿茶酪作为二酪剂的水 包亚麻巧油乳液针对瘤胃降解体外保护，其中将在不同时间后停止交联反应
[。…。材料和方法
[0103] 为了评估当加入4-甲基儿茶酪(0或15mM)时需要多长时间来针对瘤胃生物氨化保 护乳液，考虑了时间序列。如此前在实施例1中所述生成1.5%(w/v)的乳液。然而，将乳液混 合物在室溫下振摇〇、〇.5、1、2、4、8或24小时，随后加入4-己基间苯二酪(4-己基间苯二酪； 50%的乙醇溶液），并存储在冰箱中，W获得不同的保护水平。此前已经证实4-己基间苯二 酪是PK)的有效抑制剂。乳液具有3ml 4-己基间苯二酪的最终浓度。
[0104]
[0105] 图5所示的新鲜溫育的乳液的结果(表5)清楚地表明，当加入4-甲基儿茶酪和PP0 抑制之间的时间增长时，降低了C18:化-6和C18:化-3的生物氨化。在最初的两小时期间，没 有发现生物氨化的减少，而4h后注意到生物氨化的明显降低。更大的降低出现在8小时和24 小时后，运表明当允许在4-甲基儿茶酪加入后发生更长时间的PPO催化反应时，引起针对BH 更高的保护。
[0106]表5:使用红Ξ叶草蛋白质提取物制备的水包亚麻巧油乳液的蛋白质和乳液的特 征，其用于在体外对抗瘤胃生物氨化。运些乳液用或不用4-甲基儿茶酪（15mM)处理W生成 蛋白质结合的苯酪络合物从而获得瘤胃通过产物 「01071
[010引 0[4,3]，体积加权平均直径;0[3,2]，表面加权平均直径;0[乂，0.5]，50%中值体积 分布直径，运意味着50%的样本显示液滴的直径是所提到的值W下;D[v，0.9] ,90%体积分 布直径，运意味着90%的样本显示液滴的直径在所提到的值W下;SSA，比表面积(m2/g油）
[0109] 实施例5
[0110] 使用来自红Ξ叶草的富含PP0的蛋白质提取物W及4-甲基儿茶酪作为二酪剂的水 包鱼油乳液针对瘤胃降解体外保护
[0111] 材料和方法
[0112] 乳液的制备和计算是与实施例1的情况可比的，但是，在运种情况下使用2% (w/v) 鱼油代替亚麻巧油。此外，加入〇、1或2g/L的酪蛋白作为额外的乳化剂。展示的结果是具有 运Ξ种酪蛋白水平的乳液的平均。由于鱼油特别富含如C20:5n-3和C22:6n-3的长链脂肪 酸，对于C20: 5n-3和C22: 6n-3分别生物氨化计算为：[(C20:5在总C20FA中的比例)0h-(C20:5 在总C20FA中的比例）24h]/(C20:5在总C20FA中的比例）Oh和[(C22:6在总C22FA中的比例）0h- (C22:6在总C22FA中的比例）24h]/(C22:6在总C22FA中的比例）〇h。
[0113] 结果
[0114] 图6中的结果显示，与实施例1类似，加入4-甲基儿茶酪导致C20: 5n-3和C22: 6n-3 的生物氨化降低。酪蛋白作为额外的乳化剂降低乳液的液滴尺寸并伴随更大的比表面积 (表6)。不含4-甲基儿茶酪的乳液的生物氨化值与亚麻巧油乳液相比更低，运对于C20:5n-3 和C22:6n-3在体外是常观察到的，最显着的原因是运些长链PUFA对瘤胃代谢的毒性作用 为了比较的缘故，还使用只有2g酪蛋白/升作为乳化剂制成乳液，所W没有4-甲基儿茶 酪或红Ξ叶草蛋白质提取物，但是运导致了与不含4-甲基儿茶酪具有或不具红Ξ叶草的乳 液相比生物氨化没有差异。运表明，要获得生物氨化的降低，需要含有PP0的红Ξ叶草蛋白 质提取物和作为二酪基质的4-甲基儿茶酪两者。
[0115] 表6:使用红Ξ叶草蛋白质提取物制备的2% (w/v)水包鱼油乳液的蛋白质和乳液 的特征，其用于在体外对抗瘤胃生物氨化。运些乳液用或不用4-甲基儿茶酪(20mM)处理W 生成蛋白质结合的苯酪络合物从而获得瘤胃通过产物
