来源于植物的二酯酰甘油酰基转移酶基因的利记博彩app

专利名称：来源于植物的二酯酰甘油酰基转移酶基因的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及可用于对植物特性进行遗传操作的植物基因。更为具体的，本发明涉及二酯酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因的鉴定、分离和导入，该基因可以用于，例如，在经济作物或农作物中改变籽油的含量、籽油中二酯酰甘油/三酯酰甘油部分的比例、脂肪酸合成、籽油酰基组成、种子体积/重量比和进入其他种子组份的碳代谢流量。
在上述的三个位于内质网(ER)内的脂肪酸酰基辅酶A酰基转移酶中，只有LPAT的基因曾被从植物中克隆出来(Knutzon等，1995，Lassner等，1995)。与在贮存性脂类生物合成中所涉及的几种其他的酶类类似，酰基转移酶是内在性的内质网蛋白质，而且非常难于纯化。对植物DGAT的研究很大程度上被局限于研究特定级份的活性特征，这些级份是通过对种子或小孢子来源的胚胎匀浆物进行差速离心而得到的(Weselake等，1993)。虽然对来自于发芽大豆种子子叶的DGAT进行的部分纯化曾被报道过(Kwanyuan和Wilson，1986)，但是该酶的具体分子特征依然未知。
相应的，尽管Kennedy途径已知而且显示了在植物的TAGs生物合成的步骤，但是并没有任何关于特定遗传因子的鉴定和使用方法的报道，该遗传因子能够以一种可能进行商业应用的形式，可靠地用于在植物体内修饰TAG合成和组成。
本发明的另一个目的是鉴定、分离和表征来源于拟南芥的二酯酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因和cDNA序列并且利用这些序列对植物进行遗传操作。
本发明的另一个目的是提供一个有义方向含有来源于拟南芥的全长DGAT cDNA序列的载体，该cDNA序列位于一个种子特异性启动子(例如，napin；见Josefsson等，1987；Radke等，1988；Voelker等，1992)的控制下，用于将该载体重新导入拟南芥或导入其他植物中。
本发明的另一个目的是提供一个含有来源于拟南芥的基因组片段的载体，该基因组片段由全长的DGAT基因位于它本身的5｀上游调控序列控制下而组成，用于将该载体重新导入拟南芥或导入其他植物中。
本发明的另一个目的是提供一种构建含有来源于拟南芥的全长DGAT序列或DGAT序列的重要片段(significant fragment)的载体的方法，该序列或其片段以反义方向位于一个组成型启动子或一个种子特异性启动子的控制之下，用于将该载体重新导入拟南芥或导入其他植物中。
本发明的另一个目的是提供一种修饰拟南芥或其他植物的方法，以改变其籽油含量。
本发明的另一个目的是提供一种修饰拟南芥或其他植物的方法，以改变其籽油中的酰基组成。
本发明的另一个目的是提供一种修饰拟南芥或其他植物的方法以改变其平均种子质量或大小。
根据本发明的一个方面，提供了一个含有经过分离和纯化的SEQID NO1脱氧核糖核酸(cDNA)的载体(pDGATcDNA；ATCC No.PTA-989)，用于将该cDNA以有义方向导入植物细胞。
作为本发明的另一个方面，提供了一个含有经过分离和纯化的SEQ ID NO3(pDGATgene；ATCC No.PTA-988)基因组脱氧核糖核酸(基因组DNA)的载体，用于将基因组基因以有义方向导入到植物细胞中。
根据本发明的另一个目的，提供了一种制备含有SEQ ID NO1或其部分片段的载体的方法，用于将该基因或其部分片段以反义方向导入植物细胞。
根据本发明的另一个目的，提供了拟南芥哥伦比亚生态型突变体AS11(ATCC No.PTA-1013)的种子以及其脂类表型的表征(Katavic等，1995；Zou等，1999)。该AS11突变体种子系具有一个位于染色体II的TAG1位点上的插入突变，能够生产具有低DGAT活性(图4)和种子发育过程低TAG/DAG比例(表1)的植株，因而导致在发育过程中(图3)和成熟期(表1中低的TAG/DAG比例)种子脂肪酰基组成的改变(图2)、油含量的降低(表1)、和籽油二酯酰甘油含量的提高。AS11 DGAT的cDNA序列如SEQ ID NO23所示，基因组DNA序列如SEQ ID NO24所示，AS11 DGAT翻译得到的蛋白质序列如SEQ ID NO25所示。
本发明也涉及特定的转基因植物和植物种子，这些植物和种子的基因组含有导入的SEQ ID NO1或SEQ ID NO3 DNA序列，以及生产上述植物和植物种子的方法。
本发明也涉及SEQ ID NO1或SEQ ID NO3、或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的一部分、或含有81bp插入序列的SEQ ID NO1[SEQID NO23]或含有147bp插入序列的SEQ ID NO3[SEQ ID NO24]，因而所编码蛋白质的推测氨基酸序列含有重复序列SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK[SEQ ID NO25]，该重复序列中有下划线的氨基酸的间隔和同一性是相同的或者被保守替换所取代，其特征在于该序列被以有义方向或反义方向导入植物细胞内，以及生产这种植物或植物种子的方法。
应当为该领域技术人员所理解的是，本发明也涉及来源于植物的基本同源的DNA序列，所编码蛋白质的推测氨基酸序列具有25％或更高的同一性，以及40％或更高的相似性，该基本同源的DNA序列是利用SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或含有81bp插入序列[SEQ IDNO23]的SEQ ID NO1的序列信息通过已知的方法进行分离和/或表征和/或设计得到的，因此所编码的蛋白质的推测氨基酸序列含有重复序列SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK(SEQ ID NO25)，该重复序列中有下划线的氨基酸的间隔和同一性是相同的或者被保守替换所取代；本发明还涉及较短长度的部分序列，该序列仍然能够以反义、共抑制(Transwitch；Jorgensen和Napoli 1994)或其他基因沉默技术的形式作为基因表达的抑制因子。本领域的技术人员应该理解的是，特定基因序列中核苷酸同一性的微小改变可能会导致该基因效能的降低或者加强，而且在一些应用(例如，反义或共抑制技术)中，部分序列经常会和全长序列同样有效地发挥作用。基因序列变化或缩短的方法为本领域的技术人员所熟知，测试这些发生变体的基因的有效性的方法也是如此。因此，所有类似的基因的变体都被要求作为本发明组成部分。
其他对于所指出的序列的同一性的优选程度至少是30％、40％、50％、60％70％、80％、90％和95％；其他的相似性的优选程度至少是50％、60％、70％、80％、90％和95％。发明人使用了一套计算机程序以评估同源性，该程序称为MegAlign，DNASTAR ofDNASTAR Inc.，1228 South Park Street，Madison，WI 53715，USA。这套程序是基于Clustal V算法(Higgins和Sharp(1998)A packagefor performing multiple sequence alignment on a microcomputer；GENE 73237-244)。对于引入排比的每一个缺口而言，程序就会从结果中扣除掉一个惩罚量(penalty)。较高的缺口惩罚量会抑制间隔；而较低的该数值会提高间隔。该程序也可以基于间隔长度评估惩罚量。缺口所跨越的残基数越多，惩罚量越大。该程序可以从排比的整体结果中扣除掉这些惩罚量。
更为具体的说，本发明涉及从十字花科(Brassicaceae)(特别是拟南芥(Arabidopsis thaliana))中分离、纯化和表征二酯酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因，以及论证其在调节脂肪酸合成、籽油含量、二酯酰甘油/三酯酰甘油比例和种子体积/重量比中的作用。到目前为止，关于植物DGATs的基因结构或其通过遗传操作在改变油含量或组成中的作用还没有可用的具体数据。
考虑到改变的油含量和组成，和由具有统计显著性数量的同一时间在同样的条件下生长的相同的基因型的未转化(对照)的植物或种子的平均数得到的结果比较，由具有统计显著性数量的本发明的植物或种子的平均数得到的结果是最好的。这样就考虑到了相同基因型不同个体植株间的差异，特别是当这些植株生长在不同的条件下时。用于形成所要求的平均数的植物和种子的确切数量是可变的，但是应该保证只要采用该数量，就足以提供基本稳定的平均值。一般的，该数量至少应该是10，更优选的至少是20、30、50或100。
DGAT基因通过以下步骤从拟南芥进行克隆、表征和鉴定(1)挑选和表征与哺乳动物酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶具有部分同源性的植物ESTs；(2)在酵母细胞中进行全长cDNA的功能性表达；(3)表征和分离来自于拟南芥突变株AS11的DGAT(TAG1)基因，该突变株含有DGAT基因上的插入突变，而且其籽油表型包括改变的DAG/TAG比例和改变的油含量以及酰基组成；(4)通过插入DGAT cDNA序列对AS11突变株进行基因互补以恢复野生型的脂肪酸组成；(5)DGAT cDNA在野生型拟南芥转基因植株体内的过量表达，产生具有高的油含量、高的平均籽重和改变的籽油酰基组成的种子。
拟南芥DGAT的结构与其在哺乳动物细胞中的对应物具有显著的同源性(在一个超过400个氨基酸残基的区域内有40％以上完全相同)，而且与随后报道的推定的欧洲油菜DGATs在核苷酸水平(92％)和推测的氨基酸水平(90％)上有高度的同源性(Nikyiforuk等，1999；GenBank/EMBL保藏号AF 155224；AF164434)。
本发明的DGAT可用于调控植物体内DGAT的活性和三酯酰甘油的生物合成。例如，用一个含有有义方向的DGAT基因的结构转化植物，在组织特异性启动子(例如，种子特异性启动子napin)的控制下，DGAT的表达和籽油的积累可以被增强或者籽油中的酰基组成被改变。而另外一个例子中DGAT cDNA的表达是在组成型启动子(例如，35S(Datla等，1993))的控制下进行的，以提高营养组织(叶、根、茎)中TAG含量。这对于改变块根类农作物的淀粉/油比例有特殊的优势。
可选的，DGAT的表达可以通过反义或共抑制(Transwitch)现象(De Lange等，1995；Mol等，1990；Joegensen和Napoli，1994；Kinney，1995；Vaucheret等，1998；Taylor，1998)进行一定程度的沉默。例如，以种子特异性的方式沉默DGAT，可以导致TAG积累的下降。这种方法可以在降低大麦种子油的含量以提高储存的稳定性方面进行应用。作为第二个例子，种子特异性沉默技术可以导致发育中或成熟的种子中相对高的DAG积累或DAG/TAG比例的提高。作为另外一个例子，突变的DGAT基因表达会导致在突变的DGAT蛋白中产生27个氨基酸残基的重复插入(见图5a)，这种现象可以用于改变发育中或成熟种子的DAG/TAG比例。上述的操作能够使植物中产生天然的、含有提高的DAG相对水平/降低的TAG水平的可食用籽油(见图3；表1)，可用于食品和糖果工业中作为全天然的乳化剂，或者通过抑制人体内中性脂肪的沉积，提高作为功能性食品的植物油类的营养/健康特性(例如，作为在色拉用调料、人造黄油，烹调用油、stir fry oils)。从canola和大豆中生产的经过加工的含有较高比例二酯酰甘油的植物油类曾被日本Kao公司(例如，Econa烹饪油；Kao公司KI，1-14-10 Nihombashi-Kayabacho，Chuoku，Tokyo 103Japan；e-mail210064@kastanet.hao.co.jp)引用作为一种使血液中性脂肪在饭后难以升高以及脂肪难以附着到体内的产品，因而可以帮助那些体重超重或中性脂肪水平过高的人。作为第三个例子，以种子特异性方式沉默或降低DGAT的活性(如在突变体AS11中观察到的，例如，通过过量表达SEQ ID NO23或SEQ ID NO1或SEQ IDNO3的沉默表达)，并将这个特性和种子中产生多羟基烷羧酸酯(PHAs；例如多羟基丁酸酯)的能力结合起来(Poirier等，1992；1995)，将会使未酯化的脂肪酸进入β-氧化通路的流量提高(Poirier等，1999)。通过将未酯化的脂肪酸循环或转移到β-氧化通路，产生的酰基辅酶A会导致多羟基烷羧酸酯(PHAs)的显著提高或者PHA组份的改变(Poirier等，1999)。在种子中产生PHAs的转基因植物具有作为生物可降解性热塑性塑料的潜力。不过，到目前为止，所产生的PHAs水平还相对较低(Poirier等，1992；1995)。由于本发明的DGAT，在产生PHA的种子内利用转基因途径降低DGAT活性以显著增加PHA产量(例如，增加10倍)目前已经是可能的。
