人工培养蛹虫草子实体核苷有效部位制备方法和用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及人工培养蛹虫草中有效成分的制备方法，尤其是一种由核苷类活性化 合物组成的有效部位及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 蛹虫草(Cbr办ce/751 (L. ) Link),又名北冬虫夏草，蛹草，北虫草， 蛹草菌等，分类学上属于真菌门（及??子囊菌亚门，核菌纲 ，球壳目 ，麦角菌科,虫草属 (Cbr办c/zs)。研究表明（陈俐彤，曹红峰，黄文芳.蛹虫草的化学成份、药效及应用.现代 食品科技，2005，21 (3): 192-194):蛹虫草含有多种核苷类化合物(如虫草素、腺膘呤、次 黄膘呤、胸腺嘧啶、尿嘧啶、尿苷、腺苷等)、多糖、糖醇、留醇类等成分。蛹虫草在降血脂，防 止动脉硬化，保护心、脑组织，镇静催眠，增强巨噬细胞的活性，抗炎、抗癌、抗菌、抗衰老等 方面均显示出良好功效。在冬虫夏草资源极其匮乏的情况下，蛹虫草作为与冬虫夏草同属 的另一个种，且含有较多的活性成份和具有广泛的生物活性，因此，蛹虫草逐渐成为冬虫夏 草的替代品之一。
[0003] 天然蛹虫草资源稀少，其生长受到自然环境和气候的限制。因此，人们研究并开发 了人工培养蛹虫草的技术和方法，可使蛹虫草的生长不受季节和环境的限制，从而可满足 日常生活和临床用药的需求。同时，相关研究也表明（孙月，薛阳，王琦.野生蛹虫草与 组培蛹虫草子实体的成份测定与分析.辽宁师专学报，1999，1(1): 1-2):人工培养蛹虫 草中所含成份与天然蛹虫草中的成份种类基本相同，且各种成份含量的差别也不大。
[0004] 近年来，蛹虫草各种提取物的研究较多。如学者Sang Eun Park等（Sang Eun Park, Hwa Seung Yoo, Cheng-Yun Jin, et al. Induction of apoptosis and inhibition of telomerase activity in human lung carcinoma cells by the water extract of Cordyceps militaris. Food and Chemical Toxicology, 2009, 47: 1667 - 1675)石开究表 明：蛹虫草水提物能够通过诱导癌细胞凋亡和抑制端粒酶活性，从而发挥抗肿瘤的作用。蛹 虫草中的核苷类成份也研究得比较多，如有报道称(于荣敏，汪宇.人工蛹虫草中的核苷 类活性物质及其制备方法和用途[P]. 2006)，从人工培养蛹虫草中提取所得的核苷类活性 物质，对小鼠移植性肝癌H22的抑瘤率为57%，对H22腹水小鼠生存期的生延率可达91. 9%。
[0005] 同时，对于蛹虫草中的核苷类化合物的提取纯化方法也有较多的报道，如利用超 声提取的方法（申进文，孙晓萍，赵旭，等.人工蛹虫草核苷类成分超声提取工艺优化 及HPLC定量分析.河南农业大学学报，2011，45(4): 391-394)，可以从人工蛹虫草中 提取出4种主要的核苷成分(尿苷、鸟苷、腺苷和虫草素)，但未给出核苷类化合物在总提取 物中的百分含量。也有学者（吕子明，姜永涛，吴立军，等.人工蛹虫草子实体化学成 分研究.中国中药杂志，2008，33(24): 2914-2917)利用大孔吸附树脂和硅胶色谱柱进 行分离纯化，从人工培养蛹虫草中分离得到虫草素、腺苷、N6-(2-羟乙基）腺苷等核苷类化 合物。但对蛹虫草中的核苷类化合物作为一个有效部位来进行提取纯化的工艺未见报道。