[0116]
[0117] 0[4,3]，体积加权平均直径;0[3,2]，表面加权平均直径;0[乂，0.5]，50%中值体积 分布直径，运意味着50%的样本显示液滴的直径是所提到的值W下;D[v，0.9] ,90%体积分 布直径，运意味着90%的样本显示液滴的直径在所提到的值W下;SSA，比表面积(mVg油） [011引实施例6
[0119] 使用来自红Ξ叶草的富含PP0的蛋白质提取物W及不同来源的二酪剂的水包亚麻 巧油乳液针对瘤胃降解体外保护
[0120] 材料和方法
[0121] 在前面的例子中，使用合成的PP0基质4-甲基儿茶酪。然而，4-甲基儿茶酪是相当 昂贵的，并且更广泛可提供的和天然的基质可W是优选的。由于运些原因，对各种(二)酪类 基质进行筛选。目前，将在农业和食品工业的侧线物流中存在的鉴定的二酪用于筛选试验， 其中PP0活性是用分光光度计监测的。类似地，该测定被施用于筛选食品工业中使用的(二） 酪类添加剂，例如香兰素、乙基香兰素、下香酪、没食子酸丙醋化310)、叔下基氨酿化319)。 还使用其他合成二酪如咖啡酸或绿原酸。选择对PP0表现高亲和力的（二)酪(与4-甲基儿茶 酪相比)并且体外评估其产生受保护乳液的潜力，如实施例1中所述。
[0122] 实施例7
[0123] 使用来自红Ξ叶草的富含PP0的蛋白质提取物W及4-甲基儿茶酪作为二酪剂的水 包亚麻巧油乳液针对瘤胃降解体外保护，其中移除乳液的连续相
[0124] 材料和方法
[0125] 乳液的制备和计算是与实施例1的情况可比的:再次使用红Ξ叶草蛋白质制备2% (w/v)水包亚麻巧油乳液，并将4-甲基儿茶酪(0，12.5，25或50mM)加入其中W生成针对瘤胃 降解的保护。溫育前，将乳液胆存在冰箱中或洗涂:该假说是保护是在乳液的界面产生的， 使得脂肪酸在受保护的核屯、内使得瘤胃微生物和酶不能进入从而不被降解，但是，不能排 除连续相对保护的影响。酿不仅可W在界面产生，而且酿和所得聚合物还可W在连续相中 形成，因为不是所有的蛋白质(包括PP0)都是吸附在油-水界面上。因此，在加入4-甲基儿茶 酪生成保护之后，通过离屯、除去连续相，将保留的剩余液滴取出并且通过剧烈摇动重新溶 在水中（基于此，我们称之为"洗涂过的乳液"）。运个过程被执行两次，W确保除去连续相中 几乎所有的酿和聚合物。
[0126]
[0127]图7示出本实施例的结果。在新鲜的和洗涂过的乳液之间没有观察到C18:化-3生 物氨化的差异(对于在亚麻巧油中的C18:化-6和其他主要的PUFA也有类似的结果）。仅加入 最低量的4-甲基儿茶酪已导致生物氨化急剧下降，运意味着观察到针对瘤胃分解的大的保 护。新鲜的和洗涂过的乳液显示出类似的液滴尺寸分布曲线，运意味着再溶解后乳液保持 稳定，并且原始新鲜的与洗涂过的乳液可W相比较(结果未示出）。根据图7"洗涂过的"乳液 在加入4-甲基儿茶酪后示出与原始"新鲜的"乳液类似的生物氨化曲线，运意味着在受保护 的乳液的连续相可W除去而不降低保护效率。因此，"压载""（ballast)连续相可W容易地 通过离屯、分离除去，W得到浓缩的湿产品。证实了 W下假说:除去含有酿和蛋白质-苯酪聚 合物的连续相对保护水平没有影响。运支持了保护发生在油-水界面的假说。
[012引实施例8
[0129]使用来自马铃馨块茎皮的富含PP0的蛋白质提取物W及4-甲基儿茶酪作为二酪剂 的富共辆亚油酸的水包油乳液针对瘤胃降解体内保护 [0。0] 材料和方法