一些利用DGAT基因或其部分可能进行的操作和递送包括，但不局限于，下面所述具有提高或降低的油含量的种子；含有二酯酰甘油含量提高的油的种子；具有改变的酰基组成的籽油；产生更大或更重种子的植物；显示出在其他贮藏性器官(例如，块茎，、根)内具有提高的或改变的积累贮藏性化合物的能力的植物。
图2是一张曲线图，显示了来源于拟南芥野生型(WT)和DGAT突变体AS11系的籽油中脂肪酸组分的比较。脂肪酸的比例以占各系中总脂肪酸组分的摩尔百分比表示，记为Mol％。误差线为±SE(n＝10每个测试系10棵植株，每次分析每个样品50粒种子)。
图3是一张曲线图，显示了拟南芥野生型(WT)和DGAT突变体AS11系发育中的种子的DAG含量比较。更为具体的，所比较的是野生型绿色发育中种子的DAG库中脂肪酸的含量和AS11突变体的脂肪酸含量。
图4是一张曲线图，显示了拟南芥野生型(WT)和DGAT突变体AS11系中处于胚胎发育的乳状期、早绿期、中绿期和棕绿期的发育中种子的DGAT活性(pmole/min/mg蛋白质)的比较。处于各个时期的发育中种子的挑选和DGAT酶的分析按照Katavic等以前所述的方法(1995)进行。
图5(a)显示了ArabidopsisDGAT(AtTAG1)[SEQ ID NO2]和哺乳动物(鼠和推测的人类)DGATs氨基酸序列的排列比较。MDGAT代表鼠DGAT[SEQ ID NO4]；GenBank/EMBL保藏号AF078752(Cases等，1998)]；HARGP1代表人ARGP1蛋白[SEQ ID NO5]；GenBank/EMBL保藏号AF059202；Oelkers等，1998]。点代表缺口。完全相同的氨基酸残基以黑色突出显示。保守的残基加阴影显示。由SEQ ID NO23(SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK)中发现的插入突变(81bp)在拟南芥突变体AS11中产生的27个氨基酸的重复序列以上划线用……表示。推测的三酯酰甘油结合位点以上划线用 表示。SnRK1目标位点以上划线用 表示，在丝氨酸(S)上用星号(*)表示磷酸化作用目标位点。
图5(b)显示了DGAT蛋白的Kyte-Doolittle水疗法曲线图。
图6(a)显示了在拟南芥中表达的TAG1基因的Northern分析结果。总RNA提取自根(RT)、叶(LF)、花(FL)、幼苗(YS)、发育中的长角果实(SL)和发芽的种子(GS)。
图6(b)显示了拟南芥中TAG1基因的Sorthern印迹分析结果。基因组DNA用限制性内切酶BgIII(泳道1)、EcoRI(泳道2)和HindIII(泳道3)消化。TGA1DNA探针是通过随机引物法用32P标记的。
图7(a)以图解的形式显示了TAG1的基因结构。方框代表了16个外显子(实心方框代表编码区，开放方框代表非翻译区)，直线代表了15个内含子。A、B和C表示对野生型(WT)和AS11的片段进行PCR扩增时的引物位置。特定的引物A、B和C在实验步骤引物策略(见后)中有描述。
图7(b)显示了野生型(WT)和AS11的PCR扩增产物的凝胶分离结果。泳道1，以WT基因组DNA为模板用引物A和B得到的PCR扩增产物。泳道2，以AS11基因组DNA为模板用引物A和B得到的PCR扩增产物。泳道3，以WT基因组DNA为模板用引物C和B得到的PCR扩增产物。泳道4，以AS11基因组DNA为模板用引物C和B得到的PCR扩增产物。泳道5，以WT幼苗RNA制备的RNA为模板用引物A和B得到的RT-PCR扩增产物。泳道6，以AS11幼苗RNA制备的RNA为模板用引物A和B得到的RT-PCR扩增产物。
图8是一张图表，显示了在用空质粒(pYES Con)和拟南芥DGATcDNA(pYESDGAT)质粒转化的酵母菌株YMN5中微粒体DGAT的活性。该表说明TAG1cDNA在酵母中进行了表达。酵母菌株YMN5的寄主培养物仅用pYES2质粒(pYES2；无TAG1插入序列)或用含有TAG1 cDNA插入序列的pYES2质粒(pYES2TAG1)进行了转化。用半乳糖进行诱导后，将转化体按照实验方法部分的描述进行裂解并分析DGAT活性。显示了两个独立的DGAT活性试验的结果。
图9是可用作载体的质粒pSE 129A的结构示意图。该载体有如下的可用于本发明植物转化的显著特性种子特异性的napin启动子和NOS终止子，两者之间是多克隆位点。


图10是一张图表，显示了野生型cDNA对AS11 DGAT突变的互补作用。用napin启动子控制下的DGAT cDNA[SEQ ID NO1]转化拟南芥突变系AS11，会导致在转化系3-4、9-1、14-2和9-4的籽油中恢复野生型(WT)脂肪酸组成。脂肪酸组成(wt％)的确定是通过从拟南芥未转化对照(WT)、突变系AS11和napinDGAT转基因系的T2种子中各选取100颗种子的样品，然后从样品中提取籽油进行测定而进行的。
图11是一张图表，显示了未转化WT对照和pRD400对照(空质粒)以及napinDGAT T2转基因拟南芥种子系的籽油含量。更为具体的，该图表显示了用napin启动子控制下的DGAT cDNA[SEQ ID NO1]转化野生型(WT)拟南芥后，导致在DGAT转基因系中产生更高的籽油含量。籽油含量以每100颗来自拟南芥未转化对照(WT con)、pRD400对照(空质粒)转基因系和napinDGAT转基因系1｀、2｀、9、10和11的T2种子的种子中含有的μg总脂肪酸(FAs)量的形式表示。显示了对照系的标准误差线；n＝10。
图12是一幅图表，显示了未转化对照(WT con)、pRD400对照(空质粒)和napinDGAT T2转基因拟南芥种子系的100颗种子平均的重量。更为具体的，该图表显示了在野生型(WT)中napin启动子控制下DGAT基因的过量表达，导致了更高的平均种子重量。来自拟南芥未转化对照(WT con)、pRD400对照(空质粒)转基因系和napinDGAT转基因系1｀、2｀、9、10和11的T2种子的100颗种子样品平均的重量以mg干重形式(DW)表示。
图13是一张图表，显示了拟南芥未转化对照(WT con◆)、pRD400对照(空质粒)转基因系和napinDGAT转基因系1｀、2｀、9、10和11(■)T2种子的籽油含量(以μg总脂肪酸(FAs)/100颗种子形式表示)和平均种子重量(以mgDW/100颗种子样品形式表示)间的正相关性，以mg干重(DW)形式表示。
有鉴于此，本发明的发明人决定要研究DGAT以确定在植物体内其相应的基因能否被测序、克隆以及用于以一种可进行商业应用的方式修饰植物的籽油含量和脂肪酸的组成。
酰基辅酶A依赖性的sn-1，2-DAG酰基化作用是被DGAT所催化的(Stymne和Stobart，1987)。在发育中或发芽的含油种子植物的种子中，TAG积累和DGAT的活性显示出与内质网相关(ER；高速微粒体部分)(Stobart等，1986；Cao和Huang，1986；Stymne和Stobart，1987；Frentzen，1993；Settlage等，1995；Lacey和Hills，1996)。微粒体DGAT的生化特征在包括欧洲油菜的发育中的种子(Bernerth和Frentzen，1990；Vogel和Browse，1996；Cao和Huang，1987)以及胚胎培养物(Taylor等，1991；weselake等，1991；Taylor等，1992；Little等，1994)在内的许多植物系统(Frentzen，1993)中被研究过。总之，对发育中的种子的研究结果显示DGAT的活性在油类积累的活跃阶段升高很快，在种子的酯类含量达到稳定时期后显著下降(Tzen等，1993；Weselake等，1993)。
许多对哺乳动物(Mayorek等，1989；tijburg等，1989)和植物(Ichihara等，1988；Perry和Harwood，1993a和1993b；settlage等，1995)系统的研究表明DGAT可以在TAG的生物合成中催化一个限速反应。不过，这种假设到目前为止并未进行过严格的检验证实，而且也没有变成通过在植物和动物系统中转基因表达任何DGAT基因的实践活动。欧洲油菜、Shiralee栽培种的发育中的种子被证实在油类积累的活跃阶段具有显著的DAG水平，这种现象说明DGAT催化的反应可能调节进入TAG的碳代谢流量(Perry和Harwood，1993a和1993b)。另外，乙基甲烷磺酸盐诱导(EMS诱导)的拟南芥突变株，命名为AS11，被证实具有降低的DGAT活性，该活性的降低与DAG含量的升高和TAG积累的降低相关(Katavic等，1995)。假设其在TAG生物合成中可能的速度限制作用，本发明的发明人把DGAT作为对植物脂类生物合成进行基因修饰的一个潜在的目标。
之前，关于ESS诱导的具有改变的脂肪酸组成的拟南芥突变体，AS11的部分表征有所报道(Katavic等，1995)。与野生型植物种子相比，AS11的种子具有较低水平的超长链脂肪酸二十烷酸(20∶1)和低的油酸(18∶1)以及积累的α-亚麻酸作为三酯酰甘油主要的脂肪酸来源(图2)。AS11突变体在发育中的种子中具有恒定较低的TAG/DAG比，而且积累较多数量的种子DAG(图3)，作为三酯酰甘油酰基转移酶的底物。通过一系列生化分析，显示出AS11在种子发育过程中具有较低水平的三酯酰甘油酰基转移酶活性(图4)。AS11也具有较低的油含量(25-30％)的表型，这提供了证明DGAT可能控制进入TAG生物合成的代谢流量的证据，如下表1所示。AS11不具有在其它低籽油突变体中所描述的褶皱种子表型(Focks和Benning，1998)。
表1AS11[Katavic等，(1995)]和野生型拟南芥种子在发育中期的脂类分布特征以及成熟种子中TAG、DAG和固醇酯的相对含量的比较。种子 发育中期 成熟期a成熟期TAG 成熟期固醇酯含量类型 TAG/DAG比aTAG/DAG比a相对含量b(％总脂类提取物)dc(nmol/mg DW)WT 17 901.00b0.8c(255)AS11 5200.6b1.15c(174)a胚胎期划分和脂类测定如Katavic等所述(1995)；b根据Rutar(1989)的方法用MASS-1H-NMR测定200颗AS11和WT的种子样品的相对TAG含量。将可归于液体样油类的综合共振反应相加，AS11种子的数值以相对于WT对照组样品共振反应的形式报道(后者设为1.00)；cTAG含量(nmol/mg DW)的测定是通过TLC纯化的TAG片段的转甲基反应，然后进行脂肪酸甲酯的GC分析而进行的；d总脂肪酸提取物是通过Taylor等(1991；1992)描述的方法制备的，固醇酯的分离和表征如实验方法所述。
