一种花生纳米肽的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，具体的，设及一种花生纳米肤的制备方法。
【背景技术】
[0002] 花生蛋白为制备具有优良生理活性短肤的重要蛋白源，一些花生蛋白酶解产物、 =肤、四肤和六肤等陆续被发现具有较好的ACE抑制活性，但ACE抑制单体肤因为需要经过 高成本、低得率的酶解、纯化工艺，因此实际应用有限。提高酶解效率、充分挖掘花生蛋白中 蕴藏的大量高生理活性短肤，同时适当降低生产成本，提高混合型花生短肤在功能食品中 的应用，成为花生短肤的重要发展方向，而对花生蛋白进行物理改性就是一个具有实际应 用价值的有效方案。
[0003] 动态高压微射流(DHPM)技术是一种新兴的物理处理手段，其工作原理是通过高速 碰撞、高频振荡、瞬时压降、强烈剪切等作用实现对物料的改性，能够实现对物料的改性或 者改变大分子的结构。高压微射流处理目前已经成为提高蛋白质功能性质的一种有效方 法，但采用高压微射流改性蛋白质W有利于短肤制备的研究尚未见报道。
[0004] 因此有必要开发利用高压微射流方法对蛋白质进物理行改性的技术，从而为制备 具有高生物活性的短肤产品提供新的有效的方法。
【发明内容】
[0005] 本发明的目的在于提供一种采用高压微射流处理提高酶解效率制备高ACE抑制活 性花生纳米肤的方法。
[0006] 为达到W上目的，本发明提供了一种花生纳米肤的制备方法，该方法包括W下步 骤：
[0007] 步骤一:将花生蛋白制备成花生分离蛋白；
[000引步骤二:将花生分离蛋白配制成质量体积比浓度为4-6%的花生分离蛋白水溶液， 采用高压微射流在100-135M化压力下循环处理2-4次后干燥，得到物理改性的花生分离蛋 白；
[0009] 步骤将所述物理改性的花生分离蛋白配制成质量体积比浓度为8-10%的水溶 液，加入中性蛋白酶，酶解反应80-11 Omin;得到中间酶解液(即第一次酶解液）；
[0010] 步骤四：在中间酶解液中加入复合蛋白酶，酶解反应80-1 IOmin，得到最终酶解产 物；
[0011] 步骤五:对所得酶解产物进行灭酶处理，离屯、取上清液，取分子量小于化D的滤过 液，干燥后获得纳米肤。所述纳米肤为高ACE抑制活性纳米肤。
[0012] 图1为本发明所述高压微射流处理提高酶解效率制备高ACE抑制活性花生纳米肤 的方法示意图。
[0013] 优选的，所述花生分离蛋白由如下的碱溶酸沉方法制备而成:将花生蛋白粉与去 离子水混合，制备质量体积比浓度为9-11%的花生蛋白溶液，调节抑值至7.8-8.2,揽拌溶 解110-130min; 3800-4200巧m离屯、14-16min;取上清液，调节抑值至4.4-4.6，静置沉淀50-70min; 3800-4200巧m离屯、14-16min;取沉淀，加水溶解，调节抑值至6.8-7.2，揽拌溶解100-140min;喷雾干燥，得花生分离蛋白。
[0014]优选的，在步骤一中，所述花生分离蛋白中蛋白含量大于85%。
[001引其中，可W利用NaOH和肥1进行抑值调节。
[0016] 其中，步骤二中，通过高压微射流处理对花生分离蛋白进行物理改性，通过高压微 射流的高速碰撞、高频振荡、瞬时压降、强烈剪切等作用实现对物料的改性，使蛋白质结构 解聚，W暴露更多的酶切位点，增进酶的作用效率。
[0017] 优选的，在步骤二中；高压微射流的压力为110-125MPa，循环次数为3次。
[0018] 优选的，所述花生分离蛋白水溶液的质量体积比浓度为4-6%。
[0019] 优选的，在步骤一中，所述花生分离蛋白中蛋白含量大于85%。
[0020] 优选的，在步骤S中，中性蛋白酶的添加量为3800-4500U/g底物，酶解时间为90-1 lOmin、酶解溫度为42-48°C。特别优选的，中性蛋白酶的添加量为3900-4000U/g底物，酶解 时间为95-105min、酶解溫度为45°C。
[0021] 优选的，在步骤=中，先将物理改性的花生分离蛋白的水溶液在75-85°C水浴中震 荡保溫8-12min后再利用中性蛋白酶进行酶解。
[0022] 优选的，复合蛋白酶的添加量为300-450U/g底物;酶解时间为90-1 lOmin、酶解溫 度为42-48°C。特别优选的，复合蛋白酶的添加量为350-380U/g底物；酶解时间为95-105min、酶解溫度为45°C。
[0023] 可选的，在步骤五中将所述酶解产物在85-95°C下水浴8-12min灭酶。
[0024] 步骤五中离屯、的目的是为了除去部分未酶解的杂质;超滤采用化D的超滤膜进行， 滤液即为高活性的纳米肤，运主要是根据前期大量的结果发现，小于IKD的肤具有更好的 ACE抑制活性。经测定，小于化D的肤粒径低于lOOnm，因此所获得肤就是纳米肤。