[0131] W顺序使用泌乳中期的八头奶牛(产奶的第100至220天，活重562至712千克，最小 日产奶量20至25公斤）来测试的脂肪酸在体内的保护和向牛奶的转移。测试了两个补充剂 实验:首先，施用根据实施例1制备的受保护的脂肪酸乳液(n = 4)。该产品包括来自马铃馨 块茎皮的蛋白质提取物，将其进一步用于乳化可商购的顺-9,反-11和反-10,顺-12共辆业 油酸的Ξ酷基甘油醋混合物(11 Oc 12-化A) (Tonal in? TG80，BASF-AG，路德维希港，德国）并 通过加入4-甲基儿茶酪产生蛋白质-苯酪络合物从而避免瘤胃降解。如实施例1中所述在体 外进行评估tl0cl2 CLA的瘤胃通过程度，随后开始体内试验。第二，测试含有相同的脂肪酸 的甲醋混合物的市售瘤胃保护的产品作为阳性对照化utrell Combi，BASF-AG，路德维希 港，德国）（n = 4)。母牛接受运两种补充剂中任一个，W每头牛每天7克tl0cl2-CLA的量施 用。
[0132] 所述tl0cl2-CLA是乳脂合成的有效抑制剂^7)，即使剂量限制在每天给药5至lOg， 但只有当将它转移到乳腺才行，而其需要在小肠吸收W及针对瘤胃生物氨化的保护。事实 上，我们组之前的实验使用未受保护的tl0cl2-CLA补充剂(在反-10,顺-12CLA的95%体外 生物氨化，使用在此所述的相同体外步骤<W)，未抑制乳脂的浓度。因此，监测简单的特征， 即牛奶中的脂肪含量，提供了瘤胃保护、瘤胃后吸收和向乳腺转移的总体概念。此外，牛奶 tl0cl2-CLA分泌的记录使得可W计算从饮食到牛奶中的tl0cl2-CLA的传递效率。将后者与 非保护补充剂的转移效率进行比较，可W给出瘤胃保护和肠吸收效率。膳食反-10,顺- 12共辆亚油酸向牛奶的转移效率当施用此未保护补充剂时为1.5% (Fievez等人，未发表的 结果）。与例如富含C18:化-3的补充剂相比，运种脂肪酸补充剂的选择使得奶牛实验中只需 要引入少量就会有显著反应，前者通常需要W10至20倍更高的倍率补充才能得到C18:化-3 富集的牛奶。
[0133] 实验期间包括六个星期。前Ξ周用作适应期，其间母牛适应由自由采食粗饲料 (60%玉米青胆和40%草青胆），豆巧，Covasoy(高百分比的瘤胃保护的蛋白质）和浓缩物组 成的基础饮食满足个性化需求，在整个实验期间饲喂该基础饮食。在第四周，将奶进行取样 作为对照，之后在第五周连续五天为牛提供所测试产品，随后立即在第六周连续五天洗出 (wash-out)。表7中给出了实验周期的概述。乳脂含量是通过傅里叶变换红外分析(FTIR德 尔塔仪器德拉赫滕，荷兰)测定的并且脂肪酸是如化rjong等人所述测定的^9)。乳脂表示为 每天生产牛奶的总质量的百分比并且tl0cl2-CLA为g/100克所测得的脂肪酸。
[0134] 表7:体内实验中不同周间的实验处理概述
[0135]
[0側
[0137] 图8显示了 tl0cl2-CLA在乳脂中的比例结果。对照周取样的牛奶示出非常低可W 忽略不计的tl0cl2-CLA水平。一旦奶牛开始得到含有受保护的tl0cl2-CLA的补充剂，就能 在牛奶中检测出在运个特殊脂肪酸的增加：当供给Lutrell Combi时，浓度增加直至约 0.045g/100克检测的脂肪酸，相比当供给受保护的PK)乳液时，浓度增加直至0.030g/100克 检测的脂肪酸。在我们之前实验中，未保护的tl0cl2-CLA补充剂，导致后面的脂肪酸在牛奶 中浓度为O.OlOg/100克检测的脂肪酸(18)。在目前的实验中，对于Lu化ell Combi观察到与 PP0乳液相比牛奶中tl0cl2-CLA的增加更快。在洗出期间，tl0cl2-CLA的浓度降低到可W忽 略不计。运些结果表明，与受保护的PP0乳液相比，补充Lutrell Combi导致牛奶中tl0cl2- CLA水平更高。然而，与在当前的实验中未补充对照期间的比较W及与补充未保护tl0cl2- 化A补充剂的比较对于Lutrell Combi和PP0产物两者都显示了在乳中tl0cl2-CLA比较明显 的增加。