遗传分析显示脂肪酸表型是由于核基因的半显性突变引起的，命名为TAG1。该突变定位于染色体II上，估计位于距sti位点约17.5±3cM和距cp2位点8±2cM的区域中。
由于DGAT基因迄今还没有从任何一种植物中被克隆出来，所以到目前为止，还不可能提出通过调节植物DGAT活性而进行基因修饰以改变碳代谢流量，提高脂肪酸合成、油含量、油酰基组成或种子体积的可能性。
然而，有很多对植物代谢进行了成功地修饰的例子，这些修饰通过基因工程技术转移新的基因到植物体内或改变植物已有基因的表达而实现。现在通过将基因导入到许多具有重要农艺价值的植物品种体内以提高作物性能(例如，籽油或块茎淀粉含量/组成；谷粉改进；除草剂、疾病或昆虫抗性、重金属耐受性等)照例也是可能的(MacKenzie和Jain，1997；Budziszewski等，1996；Somerville，1993；Kishore和Somerville，1993)。
例如，关键性脂肪酸的比例和籽油的数量的提高已经通过将各种脂肪酸生物合成和酰基转移酶基因导入到油类种子作物中得以实现。包括以下示例在Brassicaseae中表达硬脂酰-ACPΔ9脱饱和酶反义构建会导致硬脂酸含量的升高(Knutzon等，1992)。在Brassicaseae中表达来自加利福尼亚月桂树的中链脂肪乙酰-ACP硫酯酶，被证明可以提高其月桂酸(12∶0)的含量(Voelker等，1992；1996)；在低芥子酸Brassicaseae中表达加州希蒙得木β-酮酰基辅酶A合酶会导致芥子酸(22∶1)水平的升高；在高芥子酸品种中表达该基因的产生作用可以忽略(Lassner等，1996)。在欧洲油菜和大豆中提高油酸的比例已经通过沉默微粒体FAD2(Δ12)脱饱和酶基因得以实现(Hitz等，1995；Kinney，1995；1997)。用酵母sn-2酰基转移酶转化拟南芥和油菜籽(欧洲油菜)会导致籽油中22∶1以及其它超长链脂肪酸比例的升高和籽油含量的显著升高(Zou等，1997)。
淀粉的沉积也可以通过基因工程方法改变。在马铃薯块茎中表达编码ADP葡萄糖焦磷酸化酶的突变型E.coli glgC16基因，会导致淀粉积累的增加(Stark等，1992)。
因此发明人认为DGAT基因有很大希望可以用于植物TAGs预期的修饰。
实施本发明最佳的方式可以从下述对发明人所进行的试验的结果的描述中清楚地看到。
发明人选择使用被广泛接受的模型植物系统拟南芥用于克隆DGAT，作为改变DGAT表达、研究改变DGAT表达对种子三酯酰甘油生物合成影响的基因工程操作的宿主系统。这是因为，在过去几年里，拟南芥，一种典型开花植物，在植物生物学研究中作为模型系统得到了越来越多的普及。由于拟南芥给传统遗传学和分子遗传学研究工作带来的方便，该植物作为模型生物已经广泛地应用于植物分子遗传学、发育、生理和生化的研究中(Meyerowitz和Chang，1985；Meyerowitz，1987；Goodman等，1995)。该双子叶模型植物与Brassica作物种关系很近，而且越来越明显地是关于拟南芥基本生物学过程遗传控制的信息能够转移到其它物种中(Lagercrantz等，1996)。
实际上，有许多的例子都是首先用模型植物拟南芥进行试验的，然后在其它植物，尤其是谷物植物中，得到相似的表型。在这些例子中研究的是特定代谢途径或发育过程中的分子生物学和生物化学特性以及通过遗传工程手段对该代谢途径或过程进行改变的可能性。
例如，与质体外膜相关的油酸(18∶1)Δ12(ω-6)脱饱和酶基因，FAD2，是最初在拟南芥中进行研究然后从拟南芥中通过鉴定拟南芥缺陷突变体中发现的卵磷脂骨架的损伤而克隆出来的，该突变体在将油酸脱饱和成亚油酸(18∶2)的步骤上有缺陷。这就导致了一个在拟南芥籽油中高油酸含量的表型(Okuley等，1994)。对大豆(Glycinemax.)和欧洲油菜进行遗传工程操作，通过反义或共抑制方法，以种子特异性方式沉默其本身的FAD2基因，会导致类似的高油酸籽油表型(Kinney，1995；1997)。
酵母sn-2酰基转移酶(SLC1-1)基因的转基因表达以实现增加籽油和超长链脂肪酸的含量，首先是在拟南芥上进行的，然后在转基因油菜籽(欧洲油菜)实验中也得到相似的表型(Zou等，1997)。拟南芥已经反复显示出它本身是一个对所有高等植物都普遍具有的代谢途径(例如，脂类生物合成、光合作用)或过程(器官形成、生殖发育等)进行代谢工程的有用的模型系统。
在次级代谢/信号传导领域，一个来源于单子叶玉米的花色苷途径特异性转录激活因子，命名为R(与玉米仁糊粉细胞花色苷合成中的生物合成基因的激活有关的myc转录因子)，在双子叶的拟南芥中表达，会引起花序中花色苷色素沉积增加。接着在另一种双子叶植物，烟草(Nicotiana tabacum)中表达，导致了相似的花色素沉积的改变(Lloyd等，1992)。这些实验说明了对所有开花植物普遍具有的整个途径可以通过导入转录调节因子进行同等程度的调节控制，而且其机制对不同的植物种来说是共同的。
在本发明的上下文中，所有的植物种子都积累一定量的三酯酰甘油(油)，这个普遍存在的现象如前面所描述的，至少部分被微粒体DGAT的活性所影响。因此，在拟南芥中观察到的通过遗传工程操作调节DGAT表达所带来的影响可以被预期并且可以预测在其它所有植物中实施后会导致类似的表型。例如，本发明实施后，通过显示欧洲油菜具有一个高度同源的DGAT基因(Nikiforuk等，1999)可以得到支持本发明发明人的发现的相关信息，因此欧洲油菜是一个基因修饰的明显的目标，该修饰类似于对拟南芥所进行的基因修饰。
有很多方法可以将基因或基因结构导入植物，而且植物转化技术和组织培养技术的结合已经被成功的整合成用于产生转基因农作物植株的有效方法。这些可以用于本发明的方法，在其他文献中已进行过广泛的介绍和评述(Potrykus，1991；Vasil，1994；Walden和Wingender，1995；Songstad等，1995)，而且为本领域技术人员所熟知。例如，一个本领域的技术人员肯定会知道，除了利用真空渗入(Bechtold等，1993)或创伤接种(Katavic等，1994)进行农杆菌属介导的拟南芥转化外，同样也可以用农杆菌Ti质粒介导转化(例如，下胚轴(DeBlock等，1998)或子叶叶柄(Moloney等，1989)创伤感染)，微粒轰击/biolistic方法(Sanford等，1987；Nehra等，1994；Becker等，1994)或聚乙二醇辅助原生质体转化(Rhodes等，1988；Shimamoto等，1989)方法转化其他植物或作物品种。
本领域技术人员同样应该明确的看到，如其它文献所广泛评述的(Meyer，1995；Datla等，1997)，使用植物启动子以引导任何预期的对转基因表达的增量或减量调节都是可能的，这些启动子包括组成型启动子(例如，以CaMV35S为基础的启动子)或能够将基因表达定位于特定细胞、组织(例如，用于在发育中的种子子叶中表达外源基因的napin启动子)、器官(例如，根)，特定发育时期或对特定外界刺激(例如，热激)有反应的启动子。
根据本发明特别优选的用于修饰的植物包括拟南芥、琉璃苣(Borago种)、Canola、蓖麻(Ricinus comm unis)、可可豆(Theobromacacao)、玉米(Zea mays)、棉花(Gossypium spp)、海甘蓝、萼距花种、亚麻(Linum种)、Lesquerella和Limnanthes种、linola、旱金莲(Tropaeolum种)、月见草、橄榄树(Olea种)、棕榈树(Elaeis种)、花生(Arachis种)、油菜籽、红花(Carthamus种)、大豆(Glycine和Soja种)、向日葵(Helianthus种)、烟草(Nicotiana种)、Vernonia种、小麦(Triticum种)、大麦(Hordeum spp)、水稻(Oryza种)、燕麦(Avena种)、高梁(Sorghum种)、黑麦(Secale种)或其它禾本科成员。
本发明当用于修饰油类种子作物产生的油类种子的产量或组成时特别有用。油类种子作物是那些能够以显著的商业产量产生可食用或工业用油类的植物品种，包括上述的很多植物品种。这样的油类种子作物为本领域技术人员所知。结果从拟南芥中分离TAG1(DGAT)cDNA既然AS11突变体最有可能的缺陷之一是由于DGAT本身(表1；图4)，因而发明人的克隆策略试图利用以与DGAT具有相同底物的特定酶的序列信息为基础。可用于此目的的侯选酶之一是酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACAT，EC 2.3.1.26)(Chang等，1997)。与DGAT类似，ACAT也是一种ER蛋白质，其功能是作为O-酰基转移酶，利用酰基辅酶A作为酰基供体使游离胆固醇发生酯化作用生成胆固醇酯。通过BLAST数据库检索，发明人鉴定出一种拟南芥表达的序列标记(EST)[目录号AA042298；SEQ ID NO6]，其推导出的氨基酸序列在EST的短序列(104个氨基酸残基)中，具有与酵母酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶相应片段41％的同源性(Yang等，1996；Yu等，1996)。
相应的cDNA(E6B2T7)克隆是从拟南芥生物资源中心(Columbus，Ohio)获得的。在完全测序的基础上发现878bp的E6B2T7克隆只是部分cDNA。不过，这部分cDNA的ORF预测确定了最初的EST检索结果，即所编码的产物在结构上与ACAT类似，特别是在C-末端。通过ORF检索，发明人确信该cDNA含有3｀非翻译区，尽管缺失了polyA尾巴。
发明人进而利用该部分cDNA序列以检索拟南芥基因组序列信息。鉴定出一个拟南芥｀IGF｀BAC克隆｀F27F23｀[目录号AC003058]，该克隆包含一个与该cDNA匹配的区域，因而得出结论这就是包含相应基因的区域。而且该BAC克隆｀F27F23｀是包含在YAC克隆，CIC06E08中，根据公布的基因图谱位置(http//weeds.mgh.harvard.edu/goodman/c2_b.html)，该YAC克隆代表了染色体II上位于35.9厘摩和38.7厘摩之间的区域；这个位置与TAG1的估计位置以及与根据AS11的突变鉴定的损伤(Katavic等，1995)类似。考虑到我们以前对AS11突变体表征的研究结果，该基因的图谱位置强烈的显示出它可能编码DGAT。
为了克隆全长度的cDNA，以位于覆盖该部分cDNA区域5｀上游不同位置的基因组序列为基础，设计了一系列寡聚核苷酸引物。我们将这些引物和一个位于该部分cDNA(E6B2T7)3｀UTR位置的引物结合起来使用进行PCR反应，该PCR反应的模板是由拟南芥(哥伦比亚生态型)长角果特异性cDNA文库(Giraudat等，1992)制备的cDNA噬菌粒。扩增得到的最长的cDNA长度为1904bp，我们将其命名为TAG1，然后保存在Genebank，其保藏号为AJ238008[SEQ ID NO1]。我们相信这段cDNA代表了一个全长的克隆，因为其大小与northern印迹(见图6a)中检测的转录产物的大小一致。最长的开放读码框架以一个134核苷长度的5｀非翻译区域和一个203核苷长度的3｀非翻译区域为侧翼序列。其中有一个框内终止密码子(TGA，位于nt-43位置上)，其后是一个位于nt-139位置上的框内ATG。因此可以推断出位于nt-139位置上ATG是起始密码子。TAG1的一级结构预测了一种DGAT相关的酶预测的TAG1 cDNA开放读码框架编码一个520个氨基酸残基的多肽，其计算出的分子量为58993道尔顿。通过BLAST检索程序(Altschul等，1990)发现最近报道的小鼠二酯酰甘油酰基转移酶[保藏号AF078752](Cases等，1998)是一种与推测的TAG1氨基酸序列(图5a)具有最高序列同源性的蛋白质。TAG1同样也与人酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶相关的酶(保藏号AF059202)类似。人酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶，也叫做ARGP1，是最有可能成为一个没有显著ACAT活性的DGAT，尽管该酶的确切本质还有待进一步确定(Oelkers等，1998)。TAG1和哺乳动物DGAT的相似性遍及一个长度超过400个氨基酸的区域，其序列同一性约41％。一个推定的二酯酰甘油/佛波醇酯结合基序，HKW-X-X-RH-X-Y-X-P，该基序是一个对DGAT唯一的而在ACTAs中不存在的标记序列(Oelkers等，1998)，被定位于414-424位氨基酸上([SEQ ID NO7]；图5a)。该二酯酰甘油结合基序也被发现在随后公布的欧洲油菜DGAT序列(Nikyiforuk等，1999；GenBank/EMBL保藏号AF155224，SEQ ID NO8；AF164434，SEQ ID NO9)中。在其它克隆的酰基转移酶(例如，GPATs、LPATs、二羟基丙酮磷酸酰基转移酶)中曾报道过在一个高度疏水性的区块IV中有一个保守不变的脯氨酸可能参与酰基辅酶A的结合(Lewin等，1999)。在TAG1序列中，位于氨基酸残基221-229位的疏水区块含有一个位于氨基酸残基224位保守不变的脯氨酸，该脯氨酸可能是上述基序的组成部分。