[0006]
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种来源于人工培养蛹虫草的由核苷类化合物所组成的有效 部位及其制备方法。
[0007] 所述发明是通过下述步骤实现的： (1) 人工培养蛹虫草子实体干品进行粉碎，并过10~50目筛，得原料粗粉； (2) 向所得原料粗粉中加入蒸馏水，温浸提取三次，每次6~8 h，每次提取完成之后， 用8层厚脱脂棉纱布进行减压抽虑，三次提取所得滤液合并，并进行浓缩； (3) 将步骤（2)中所得浓缩液进行醇沉； (4) 将醇沉后所得的浓缩液在4°C条件下静置12 h，然后在4000~5000 r/min的条件 下离心10~20 min,取上清液，弃沉淀； (5) 将步骤（4)中的上清液用大孔吸附树脂柱进行纯化，纯化时先用蒸馏水进行洗脱， 再用低浓度乙醇进行洗脱，并收集该部分洗脱液； (6) 将所收集的低浓度乙醇洗脱液浓缩后，用等体积水饱和的正丁醇萃取3~5次，萃 取所得正丁醇层回收溶剂，蒸干后用水溶解并进行冷冻干燥，即可获得淡黄色粉末状的蛹 虫草核苷类组分有效部位。
[0008] 所述步骤（2)中原料与蒸馏水的比例为质量（m):体积（V)=l : 10~1 : 20,温 浸提取时的水浴温度为60°C~80°C。
[0009] 所述步骤（3)的具体过程为：向浓缩液中加入乙醇，使乙醇的终浓度为75%~88%， 边加边搅拌，加完后在4°C条件下静置10~16 h，然后减压抽虑，并浓缩滤液。
[0010] 所述步骤（5)中所用的大孔吸附树脂的型号为AB-8,洗脱时所用低浓度乙醇指 10%~20%的乙醇。
[0011] 本发明工艺步骤简单易行，所用的技术方法涉及到水提、醇沉、大孔吸附树脂除 杂、萃取及冷冻干燥，易于实现工业化大规模生产；同时工艺中未使用一、二类有机溶剂，因 此，通过该工艺所获得的有效部位不存在有毒溶剂残留问题。
[0012] 通过该方法获得的有效部位可制备成药物。
[0013] 通过该方法获得的有效部位可制备成保健品或者其他功能性食品。
【具体实施方式】
[0014] 现结合实施例对本发明做进一步详细说明，实施例仅限于说明本发明，而非对本 发明的限定。
[0015] 实施例1 (1) 人工培养蛹虫草子实体20 g在55°C条件下干燥6 h后，适当粉碎后过一号筛（10 目），得原料粗分，然后按料液比为1 : 10的比例加入蒸馏水，在60°C水浴条件下温浸提取 3次，每次6 h，每次提取完成之后，用8层厚脱脂棉纱布过滤，所得滤液合并，并浓缩至40 ml ； (2) 向上述浓缩液中加入乙醇，使乙醇终浓度达75%，边加边搅拌，加完后放在4°C冰箱 中静置12 h，第二天进行减压抽虑，所得滤液浓缩至20 ml，该浓缩液在4°C条件下放置12 h后，在4000 r/min条件下离心10 min，弃掉沉淀； (3) 新购买的大孔吸附树脂AB-8 140 g用95%乙醇浸泡6 h后，装入外径为3. 5 cm的 色谱柱中，先用95%乙醇将大孔吸附树脂洗净，然后用蒸馏水将树脂柱中的乙醇洗净，再将 步骤（2)中离心所得的上清液转移至大孔吸附树脂柱上方，并静置吸附12 h ; (4) 上样后的AB-8大孔吸附树脂柱先用6倍柱体积蒸馏水进行洗脱，然后再用6倍柱 体积10%乙醇进行洗脱，并收集10%乙醇洗脱液。洗脱完后，将收集到的10%乙醇洗脱液浓 缩至50 ml，浓缩液再用等体积水饱和正丁醇萃取3次，萃取所得正丁醇层回收溶剂，蒸干 后再用适量蒸馏水溶解样品，并转移至干净的容器中，最后进行冷冻干燥，即可获得由蛹虫 草中的核苷类化合物所组成的有效部位87. 75 mg ; (5) 通过实施例1所获得的有效部位，利用标准曲线法进行含量分析，测得该有效部位 中主要核苷类化合物的总百分含量为53. 83%，主要核苷类化合物的含量及比例如下表： 表1. HPLC法测定有效部位中主要核苷的含量及其比例