[0138] 图9中显示了 tl0cl2-CLA向牛奶的转移效率。每天每头牛提供7克膳食tl0cl2- CLA，其中高达5%被转移到牛奶中（图8)。之前已报道了受保护的CLA产品类似的转移效率 (2.9<^、5.7(21)、4.8<22哺9.3< 23>%)。在我们之前的实验中，未保护的110(：12-〇^\补充，导 致1.5%的转移效率(i8)dLu化ell Combi的转移效率表现为一旦补充tl0cl2-化A的转移效 率快速增加，而对于PP0乳液观察到更平缓的增加。在补充周期结束时，PP0乳液的转移效率 为通过Lu化ell Combi获得的那些的65%左右。对于在PP0乳液的情况下延迟增加的可能解 释是PP0产品的不同批次之间的差异，其中在一周开始时提供的批次与一周结束时供给的 批次相比示出较低的体外保护效率(图9底部显示的图）。
[0139] 如de Veth等人建议的(i7)，tl0cl2-CLA是乳脂合成的强效抑制剂，如果运种脂肪 酸足够量被转移到乳腺的话。因此，在补充后的牛奶中tl0cl2-CLA转移效率和浓度的增加 应当反映在乳脂含量上。图10显示了乳脂百分率结果。事实上，一旦补充对于Lutrell Combi和PPO产品都观察到小而显著下降。与图9中呈现的延迟的转移效率相似，与Lu化ell Combi相比，对于PP0产物观察到乳脂百分率延迟的减少。在洗出期间，观察到乳脂百分率平 缓增加至原来的水平。
[0140] 最后，能够确认，对于所要求保护的PP0产物W及阳性对照Lutrell Combi两者，月旨 肪酸针对瘤胃分解、后瘤胃吸收受到保护并转移到乳腺，运是因为观察到乳脂中tl0cl2- CLA浓度的增加，导致乳脂的浓度降低。
[0141] 实施例9
[0142] 使用来自红Ξ叶草的富含PP0的蛋白质提取物W及4-甲基儿茶酪作为二酪剂的水 包亚麻巧油乳液针对胆存期间的氧化进行保护
[01创材料和方法
[0144] 在该实施例中，对具有或不具有红Ξ叶草W及具有或不具有4-甲基儿茶酪的乳液 进行处理，W造成氧化。制备了两种乳液:一方面一种具有红Ξ叶草蛋白质提取物和2mg/ml 酪蛋白（RC+CAS)的乳液W及另一方面一种仅含有2mg/ml酪蛋白（CAS)的乳液。每升乳化Ξ 十g的亚麻巧油。
[0145] 用SPME-GC/MS(固相微萃取-气相色谱/质谱法）测定不饱和脂肪酸的氧化过程中 形成的挥发组分。分析基于Jelena等人所述的方法。W将挥发物使用碳分子筛(carboxen)- 聚二甲基硅氧烷(CAR/PDMS)纤维(85皿厚）（5啡61(3〇,86116的11*6，宾夕法尼亚州，美国）从 乳液的顶空萃取。为此，将3g乳液放入10ml小瓶中，在加热块中在35°C下溫育45分钟。使用 偶接到质量选择检测器(Agilent model 5973，Agilent Technologies,迪更，比利时）的气 相色谱仪(Agilent model 6890N)分析萃取的挥发物。将化合物在HP-5柱(30mX250皿)<化 m，5 %苯基甲基硅氧烷，Agi lent Technologies，迪更，比利时）上进行解析，入口溫度280 °C。氨气流为l.lml/min，升溫程序如下:40°C保持3分钟；W8°C/min升高至280°C。在相同的 条件运行正构烧控来计算化合物的科法兹化ovats)指数化I)值。可W通过将质谱与包含在 NIST05质谱库中的那些图比较，并且通过将KI值与Jelen等人报道的那些值比较来鉴定化 合物。样品分析两遍，并且将所关注的主要挥发性氧化产物结果W任意面积单位 (AAUx1〇6)提供。