TAG1显示出和来源于许多种类的酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶的部分序列相似性(Chang等，1997)。不过，该相似性很大程度上局限于C-末端，而且低于(30％左右)TAG1和哺乳动物DGAT的相似性。
TAG1蛋白具有多个疏水性功能区(图5b)，而且通过PC Gene程序分析预测出该蛋白有5个可能的跨膜区段(178-195、233-253、363-388、433-476、486-507位氨基酸残基)。在哺乳动物的DGAT中，观察到一个推定的酪氨酸磷酸化基序(Cases等，1998)，但在TAG1中没有发现明显的酪氨酸磷酸化位点。不过，通过直观检查揭示了一段共有序列(X-L200-X-K202-X-X-S205-X-X-X-V209；SEQ IDNO10)，该序列被鉴定为一个SnRK蛋白激酶家族成员的典型目标基序，其中的205位丝氨酸残基是磷酸化作用的目标残基。SnRK1(SNF-1相关蛋白激酶-1)蛋白是一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，该蛋白越来越多的被证实参与植物体内的碳代谢的全局调控(Halford和Hardie，1998)。该共有的SnRK1目标基序同样也在随后公布的欧洲油菜DGAT序列中发现(Nikyiforuk等，1999；GenBank/EMBL保藏号AF155224；AF164434)。有趣的是，类似的SnRK1目标基序也可以在分别来源于椰子(Knutzon等，1995)和meadowfoam(Lassenr等，1995)的溶血磷脂酸酰基转移酶(LPATs)中被鉴定出来。TAG1基因在Arabidopsis中广泛表达通过进行Northern印迹分析以研究TAG1基因的表达特征。从不同的组织，包括根、叶、花、发育中的长角果、幼苗和发芽的种子中提取总RNA。TAG1转录产物最高的稳态水平积累是在从发芽和幼苗中提取的RNA中得到的(图6a)。在根、叶和花组织中也检测到TAG1转录产物，但含量水平都较低。令人惊奇的是，在发育中的长角果中TAG1基因的表达水平与其它的营养组织相当，但比发芽和幼苗的表达水平要低。这种表达特征总体上与认为DGAT存在于所有能够进行TAG生物合成的植物组织中的观念并不矛盾(Kwanyuan和Wilson，1986)。已经观察到在很多植物种类，包括大豆和红花中，发芽的种子活跃的合成TAGs(Ichihara和Noda，1981；Kwanyuan和Wilson，1986；Wilson和Kwanyuan，1986)。在根中存在的相对高水平的表达也与根质体能够合成大量的三酯酰甘油的事实相一致(Sparace等，1992)。
对经过一些包括BgIII、EcoRI和HindIII在内的限制性内切酶消化的基因组DNA进行Southern印迹杂交(Southern，1975)。TAG1基因没有内部的BgIII和HindIII位点，有一个内部EcoRI位点存在。我们的Southern分析结果显示出TAG1很有可能在Arabidopsis中是一个单拷贝基因(图6b)。在AS11突变体的TAG1基因中发现一个插入突变将基因组序列(保藏号AC003058；SEQ ID NO3)和TAG1 cDNA[SEQ ID NO1]序列进行对比，会发现TAG1基因含有16个外显子和15个内含子，跨越了一个长约3.4kb的区域(图7a)。将含有AS11的TAG1等位基因的DNA进行PCR扩增和完全测序。AS11的TAG1等位基因具有一个位于内含子2中间区域的147bp长度的插入序列。该插入序列是一个片断的复制，该片段由来自12bp的内含子1的3｀末端、整个外显子2序列(81bp)和54bp的内含子2的5｀末端组成(图7a)。
为了消除PCR伪迹的存在，共使用了两套引物以进行进一步的PCR扩增。引物A和B(见实验方法，引物策略)分别位于外显子1和3，他们扩增一个DNA片段，从AS11中扩增的该片段(图7b，泳道2)比从野生型中扩增的(图7b，泳道1)长150bp。第二对引物，C和B(实验方法)，一个可在外显子2和插入序列中找到，另一个位于外显子3，它们从AS11中产生两个扩增片段(图7b，泳道4)，而从野生型中只产生一个扩增片段(图7b，泳道3)。因此，这些结果证实了发明人通过序列分析鉴定得到的插入突变，反映了AS11基因组中TAG1基因上突变的确切本质。AS11 TAG1转录产物具有一个位于开放读码框架内的81bp插入序列Northern印迹分析显示TAG1基因在AS11突变株和野生型拟南芥中的表达特征没有差别。为了在转录水平上研究突变的作用，进行反转录PCR(RT-PCR)以从突变体AS11发芽幼苗中提取的RNA中扩增TAG1的转录产物。序列分析揭示了在AS11的转录产物中具有一个81bp的插入序列，该序列完全由外显子2组成。重复状态的外显子2进行了正确的剪切。因此，转录产物的改变并没有打乱读码框架。不过，在AS11转录产物中所述额外的外显子2序列将会导致产生一个改变了的DGAT蛋白，该蛋白具有27个氨基酸残基的插入131SHAGLFNLCVVVLIANVSRLIIENLMK157[SEQ ID NO11]。发明人的数据显示该插入导致了在种子发育过程中DGAT活性降低了40-70％(Katavic等，1995)。AS11中导致DGAT活性降低的81bp插入序列在RT-PCR产物的比较中可以看出(图7b比较泳道5(WT)和泳道6(AS11))。在AS11突变体中观察到的DNA畸变是未预期的，因为乙基甲磺酸盐(EMS)一般产生点突变。尽管我们不能排除该AS11突变体是自发突变事件的结果的可能性，不过EMS诱导的缺失和插入在其它系统中也有报道(Mogami等，1986；Okagaki等，1991)。拟南芥属突变体AS11中TAG1基因插入影响种子三酯酰甘油积累，但不影响种子中固醇酯的积累由于TAG1也表现出和一些物种的酰基辅酶A胆固醇酰基转移酶(ACATs)有一定程度的序列同源性(Chang等，1997)，发明人比较了野生型拟南芥和AS11突变体种子中的三酯酰甘油和固醇酯的积累。AS11中三酯酰甘油含量和TAG/DAG比例有所减少(即籽油中DAGs比例提高)，与之对照，WT和AS11种子中的固醇酯比例却相似，分别占总脂类提取物的0.8％和1％(表1)。如果TAG1损伤影响了ACAT一样活性，可以预期种子中固醇酯含量应该下降，但并未观察到。这些结果显示了TAG1没有涉及固醇-酯同化作用，因而不是一种酰基辅酶A固醇酰基转移酶。TAG1基因在酵母中的表达TAG1 cDNA在酵母中的过量表达与单纯质粒(pYES2)对照的转化体相比，会导致微粒体DGAT活性升高3.5-4倍(图8)，这个结果证实了TAG1基因产物的功能是作为DGAT。当把14C18∶1-辅酶A加入到酵母溶菌产物中，固醇酯在体外也会被标记上(数据未列出)，但是pYES2半乳糖诱导的对照和pYES2 TAG半乳糖诱导的转化体溶菌产物中产生的14C标记的固醇酯没有显著的差异。这个结果证实了TAG1产物不编码酰基辅酶A固醇酰基转移酶(如ACAT)。通过用DGAT cDNA转化拟南芥AS11突变系实现对其的互补如实验方法中所描述的，将克隆的全长DGAT cDNA用作PCR扩增的模板，以DGATXbal(DGATXbal(CTAGTCTAGAATGGCGATTTTGGA；SEQID NO12)和DGATXhol(GCGCTCGAGTTTCATGACATCGA；SEQ ID NO13)为引物以在该序列两端各提供一个新的限制位点。通过Xbal/Kpnl的消化切除掉一个1.6kb的片段，然后连接到pSE129载体(由P.Covello博士提供，PBI/NRC)中的相应位点上。pSE129A是一个来源于植物转化载体pRD400的载体(Detla等，1992)。pSE129A载体含有克隆到pRD400的EcoRI和HindIII位点上的种子特异性的napin启动子和nos终止子(图9)。因此，在DGAT-pSE129A结构中，拟南芥属DGAT cDNA是位于napin启动子控制之下。该结构的完整性通过序列分析确定。
如实验方法中所描述的，含有napinDGAT cDNA的pSE129A被导入到根癌农杆菌(A.tumefaciens)中，用于转化拟南芥突变体AS11和进行后代分析。分离到若干的T2转基因系，这些转基因系弥补了AS11中的脂肪酸突变表型(减少的20∶1以及升高的多不饱和C18s)，恢复野生型的脂肪酸特征(图10)。该发现证实了AS11中损伤的本质而且将AS11脂类表型和该突变体联系起来。DGAT cDNA在野生型拟南芥中的过量表达如实验方法中所描述的，将克隆的全长DGAT cDNA用作PCR扩增的模板，以DGATXbal(CTAGTCTAGAATGGCGATTTTGGA；SEQ ID NO12)和DGATXhol(GCGCTCGAGTTTCATGACATCGA；SEQ ID NO13)作为引物用于在该序列两端各提供一个新的限制位点。通过Xbal/Kpnl的消化切除掉一个1.6kb的片段，然后连接到pSE129载体(由P.Covello博士提供，PBI/NRC)中的相应位点上。pSE129A是一个来源于植物转化载体pRD400的载体(Detla等，1992)。pSE129A载体含有种子特异性的napin启动子和克隆到pRD400的EcoRI和HindIII位点上的nos终止子(图9)。因此，在DGAT-pSE129A结构中，拟南芥属DGAT cDNA是位于napin启动子控制之下。该结构的完整性通过序列分析确定。
如实验方法中所描述的，含有napinDGAT cDNA的pSE129A被导入到根癌农杆菌中，用于转化拟南芥突变体AS11和进行后代分析。分离到若干T2转基因系，这些转基因系显示出油含量的升高(图11)，100粒种子的平均重量增加(图12)，以及在上述两个特性之间强烈的线性相关(图13)。
在脂肪酰基组成方面，含有过量表达的DGAT cDNA的野生型系显示出总饱和度的下降、单不饱和脂肪酸和18∶1/[18∶2+18∶3]指数的增加，如下表2所示。这样的改变是朝向“更为健康”的油类特征方向，而且可以直接用于canola或其它十字花科含油种子以及其他可食用油类作物中，以产生类似的油类组成改善。
表2拟南芥未转化野生型对照(WT Con)和3个napin启动子控制下DGAT cDNA转化(napinDGAT)得到的T2转基因系(2｀、9和11)的籽油脂肪酸组成