【主权项】
1. 一种人工培养蛹虫草(Cb·/办ce/75· (L. )Link)中由核苷类活性物质组成 的有效部位，其特征在于所述有效部位是按如下方法制备所得： (1) 人工培养蛹虫草子实体干品进行粉碎，并过10~50目筛，得到原料粗粉； (2) 向所得原料粗粉中加入蒸馏水，温浸提取三次，每次6~8 h，每次提取完成之后， 用8层厚脱脂棉纱布进行减压抽虑，三次提取所得滤液合并，并进行浓缩； (3) 将步骤（2)中所得浓缩液进行醇沉； (4) 将醇沉后所得的浓缩液在4°C条件下静置12 h，然后在4000~5000 r/min的条件 下离心10~20 min,取上清液，弃沉淀； (5) 将步骤（4)中的上清液用大孔吸附树脂柱纯化，纯化时先用蒸馏水进行洗脱，再用 低浓度乙醇进行洗脱，并收集该部分洗脱液； (6) 将所收集的低浓度乙醇洗脱液浓缩后，用等体积水饱和的正丁醇萃取3~5次，萃 取所得正丁醇层回收溶剂，蒸干后用水溶解并进行冷冻干燥，即可获得淡黄色粉末状的蛹 虫草中由核苷类活性物质组成的有效部位。
2. 根据权利要求1所述的一种人工培养蛹虫草中由核苷类活性物质组成的有效部位 的制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中温浸提取时的料液比为1:10-1 :20。
3. 根据权利要求1所述的一种人工培养蛹虫草中核苷类活性物质构成的有效部位的 制备方法，其特征在于，所述步骤（2)中温浸提取时的温度为60~80°C。
4. 根据权利要求1所述的一种人工培养蛹虫草中由核苷类活性物质组成的有效部位 的制备方法，其特征在于，所述步骤（3)中醇沉时乙醇的终浓度为75%~88%。
5. 根据权利要求1所述的一种人工培养蛹虫草中核苷类活性物质构成的有效部位的 制备方法，其特征在于，所述步骤（5)中所用大孔吸附树脂为AB-8。
6. 根据权利要求1所述的一种人工培养蛹虫草中核苷类活性物质构成的有效部位的 制备方法，其特征在于，所述步骤（5)中的低浓度乙醇指乙醇的浓度为10%~20%。
7. 权利要求1所述的人工培养蛹虫草中由核苷类活性物质组成的有效部位组成的药 物。
8. 权利要求1所述的人工培养蛹虫草有效部位可开发成保健品或者其他功能性食品。
【专利摘要】本发明涉及一种人工培养蛹虫草（Cordycepsmilitaris（L.）Link）子实体中核苷类活性物质构成的有效部位制备方法及其用途。人工培养蛹虫草子实体经过粉碎，水提，醇沉，再用大孔吸附树脂进行纯化，最后经过萃取与干燥，得到由核苷类活性物质组成的有效部位，其中三种主要核苷类活性成分的含量不低于该有效部位的50%。本发明所述提取纯化工艺步骤简单、组分纯度高等优点，并易于实现大规模生产，具有研制开发成为药物、保健品和功能食品的应用价值。
【IPC分类】A23L1-28, A23L1-29, A61K36-068
【公开号】CN104664324
【申请号】CN201310630963
【发明人】于荣敏, 张明华, 宋丽艳
【申请人】于荣敏, 张明华, 宋丽艳
【公开日】2015年6月3日
【申请日】2013年12月2日