[0146] 使用SAS(SAS Ente;rp;rise Guide 5.1，SAS Institute Inc.，卡里，北卡罗来纳 少Η，美国）的MIX抓程序分析所有结果。统计分析之前，将重复实验取平均值。因此，设计没有 允许所有相互作用的评估，但确实允许评估所有(n-1)方式相互作用(其中η为所测试的因 子数）。使用了 W下统计模型:Yi j = y+Pi+D j+Sk+Pi X D j+Sk X D j+ε i j，其中Pi蛋白质的影响 (i =红Ξ叶草提取物，具有额外的酪蛋白（RC+CAS)或仅酪蛋白（CAS))，Dj乳液中二酪浓度 的影响（j = 0或20mM 4-甲基儿茶酪)和Sk储存时间的影响化=1、2、4或6天）。相互作用影响 Pi X Sk被排除在模式外，因为该影响被证明在每种情况下都不显著。所有提及的差异指定 在0.05显著性水平并使用化k巧多重比较测试评价最小二乘法之间的差异。
[0147] ^
[0148] SPME-GC/MS结果给出了形成的氧化产物的详细图像。暴露于氧化条件下1、2、4和6 天后乳液的SPME-GC/MS结果，与在不同存储时间点的平均值一起，示出脂肪氧化的主要最 终产物的详细图像，在表8中给出。一般来说，一旦加入4-MC，RC+CAS乳液中所有的挥发性氧 化产物都明显降低。与只含酪蛋白的乳液相比，具有RC提取物的乳液己醒值均相对更高。观 察到CAS乳液和具有4-MC的CAS乳液之间的2-戊締醒和3，5-辛二締-2-酬有显著差异，运可 能暗示4-MC的抗氧化作用。值得注意的是，只有在后一种情况下，不具有红立叶草提取物 时，检测到3-甲基苯酪。值得注意的是，在含有4-甲基儿茶酪的RC+CAS乳液没有发现该化合 物，但仅在含有4-甲基儿茶酪的乳液中发现。运可能表明，4-甲基儿茶酪在红Ξ叶草乳液消 失，最可能是由于通过PPO造成的蛋白质-苯酪络合物的形成。4-甲基儿茶酪不再W游离形 式呈现运一事实，可能是4-甲基儿茶酪与其他分子如蛋白质结合从而导致降低的氧化的证 据。
[0149] 表8:富含PUFA的乳液中的主要挥发性化合物（表示为任意面积单位*106)，用 SPME-GC/MS测量，通常在50°C下经过1、2、4或6天增力日，但是当加入4-甲基儿茶酪时降低。乳 液是用红Ξ叶草蛋白质提取物和2g/l的酪蛋白（RC+CAS)或仅用2g/l的酪蛋白（CAS)制成 的，存在或不存在20mmol 4-甲基儿茶酪并且含有30g/l的亚麻子油，在25M化下5次通过微 流化床器
[0150]
[0151]
[0152]
[0153] 4-MC，4-甲基儿茶酪;RC，红Ξ叶草;CAS，酪蛋白；SEM，平均值的标准误差;NS，p > 0.10时的非显著
[0154] a，b，e，嗦示列中处理方法之间的差异为p《〇.〇5
[0K5] *如果双方式(two-way)因子二酪X胆储时间不显著，将其从模型中省略
[0156] 实施例10
[0157] 使用来自马铃馨块茎皮的富含PP0的蛋白质提取物W及4-甲基儿茶酪作为二酪剂 的含有α-生育酪的水包油乳液的胆存期间针对摄食前氧化进行保护
[015引材料和方法
[0159] 测试了含有α-生育酪(维生素 Ε)的乳液是否可W在储存期间经受摄食前氧化。因 此，如实施例1所述制备了含有1.8%的具有高浓度的反-10,顺-9-共辆亚油酸作为Ξ酷基 甘油醋(Tonalin? TG80，BASF-AG，路德维希港，德国）的油和0.2%维生素 Ε(Τ3251，（ ± )-α- 生育酪的乳液，Sigma-Aldrich，迪更，比利时）的乳液。所制备的乳液的4-甲基儿茶酪的最 终浓度为0和20mM。为了诱导氧化，将乳液放在摇床在通风烘箱中在50°C下约16h，随后进行 维生素 E分析。结果表示为yg维生素 E/ml乳液。