a包括16∶0、18∶0、20∶0、24∶0b包括18∶1、20∶1、22∶1、24∶1c([Wt％18∶1]+[Wt％18∶2+Wt％18∶3])×100实验方法植物材料拟南芥哥伦比亚生态型(Arabidosis thaliana ecotypeColumbia)和突变体AS11是在前述的条件(Katavic等，1995)下进行种植培育的。如Katavic等所述(1995)；(ATCC NOPTA-1013)，拟南芥突变体系AS11是相对于野生型拟南芥哥伦比亚生态型而产生和表征的。DNA操作DNA制备、质粒扩增和分离是按照标准方法和步骤进行的(Sambrook等，1989)。测序是在一台Applied Biosystem公司的型号为373A的DNA测序系统上使用Taq DyeDeoxyTM终止循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Inc.)进行的。核苷酸和推导出的氨基酸序列通过BLAST程序与数据库中的现有序列进行比较(Altschul等，1990)。Southern和Northern分析在不同发育阶段的不同组织的总RNA通过使用Lindstrom和Vodkin(1991)的方法进行提取。RNA样品用甲醛变性然后在1.2％的甲醛-琼脂糖凝胶上进行分离。总RNA的上样量约为5μg，每个泳道的RNA量通过rRNA带的溴化乙锭染色强度进行校正。根据Sambrook等(1989)的方法，分离基因组DNA，并用限制性内切酶进行消化以及进行Southern印迹分析。TAG1 DNA探针根据制造商(BRL)的说明通过随机起始用32P进行标记。PCR策略用于扩增TAG1基因的引物如下DGAT1(AGACACGAATCCCATTCCCACCGA；SEQ ID NO14)、DGAT2(AGTGGTGACAACGCAGGGATGATG；SEQ ID NO15)、DGAT3(ATGGTCGCTCCCACATTGTGT；SEQ ID NO16)、DGAT4(CATACAATCCCCATGACATTTATCA；SEQ IDNO17)。DGAT1和DGAT2扩增TAG1基因的5｀部分，DGAT3和DGAT4扩增TAG1基因的3｀部分。AS11的基因组DNA用作PCR扩增突变体AS11等位基因的模板，使用的温度条件如下94℃ 3分钟；94℃ 30秒、62℃ 45秒、72℃ 1分钟进行40个循环；72℃ 15分钟。为了进一步证实该突变，将引物A(CGACCGTCGGTTCCAGCTCATCGG；[SEQ IDNO18])和引物B(GCGGCCAATCTCGCAGCGATCTTG；[SEQ ID NO19])以及引物C(TAAACAGTAGACTCATCATCG；[SEQ ID NO20]和引物B分别组成引物对，用于扩增含有该突变的内部片段。引物DGAT1和DGAT4用于进行的cDNA PCR扩增是以拟南芥长角果cDNA文库为模板进行的。引物A和B也是用于RT-PCR扩增包含插入片段的cDNA片段。TAG1多拷贝载体的构建和转化以及DGAT在酵母中表达的表征按照Hadjeb和Berkowitz的描述(Hadjeb和Berkowitz，1996)将TAG1 cDNA克隆到pBluescript SK中。该cDNA是用Kpnl/Xal从所述载体中切出来的，然后克隆到酵母表达载体pYes2(Invitrogen)的相应位点上。通过测序进行确认该结构。在GAL1启动子控制下，具有TAG1的结构的转录释放出一个约1.9kb的片段。由于该TAG1片段有自己的起始ATG启动子，因此所表达的产物不是一种融合蛋白。使用一个SLC缺失菌株(YMN5[slcΔ2LEU2 ura3])(由M.M Nagiec和R.C.Dickson捐赠，University of Kentucky，Lexington，KY；Nagiec等，1993)作为酵母表达系统的宿主。我们推断在这个突变体中，内源DAG代谢库水平应该比野生型酵母的低，因而这就允许我们在对转化体裂解液进行体外DGAT分析时，可以在外源提供的14C-DAG存在的条件下，通过过度表达TAG1以使其活性最大化。酵母的转化是根据Elble(1992)的方法进行的。仅含有载体(pYES2)的YMN5转化体被用作对照。将单菌落在20毫升SD培养基(合成葡萄糖培养基，加入葡萄糖、不含尿嘧啶，如Ausubel等所描述，1995，Vol.2 p.13.1.3)中于28℃条件下在摇床(270rpm)上培养过夜。将细胞从过夜培养物中沉淀然后重悬于50毫升表达诱导培养基(含有半乳糖不含尿嘧啶的SD培养基)中。细胞在上述表达诱导培养基中于28℃、270rpm摇床转速条件下继续培养4-6小时，然后收获。半乳糖诱导的酵母转化体通过离心收集(5000rpm、5分钟)，然后重悬于pH为7.4、含有1mM EDTA和1mM DTT的100mMHepes-NaOH溶液中。细胞裂解液通过使用如Ausubel等(1995)所描述的酸洗玻璃珠方法制备。酵母裂解液中的蛋白质使用Bradford(1976)分析法测定，将每一份裂解液中的蛋白质水平标准化然后按下文所述测定等分试样(250μg蛋白质)的DGAT活性。脂类底物和DGAT分析14C标记的甘油二油酸酯[1-14C油酸](Sp.活性55mCi/mmol)购自American Radiolabeled Chemicals(St.Louis，MO)。按照Taylor等的方法(1991)，如Taylor等所述(1991)将14C标记的sn-1，2-甘油二油酸酯异构体通过在铺满硼酸盐的板上的薄层层析进行纯化，然后在含有0.2％吐温-20的Hepes缓冲液中进行乳化。20∶1-辅酶A、辅酶ASH、ATP和其他生化试剂均购自Sigma公司。
DGAT分析在pH7.4、摇床转速100rpm、30℃的水浴条件下进行30-60分钟。分析混合物(0.5毫升终体积)含有裂解液蛋白质(250μg)、90mM Hepes-NaOH、0.5mM ATP、0.5mM CoASH、1mM MgCl2、200μM sn-1，2-甘油二油酸酯(sp.活性2nC/nmol)于0.02％吐温20中，其中18μM20∶1-辅酶A作为酰基供体。14C标记的TAGs按照Taylor等的方法(1991)，通过薄层层析分离，然后定量。AS11和WT中脂类和固醇酯的进一步分析按照Taylor等(1991；1992)和Katavic等(1995)的方法进行WT和AS11突变体中总脂类的提取物(TLEs)和脂类分类分析。相对籽油含量按照Ruter的方法(1989)通过magic angle(幻角？)样品自旋1H-NMR进行测定。将完整的野生型和AS11突变体种子的200粒种子的样品在运行条件设定为360MHz的Bruker AM宽内径光谱分析仪(Bruker Analytische Masstechnik GHBH，Silberstreifen D-76287，Rheinstetten4/Karlstuhe，Germany)中进行分析。为了减小各向异性的线扩展，将种子样品在锆转子上与磁场呈54.7度方向按照1kHz为单位进行旋转。将由于液体状油类产生的共振综合反应相加，将AS11种子得到的数值以相对于野生型对照种子样品反应的方式进行记录，将后者设为1.00。
将固醇酯类通过Silica H板上的薄层层析从TLEs中分离出来，该层析用正己烷∶二乙醚∶甲酸(80∶20∶2，v/v/v)展开。将固醇酯从silica H上用氯仿∶甲醇(2∶1，v/v)洗脱后，通过皂化作用和随后3N甲醇盐酸对得到的脂肪酸的甲基化作用对固醇酯进行定量。该脂肪酸甲酯(FAMEs)通过前述的GC(Taylor等，1991)进行分析。通过皂化作用释放游离固醇也通过GC在一个30m DB-5柱子上进行分析，GC温度控制程序为起始温度180℃，以10℃/分钟速度将温度提高到300℃，然后在此温度下维持15分钟。固醇酯含量以％TLE形式报道，即，计算从固醇酯中释放的FAMEs占从总脂类提取物(TLE)通过转甲基作用释放的FAMEs的比例。含有用于在野生型拟南芥中过量表达的和对拟南芥AS11突变株进行互补的野生型DGAT基因的植物转化载体的构建两个引物Gen1(GAGAGGATCCACGCTCACGACCCATTCTTCCCG；[SEQ ID NO21])和Gen2(AAGAAGGATCCATCCCCAAAACGGGACCACCAA；[SEQ ID NO22])是根据TAG1基因上游和下游的序列进行合成的。这两个引物用于PCR扩增一个来源于野生型拟南芥的5.1kb的基因组片段。该PCR片段用BamHI进行纯化和消化，然后插入到质粒pRD400(Datla等，1992)上的相应位点，以产生植物转化载体DGATg-pRD400。
用于种子特异性表达的DGAT cDNA植物转化载体的构建将克隆得到的全长DGAT cDNA用作PCR扩增的模板，以DGATXbal(CTAGTCTAGAATGGCGATTTTGGA；SEQ ID NO12)和DGATXhol(GCGCTCGAGTTTCATGACATCGA；SEQ ID NO13)作为引物用于在该序列两端各提供一个新的限制位点。PCR参数特征如下94℃ 1分钟；94℃ 30秒、55℃ 30秒、72℃ 1分钟进行30个循环；72℃ 1分钟；和72℃ 5分钟。接着将得到的PCR产物连接到PCR-2.1载体(InVitrogen)中。通过Xbal/Kpnl的消化切下一个1.6kb的片段，将该片段连接到pSE129载体(由P.Covello博士提供，PBI/NRC)中相应的位点上。pSE129A是一个来源于植物转化载体pRD400的载体(Dalta等，1992)。pSE129A载体含有克隆到pRD400的EcoRI和HindIII位点上的种子特异性的napin启动子和nos终止子(图9)。因此，在DGAT-pSE129A结构中，拟南芥属DGAT cDNA是位于napin启动子控制之下。该结构的完整性通过序列分析确定。用植物DGAT载体结构转化农杆菌属通过如下步骤制备用于电穿孔的农杆菌属细胞株，GV3101(pMP90)将农杆菌属培养物在2YT培养基中培养24到48小时，当600nm的吸光度达到0.5-0.7时，将细胞在冰上冷却然后通过离心(5000×g，4℃下在GSA转子中离心10分钟)使之沉淀。将沉淀物分别用1、0.5和0.02体积的10％无菌的冷甘油洗涤，然后重悬于0.01体积的10％冷甘油中。接着将得到的可用于电穿孔细胞在液氮中冷冻然后保存于-70℃条件下。按照制造商的说明将农杆菌属细胞用20～50ng转化DNA(DGATg-pRD400或DGAT-pSE129A)通过电穿孔法进行转化，铺平板于选择性培养基(LB加入50μg/ml卡那霉素)上，然后在28℃条件下培养过夜。将单转化细胞在加入50μg/ml卡那霉素和25μg/ml庆大霉素的5ml LB中培养过夜(28℃，225rpm)。DNA提取和纯化用Qiaprep Spin Miniprep试剂盒进行(Qiagen)。该结构的忠实度通过在植物转化前的DNA测序进行复核。拟南芥的转化转化操作的方案根据Clough和Bent的方案(1998)进行修改而得到。拟南芥哥伦比亚生态型和突变体AS11(Katavic等，1995)的种子生长在22℃，荧光照明(120μE·m-2·s-1)，照明方案为16小时光照/8小时黑暗。典型的，4到6株植株生长在一个10cm2的小罐内的潮湿的Terra-lite Redi-earth中(W.R.Grace & Co.Canada Ltd.Ajax，ON，Canada)。为了防止罐中的土壤混合物掉入培养介质中，将土壤堆成一个平台后把种子撒播于其上部，然后用一个尼龙窗纱覆盖在罐子上，用橡皮筋扎紧。当植物的第一朵花开放时，将植株在农杆菌悬浮液进行真空渗入。