[0025] 本发明还提供了利用上述方法制备的花生纳米肤。
[0026] 本发明还提供了所述的花生纳米肤在制备用于抑制ACE活性的制剂中的应用。所 述制剂为降压食品或药品。
[0027] 有益效果：
[0028] 1.本发明所述的花生纳米肤的制备方法，采用优化的料液浓度、高压微射流压力 和循环次数，实现了花生蛋白结构的最大程度展开，为后续酶解创造了最佳的作用环境；
[0029] 2.本发明所述的花生纳米肤的制备方法，有效降低了酶解成本，提高了酶解效率； 对比同类底物，采用相同种类的酶，中性蛋白酶用量降低了 25%，酶解时间降低了 17%;复 合蛋白酶用量则相差不大，酶解时间降低了 17% ;
[0030] 3.本发明所述的高压微射流处理提高酶解效率，制备花生纳米肤的方法，所获得 的酶解产物短肤得率达到88.26%，所获得的分子量小于1000化的短肤含量占98.15%，均 高于原料未采用高压微射流处理的同等酶解工艺;未经超滤的短肤的ACE抑制活性，其IC50 值为0.55mg/mL，高于未采用高压微射流处理同等酶解工艺的对照；而经超滤处理后，其 IC50值为0.192mg/mL，粒径为14.4nm，具有高ACE抑制活性。
【附图说明】
[0031] 图I为本发明所述高压微射流处理提高酶解效率制备高ACE抑制活性花生纳米肤 的方法示意图。
[0032] 图2为本发明中所得的高压微射流不同压力处理花生分离蛋白及对照微观结构。
[0033] 图3为本发明中所得的高压微射流不同压力处理及对照酶解产物ACE抑制活性 IC50值变化。
[0034] 图4为本发明中所得的高压微射流不同压力处理及对照中性蛋白酶酶解不同底物 浓度、酶解时间和酶用量对短肤得率的影响。
[0035] 图5为本发明中所得的高压微射流不同压力处理及对照复合蛋白酶酶解不同酶解 时间和酶用量对短肤得率的影响。
【具体实施方式】
[0036] 下面结合【具体实施方式】对本发明进行详细说明。
[0037] W下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例 中所用技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
[0038] 下述实施例中采用的高压微射流处理为通过微射流高压均质机进行，设备为美国 B邸international公司生产;所采用的中性蛋白酶、复合蛋白酶均为北京索莱宝科技有限 公司生产;粒径分析采用的仪器为英国马尔文仪器有限公司生产的Zeta电位分析仪;透射 电镜为日本日立公司生产的H-7500透射电子显微镜;高效液相色谱采用美国Waters公司的 Waters 1525高效液相色谱系统；
[0039] 下述实施例中通过透射电镜法进行微观结构的观察：
[0040] 用去离子水将固体样品配制成浓度为lmg/mL(w/v)的溶液，取一滴溶液加到覆有 聚乙締醇缩甲醒脂膜的铜网上，铜网水平放置2~3min使分子聚集体沉积到网面上，用滤纸 吸去表面多余溶液，之后滴加2 %的醋酸双氧釉溶液负染2min，将铜网在滤纸上放置3min使 充分染色并吸去多余的染液，干燥后用透射电子显微镜观察并拍照。
[0041 ]花生短肤分子量分布的测定:高效液相色谱法
[0042] 分别精确称取固体样品2. Omg，加入去离子水1 OmL配制成0.2mg/mL浓度的短肤溶 液，采用高效液相色谱对短肤的分子量分布进行测定，条件为：色谱柱： TSKge 12000SWXL300mm X 7.8mm;流动相：乙腊:水:S氣乙酸=45:55:0.1，流速:0.5mL/min， 溫度:30°C;检测波长:220nm。
[0043] ACE抑制活性的测定:高效液相色谱法
[0044]分别精确称取花生短肤，加入去离子水分别配制成2mg/mL、lmg/mL、0.5mg/mL、 0.2mg/mL、0.05mg/mL浓度的短肤溶液，采用高效液相色谱对短肤的ACE抑制活性进行测定， 条件为：色谱柱Sunf ire TM-C18(250 X 4.6mm)，流动相：乙腊：水:S氣乙酸=50:50:0.05， 流速:0.4mL/min，溫度:30°C;检测波长:228nm。测定结果采用化igin 8.0软件计算IC50值。
[0045] 短肤得率的测定:采用=氯乙酸可溶性氮法。
[0046] 精密称取Ig左右中间酶解产物样品入小烧杯，加入IOml 10%S氯乙酸，电磁揽 拌，溶解，定容至50ml容量瓶中，静止沉降30分钟后，420化pm离屯、30分钟，取上清液5ml采用 福林酪法测定含氮量;同法测定中间酶解产物