[0160] 1^
[0161] 结果列于表9中。无论是否存在4-甲基儿茶酪都观察到了维生素 E的降低。然而，如 果4-甲基儿茶酪存在于乳液中，运种减少相当低。同时，在运些乳液中的脂肪酸也针对体外 瘤胃生物氨化受到保护(77.5%的保护效率）。另外，在没有4-甲基儿茶酪的乳液中维生素 E 可W很容易地使用溫和的己烧萃取分离，而当4-甲基儿茶酪存在的情况下就不一样了，指 明维生素 E是确实存在于乳液内（而不是在连续相中，如在不含4-甲基儿茶酪的乳液中那 样）。总之，运表明，维生素 E在用富含PP0马铃馨块茎果皮生成的且用4-甲基儿茶酪处理的 乳液中针对胆存期间摄食前损伤受到保护。
[0162] 表9:对于含有1.8%的Tonalin? TG80油、0.2%的α生育酪和OmM 4-甲基儿茶酪的 乳液(使用马铃馨块茎皮蛋白质提取物制备)在50°C下诱导氧化16小时后观察到α-生育酪 的氧化，但当乳液中存在20mM 4-甲基儿茶酪时氧化减少(η = 2)
[0163]
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【主权项】
1. 一种保护亲脂性营养物免于瘤胃降解的方法，所述方法包括： -制备乳化蛋白质的溶液，其中所述蛋白质的一部分具有多酚氧化酶活性， -将所述亲脂性营养物加入至所述乳化蛋白质的溶液， -将所述亲脂性营养物在所述蛋白质的溶液中乳化，以获得稳定的水包油乳液，以及 -在分子氧的存在下将一定量的二酚加入至所述乳液， 其中所述乳化蛋白质提取自选自以下物种的清单的植物或其部分：马铃薯（Solanum tuberosum)、番前（Solanum lycopersicum)、洋蓟（Cynara scolymus)、菠菜（Spinacia 〇16瓜〇6&)和芸苔属(1^^88；[〇&)物种。2. 根据权利要求1的方法，其中在获得所述稳定的水包油乳液之前将所述二酚加入。3. 根据权利要求1-2的方法，其中所述植物或其部分为马铃薯块茎皮，番茄植物茎和/ 或叶，花椰菜茎、叶和小花以及菠菜叶。4. 根据权利要求1-3的方法，其中所述亲脂性营养物为油或者为脂溶性维生素。5. 根据权利要求4的方法，其中所述油是包含多不饱和脂肪酸的油，或者其中所述维生 素是维生素 A、维生素 D或维生素 E。6. 根据权利要求5的方法，其中所述包含多不饱和脂肪酸的油是亚麻籽油、鱼油或包含 含有共辄亚油酸的甘油酯的油。7. 根据权利要求1-6的方法，其中所述二酚是4-甲基儿茶酚。8. 根据权利要求1-7的方法，其中所述二酚的量最少为0.25mmol/m2在所述水包油乳液 内的液滴的界面表面积。9. 根据权利要求1-8的方法，所述方法保护亲脂性营养物免于由于氧化导致的变质。10. 根据权利要求1-9的方法，其中不应当用酪蛋白或者任何其他当吸附至油水界面时 与多酚氧化酶竞争的蛋白质补充所述乳化蛋白质的溶液。11. 一种乳液，所述乳液包含可根据权利要求1-10的方法获得的由二酚保护的亲脂性 营养物。12. -种饲料，所述饲料包含根据权利要求11的乳液。13. 根据权利要求11的乳液或根据权利要求12的饲料的用途，用于当与未用所述乳液 或饲料喂食的动物中得到的量相比时，增加在反刍动物或反刍动物产品中的亲脂性营养物 的总量。
【文档编号】A23K20/174GK106028830SQ201480075985
【公开日】2016年10月12日
【申请日】2014年12月18日
【发明人】费尔勒·菲耶韦, 弗雷德里克·加德耶涅, 海斯·范兰斯特
【申请人】根特大学