为了使农杆菌生长，将5ml用含有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml庆大霉素的LB培养基制成的细菌悬浮液于28℃条件下培养过夜。在渗入操作前一天，将上述“种子培养物”分到4个含有250ml LB培养基并补充有50μg/ml卡那霉素和25μg/ml庆大霉素的培养瓶中。将这些培养物在28℃条件下培养过夜。第二天早上，检测过600nm的吸光度(约为1.0)后，通过离心(5000×g，室温条件下在GSA转子中离心10分钟)收集细胞，然后用渗入培养基(5％蔗糖；0.005％Silwet-77的水溶液)重悬细胞沉淀使其在600nm的光学密度达到0.8。将农杆菌悬浮液转移到烧杯中，再将小罐中的植株倒置放到烧杯中使花和茎浸入到悬浮液中。然后将烧杯放置到一个大的玻璃钟罩内，用真空泵抽真空，直到在茎的表面出现气泡而且整个溶液开始轻微冒泡为止，然后将真空迅速解除。[注所需要的压力和时间会随实验室条件而变化，但好的渗透结果象均匀变黑、被水渗透的组织，是明显可见的。]将小罐从烧杯上移开，侧放在塑料盘中并用塑料圆盖覆盖以维持湿度。第二天，按照Katavic等(1995)的描述，除去植物上的圆盖，直立放置并于生长室内在连续光照条件下生长约4个星期。当长角果实成熟并变干后，收集种子并挑选阳性转化体。推测的转化体(转基因植株)的选择和转基因植株的分析对每一种结构都收集大量的种子。将种子浸入含有20％漂白粉和0.01％Triton X-100的溶液20分钟进行表面消毒，然后用无菌水清洗3次。将消毒后的种子在室温条件下通过重悬于0.1％无菌phytagar中(每500-1000个种子大约用1ml phytagar)进行种板，然后将含有2,000-4,000颗种子的一个体积接种到150×15mm的卡那霉素选择平板上。将平板在寒冷无光处培养2天，然后在一个人工控制的环境下(22℃条件下，以16小时光照/8小时黑暗的方式进行荧光照射120μE·m-2·s-1)生长7-10天。选择培养基含有MSG培养基、0.8％phytagar、3％蔗糖、50μg/ml卡那霉素和50μg/ml特美汀。将培养皿和盖子用MircroporeTM医用橡皮膏(3M，Canada，London，ON，Canada)密封。7-10天后，具有绿色叶子和培养基内生长良好根系的药物抗性植株被鉴定为转化体，并且在3-5片叶期，将挑选出的转化体移植到装满高湿度泥土混合物的浅箱中。转化体生长到成熟阶段后，从个体植株中收集成熟的种子(如Katavic等的描述的T2代)进行进一步分析。从转化体分离DNA和转化体的分析按照Dellaporta等(1983)方法从个体T1植株中分离基因组DNA。用前述的用于扩增DGAT cDNA或DGAT基因的成对引物进行PCR扩增反应，用于确定该cDNA或基因在T1转化体内的存在进行Southern分析(Southern，1975)以挑选含有单拷贝插入片段的转化体。用限制性内切酶(DGAT cDNA用Bgl II，DGAT基因用Eco RI)消化DNA样品，在1％的琼脂糖凝胶上电泳分离，然后根据Sambrook等(1989)的方法用尼龙滤膜(Hybond-N+，Amersham)进行Southern印迹。将用随机引物DNA标记试剂盒(Gibco BRL)得到的α-[32P]dCTP(NEN/DuPont)标记的DGAT cDNA片段用作探针。根据Church和Gilbert(1984)的方法在60℃条件下进行杂交反应。然后用滤膜对于Kodak X-OMAT-AR底片进行日光。
保藏物信息下面的生物材料被保藏在美国典型培养物保藏中心(ATCC)(10801 University Boulevard，Manassas，Virginia，20110-2209，U.S.A.)。所有这些保藏物从所示的日期开始，按照布达佩斯条约的条款代表了申请人/受让人(National Research Council ofCanada)的利益，并被给予了如下所示的保藏号。保藏材料 保藏日期 保藏号拟南芥DGAT基因1999年11月29日 PTA-988拟南芥DGAT cDNA 1999年11月29日 PTA-989拟南芥AS11种子1999年12月3日 PTA-1013保藏物收据稍后在本说明中显示。序列表自由原文下面所提供的序列表含有关于SEQ ID NOs12到20的自由原文项目。序列表所用的自由原文重复如下SEQ ID NO12 DGATXbal引物SEQ ID NO13 DGATXhol引物SEQ ID NO14 引物DGAT1SEQ ID NO15 引物DGAT2SEQ ID NO16 引物DGAT3SEQ ID NO17 引物DGAT4SEQ ID NO18 引物ASEQ ID NO19 引物BSEQ ID NO20 引物CSEQ ID NO21 引物Gen1SEQ ID NO22 引物Gen2。
为了方便审阅在下面提供了所有列出序列的总结SEQ ID NO1-(pDGAT；含有经过分离和纯化的脱氧核糖核酸cDNA；ATCC No PTA-989)，Genbank/EMBL保藏号AJ238008。
SEQ ID NO2-推测的拟南芥DGAT(AtTAG1)蛋白质的氨基酸序列。
SEQ ID NO3-(p基因组DGAT；含有经过分离和纯化的基因组脱氧核糖核酸(基因组DNA)ATCC No PTA-989)SEQ ID NO4-MDGAT，小鼠DGAT[Genbank/EMBL保藏号AF078752(Cases等，1998)]。
SEQ ID NO5-HARGP1，人ARGP1蛋白[Genbank/EMBL保藏号AF059202；Oelkers等，1998]。
SEQ ID NO6-拟南芥表达的序列标记(EST)[保藏号AA042298]。
SEQ ID NO7-在SEQ ID NO2、SEQ ID NO8和SEQ ID NO9中发现的二酯酰甘油/佛波醇酯结合基序(414HKWMVRHIYFP424)。
SEQ ID NO8-欧洲油菜DGAT氨基酸序列，Genbank/EMBL保藏号AF155224。
SEQ ID NO9-欧洲油菜DGAT氨基酸序列，Genbank/EMBL保藏号AF164434。
SEQ ID NO10-在SEQ ID NO2、SEQ ID NO8和SEQ ID NO9中发现的SnRK1蛋白激酶家族成员典型的目标基序X-L200-X-K202-X-X-S205-X-X-X-V209。
SEQ ID NO11-在拟南芥AS11突变体中发现的SEQ ID NO2中27个氨基酸的插入重复。
131SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK157SEQ ID NO12-CTAGTCTAGAATGGCGATTTTGGA(引物DGATXbal的核苷酸序列)。
SEQ ID NO13-GCGCTCGAGTTTCATGACATCGA(引物DGATXhol的核苷酸序列)。
SEQ ID NO14-AGACACGAATCCCATTCCCACCGA(引物DGAT1的核苷酸序列)。
SEQ ID NO15-AGTGGTGACAACGCAGGGATGATG(引物DGAT2的核苷酸序列)。
SEQ ID NO16-ATGGTCGCTCCCACATTGTGT(引物DGAT3的核苷酸序列)。
SEQ ID NO17-CATACAATCCCCATGACATTTATCA(引物DGAT4的核苷酸序列)。
SEQ ID NO18-CGACCGTCGGTTCCAGCTCATCGG(引物A的核苷酸序列)。
SEQ ID NO19-GCGGCCAATCTCGCAGCGATCTTG(引物B的核苷酸序列)。
SEQ ID NO20-TAAACAGTAGACTCATCATCG(引物C的核苷酸序列)。
SEQ ID NO21-GAGAGGATCCACGCTCACGACCCATTCTTCCCG(引物Gen1的核苷酸序列)。
SEQ ID NO22-AAGAAGGATCCATCCCCAAAACGGGACCACCAA(引物Gen2的核苷酸序列)。
SEQ ID NO23-AS11突变体DGAT cDNA核苷酸序列。
SEQ ID NO24-AS11突变体DGAT基因组DNA核苷酸序列。
SEQ ID NO25-由SEQ ID NO23推导出的氨基酸序列。
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上述参考文献的内容在此引入作为参考。
序列表<110>National Research Council of CanadaZou，JitaoTaylor，David CWei，YangdouJako，Colette C<120>来源于植物的二酯酰甘油转酰基酶<130>43922pt<140>PCT/CA<141>1999-12-16<150>60/112，812<151>1998-12-17<160>25<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1904<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<214>拟南芥<400>1atttcttagc ttcttccttc aatccgctct ttccctctcc attagattct gtttcctctt 60tcaatttctt ctgcatgctt ctcgattctc tctgacgcct cttttctccc gacgctgttt 120cgtcaaacgc ttttcgaaat ggcgattttg gattctgctg gcgttactac ggtgacggag 180aacggtggcg gagagttcgt cgatcttgat aggcttcgtc gacggaaatc gagatcggat 240tcttctaacg gacttcttct ctctggttcc gataataatt ctccttcgga tgatgttgga 300gctcccgccg acgttaggga tcggattgat tccgttgtta acgatgacgc tcagggaaca 360gccaatttgg ccggagataa taacggtggt ggcgataata acggtggtgg aagaggcggc 420ggagaaggaa gaggaaacgc cgatgctacg tttacgtatc gaccgtcggt tccagctcat 480cggagggcga gagagagtcc acttagctcc gacgcaatct tcaaacagag ccatgccgga 540ttattcaacc tctgtgtagt agttcttatt gctgtaaaca gtagactcat catcgaaaat 600cttatgaagt atggttggtt gatcagaacg 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33<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列描述引物Gen2<400>22aagaaggatc catccccaaa acgggaccac caa<210>23<211>1985<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<214>拟南芥<400>23atttcttagc ttcttccttc aatccgctct ttccctctcc attagattct gtttcctctt 60tcaatttctt ctgcatgctt ctcgattctc tctgacgcct cttttctccc gacgctgttt 120cgtcaaacgc ttttcgaaat ggcgattttg gattctgctg gcgttactac ggtgacggag 180aacggtggcg gagagttcgt cgatcttgat aggcttcgtc gacggaaatc gagatcggat 240tcttctaacg gacttcttct ctctggttcc gataataatt ctccttcgga tgatgttgga 300gctcccgccg acgttaggga tcggattgat tccgttgtta acgatgacgc tcagggaaca 360gccaatttgg ccggagataa taacggtggt ggcgataata acggtggtgg aagaggcggc 420ggagaaggaa gaggaaacgc cgatgctacg tttacgtatc gaccgtcggt tccagctcat 480cggagggcga gagagagtcc acttagctcc gacgcaatct tcaaacagag ccatgccgga 540ttattcaacc tctgtgtagt agttcttatt gctgtaaaca gtagactcat catcgaaaat 600cttatgaaga gccatgccgg attattcaac ctctgtgtag tagttcttat tgctgtaaac 660agtagactca tcatcgaaaa tcttatgaag tatggttggt tgatcagaac ggatttctgg 720tttagttcaa 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ttcaagctat gggcttttct tgggattatg 1620tttcaggtgc ctttggtctt catcacaaac tatctacagg aaaggtttgg ctcaacggtg 1680gggaacatga tcttctggtt catcttctgc attttcggac aaccgatgtg tgtgcttctt 1740tattaccacg acctgatgaa ccgaaaagga tcgatgtcat gaaacaactg ttcaaaaaat 1800gactttcttc aaacatctat ggcctcgttg gatctccgtt gatgttgtgg tggttctgat 1860gctaaaacga caaatagtgt tataaccatt gaagaagaaa agaaaattag agttgttgta 1920tctgcaaaaa ttttggtaga gacacgcaaa cccgtttgga ttttgttatg gtgtaaagcg 1980gccgc 1985<210>24<211>5339<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<214>拟南芥<400>24gctcacgacc cattcttccc gttccatttg gttttattta tttcaaagtt taatattcct 60tttgtataac attcaaatct tcacatgatt gattgtgtga aaaccccaca gattttacta 120caataggggg agttgactta aaatagctat tgatgtcgaa aaaatgtatt ttagttataa 180attatactaa agaaaatttt tgatttgtct gttgtttaag catatgtatt gttaaactta 240aaaaaatatg tattgttaat cttaaaaatg taggagtaca catcaaatac tcgagcataa 300tcaaaaccgt attcatagac cgatgtgaga atcaaataga agataatgtg attttttaaa 360atatcgtatc tccaaatcaa tcacttagaa gataatgtaa ttctttatgt gctacataaa 420taaatatata tatatatata tatatatatc ttgtatatat gtcttgacaa aaaattgcca 480gtcaaaaacc atgactgaat caaactataa gtcggattga atcaaactat aagtcggatg 540agtattaatt tccattatgt ttctatactt tacaaaccgg aaaatagata ttatagatac 600caaaaaagta gatttgtgta tattattaga agatttggaa tttcatcatt atcaggatct 660aaagtacttc cctaattaaa tcatgtcggt tgaaaaagct caatgaatgt ttgaaatttg 720gaaagtttat taaattcgga tctttttttt ttgtttgtcg tcccaaacat ttttatttta 780ttacaaataa tcaacttatc cttactacta aatcatttca tatctttgat accaacaaat 840catttcatat tctattttga tgtttaagaa aacactattt accagttaca aaatattata 900aggattgttg tttagaaaaa aaagtacaag ttgaattctt tttgtcaaat ataaaattga 960ctttttaata tataattgac ttattgaaca tgattacaga attaatcatc tacaaaactt 1020tccaagttta taataaatac atttcaaaga ctattagttc ttcttaaaat atttctaaaa 1080gtgatcaaag actaccacat ataattcaga aaaagtagaa gttgatttct ttttgtcaaa 1140taaataattg acttaaaata gtttggaaag ccattgaact tgattataga attgataatg 1200tacataaaaa aattccaagt ttataataaa tacatttttc aaatgctata tcagttcttc 1260ttaaaatatt tcactaaaaa aacactcaaa tatagaataa atttattgaa taacatacca 1320actgtaaaac agaatttgac aaaaaaaaaa aaaaaatgaa atgaagatga agacaaaaat 1380aaatcaccag aggatcttat gcaaaaaaat atatgaatac acaataaacc atattgatat 1440ttttaaaata aaataaaaac agaaaaatat cccaacaccg cttttcaatt aaaaatcttc 1500cgtcaccatt gttgtcatct tcctctctcg tgaatccttt ttcctttctt cttcttcttc 1560tcttcagaga aaactttgct tctctttcta taaggaacca gacacgaatc ccattcccac 1620cgatttctta gcttcttcct tcaatccgct ctttccctct ccattagatt ctgtttcctc 1680tttcaatttc ttctgcatgc ttctcgattc tctctgacgc ctcttttctc ccgacgctgt 1740ttcgtcaaac gcttttcgaa atggcgattt tggattctgc tggcgttact acggtgacgg 1800agaacggtgg cggagagttc gtcgatcttg ataggcttcg tcgacggaaa tcgagatcgg 1860attcttctaa cggacttctt ctctctggtt ccgataataa ttctccttcg gatgatgttg 1920gagctcccgc cgacgttagg gatcggattg attccgttgt taacgatgac gctcagggaa 1980cagccaattt ggccggagat aataacggtg gtggcgataa taacggtggt ggaagaggcg 2040gcggagaagg aagaggaaac gccgatgcta cgtttacgta tcgaccgtcg gttccagctc 2100atcggagggc gagagagagt ccacttagct ccgacgcaat cttcaaacag gtttaaaatc 2160tcagaaatct tcgaatttgg tgtttgcttg ttgttttata tggaattgag tttggtgatt 2220gttttgcatt gcagagccat gccggattat tcaacctctg tgtagtagtt cttattgctg 2280taaacagtag actcatcatc gaaaatctta tgaaggtttg ctgttacttg tttctccttt 2340taggaattga attgcttgaa aatttatcat tgcattgcag agccatgccg gattattcaa 2400cctctgtgta gtagttctta ttgctgtaaa cagtagactc atcatcgaaa atcttatgaa 2460ggtttgctgt tacttgtttc tccttttagg aattgaattg cttgaaaatt tatcagagac 2520gaataacttt gttgttgcta tcattcatgt agtatggttg gttgatcaga acggatttct 2580ggtttagttc aagatcgctg cgagattggc cgcttttcat gtgttggtaa aagaagatgt 2640tttttatttc cagcaatgtt acattgttat acgtataatg atgagtttag tgatcaagtt 2700cctctttgat tcttctttct tgttgcagta tatccctttc gatctttcct ttggctgcct 2760ttacggttga gaaattggta cttcagaaat acatatcaga acctgtgagt aattactatt 2820ctccagccat tactgtaatt tttattgaag acaagtttgt atcatgaaga acttacaagt 2880tctgttttga aaatgctcaa ggttgtcatc tttcttcata ttattatcac catgacagag 2940gttttgtatc cagtttacgt caccctaagg tgatactgtt tttctggtct cagtttgtga 3000tactgttttt aagtttagtt gtctgacccg gtgatcttga aaatggacag gtgtgattct 3060gcttttttat caggtgtcac tttgatgctc ctcacttgca ttgtgtggct aaagttggtt 3120tcttatgctc atactagcta tgacataaga tccctagcca atgcagctga taaggtaaaa 3180tacgaaaaag aagcgtatgt attagtcact tgcactgtgt tactgtttta accaaacact 3240gttatgaact ttaggccaat cctgaagtct cctactacgt tagcttgaag agcttggcat 3300atttcatggt cgctcccaca ttgtgttatc aggtaactgc aaagtgcatc aaccattctt 3360atacttgcaa gagtttcttg tctaaacctc ggatctttgc ttttccccag ccaagttatc 3420cacgttctgc atgtatacgg aagggttggg tggctcgtca atttgcaaaa ctggtcatat 3480tcaccggatt catgggattt ataatagaac aagtacgttt tcacatcttg ctttattagt 3540tttccttggt gaaaatcatc atccctgcgt tgtcaccact tgacttcatg ttcttttgtt 3600acattttggc agtatataaa tcctattgtc aggaactcaa agcatccttt gaaaggcgat 3660cttctatatg ctattgaaag agtgttgaag ctttcagttc caaatttata tgtgtggctc 3720tgcatgttct actgcttctt ccacctttgg tatgctgtga tcccatctct ttcaaaataa 3780tttgcaaatt cgaaaaaccg aaaaaggcta aatctcatac gaatttgata tttttagttt 3840cttagagtcg gtgatgtaat ttcagttact gaacgcaaat ctcttgtcca aaggttaaac 3900atattggcag agcttctctg cttcggggat cgtgaattct acaaagattg gtggaatgca 3960aaaagtgtgg gagatgtgag ctattttact caaaagaaaa cttatgattt ttaatgttgt 4020cgttgttttt gggtcatcta actaaccaaa ttcatgtatt cactgtcttc ctttatcagt 4080actggagaat gtggaatatg gtatggttct cttcctaaac atcaccttct tttgtacaca 4140aaatagaaga agagagctaa ttaagatctt gttttccttg acagcctgtt cataaatgga 4200tggttcgaca tatatacttc ccgtgcttgc gcagcaagat accaaaggtg agtgagatat 4260ataccgatat gcaattgtcg agatttgttt ctgtgatata aatttaaccc tccacacact 4320tgtttttcag acactcgcca ttatcattgc tttcctagtc tctgcagtct ttcatgaggt 4380atacatactt tctacattgc cctgtctcta gacgcatgaa cacacgctag tgaaagaaat 4440gctaatattc aaagcattgt ttttacttaa cgatcttgtg ttacaaattt ccttttgaca 4500gctatgcatc gcagttcctt gtcgtctctt caagctatgg gcttttcttg ggattatgtt 4560tcaggttaaa aaattactaa actgctgcag tcgattttta ctaaactcta atctcatatt 4620ctgaccaacc aatttgtttg agtaggtgcc tttggtcttc atcacaaact atctacagga 4680aaggtttggc tcaacggtat gctctcaaaa cccgagaaaa tagaacgaat aactctttct 4740ttcatagcct agccatttaa atcgcaatgc tgaaacttaa taataaaggt gatctgtttt 4800ggaatgggat catattatta ggtggggaac atgatcttct ggttcatctt ctgcattttc 4860ggacaaccga tgtgtgtgct tctttattac cacgacctga tgaaccgaaa aggatcgatg 4920tcatgaaaca actgttcaaa aaatgacttt cttcaaacat ctatggcctc gttggatctc 4980cgttgatgtt gtggtggttc tgatgctaaa acgacaaata gtgttataac cattgaagaa 5040gaaaagaaaa ttagagttgt tgtatctgca aaaattttgg tagagacacg cgaacccgtt 5100tggattttgt tatggtgtaa agaaatttca atcaaaaaac tgttgtaata attgttacca 5160aaaagaaatg cttttctgga aacgagggga aaaatagtag ttttgttagg ttttactgtt 5220tggaccaaat ctagtaaaaa actttttgta ataaggaaaa aaaaagaaca aatgtgataa 5280atgcatgggg attgtatgaa accttccaat aaagttgatt ggtggtcccg ttttgggga 5339<210>25<211>547<212>PRT<213>Arabidopsis thaliana<14>拟南芥<400>25Met Ala Ile Leu Asp Ser Ala Gly Val Thr Thr Val Thr Glu Asn Gly1 5 10 15Gly Gly Glu Phe Val Asp Leu Asp Arg Leu Arg Arg Arg Lys Ser Arg20 25 30Ser Asp Ser Ser Asn Gly Leu Leu Leu Ser Gly Ser Asp Asn Asn Ser35 40 45Pro Ser Asp Asp Val Gly Ala Pro Ala Asp Val Arg Asp Arg Ile Asp50 55 60Ser Val Val Asn Asp Asp Ala Gln Gly Thr Ala Asn Leu Ala Gly Asp65 70 75 80Asn Asn Gly Gly Gly Asp Asn Asn Gly Gly Gly Arg Gly Gly Gly Glu
85 90 95Gly Arg Gly Asn Ala Asp Ala Thr Phe Thr Tyr Arg Pro Ser Val Pro100 105 110Ala His Arg Arg Ala Arg Glu Ser Pro Leu Ser Ser Asp Ala Ile Phe115 120 125Lys Gln Ser His Ala Gly Leu Phe Asn Leu Cys Val Val Val Leu Ile130 135 140Ala Val Asn Ser Arg Leu Ile Ile Glu Asn Leu Met Lys Ser His Ala145 150 155 160Gly Leu Phe Asn Leu Cys Val Val Val Leu Ile Ala Val Asn Ser Arg165 170 175Leu Ile Ile Glu Asn Leu Met Lys Tyr Gly Trp Leu Ile Arg Thr Asp180 185 190Phe Trp Phe Ser Ser Arg Ser Leu Arg Asp Trp Pro Leu Phe Met Cys195 200 205Cys Ile Ser Leu Ser Ile Phe Pro Leu Ala Ala Phe Thr Val Glu Lys210 215 220Leu Val Leu Gln Lys Tyr Ile Ser Glu Pro Val Val Ile Phe Leu His225 230 235 240Ile Ile Ile Thr Met Thr Glu Val Leu Tyr Pro Val Tyr Val Thr Leu245 250 255Arg Cys Asp Ser Ala Phe Leu Ser Gly Val Thr Leu Met Leu Leu Thr260 265 270Cys Ile Val Trp Leu Lys Leu Val Ser Tyr Ala His Thr Ser Tyr Asp275 280 285Ile Arg Ser Leu Ala Asn Ala Ala Asp Lys Ala Asn Pro Glu Val Ser290 295 300Tyr Tyr Val Ser Leu Lys Ser Leu Ala Tyr Phe Met Val Ala Pro Thr305 310 315 320Leu Cys Tyr Gln Pro Ser Tyr Pro Arg Ser Ala Cys Ile Arg Lys Gly325 330 335Trp Val Ala Arg Gln Phe Ala Lys Leu Val Ile Phe Thr Gly Phe Met340 345 350Gly Phe Ile Ile Glu Gln Tyr Ile Asn Pro Ile Val Arg Asn Ser Lys355 360 365His Pro Leu Lys Gly Asp Leu Leu Tyr Ala Ile Glu Arg Val Leu Lys370 375 380Leu Ser Val Pro Asn Leu Tyr Val Trp Leu Cys Met Phe Tyr Cys Phe385 390 395 400Phe His Leu Trp Leu Asn Ile Leu Ala Glu Leu Leu Cys Phe Gly Asp405 410 415Arg Glu Phe Tyr Lys Asp Trp Trp Asn Ala Lys Ser Val Gly Asp Tyr420 425 430Trp Arg Met Trp Asn Met Pro Val His Lys Trp Met Val Arg His Ile435 440 445Tyr Phe Pro Cys Leu Arg Ser Lys Ile Pro Lys Thr Leu Ala Ile Ile450 455 460Ile Ala Phe Leu Val Ser Ala Val Phe His Glu Leu Cys Ile Ala Val465 470 475 480Pro Cys Arg Leu Phe Lys Leu Trp Ala Phe Leu Gly Ile Met Phe Gln485 490 495Val Pro Leu Val Phe Ile Thr Asn Tyr Leu Gln Glu Arg Phe Gly Ser500 505 510Thr Val Gly Asn Met Ile Phe Trp Phe Ile Phe Cys Ile Phe Gly Gln515 520 525Pro Met Cys Val Leu Leu Tyr Tyr His Asp Leu Met Asn Arg Lys Gly530 535 540Ser Met Ser54权利要求
1.经过分离和纯化的脱氧核糖核酸(DNA)，其特征在于该DNA包括SEQ ID NO1序列或SEQ ID NO1序列的一部分、或与SEQ ID NO1基本同源的序列。
2.经过分离和纯化的脱氧核糖核酸(DNA)，其特征在于该DNA包括SEQ ID NO3序列或SEQ ID NO3序列的一部分、或与SEQ ID NO3基本同源的序列。
3.一个转化植物细胞的载体，其特征在于该载体含有SEQ IDNO1序列或SEQ ID NO1序列的一部分、或与SEQ ID NO1基本同源的序列的脱氧核糖核酸序列。
4.一个转化植物细胞的载体，其特征在于该载体含有SEQ IDNO3序列或SEQ ID NO3序列的一部分、或与SEQ ID NO3基本同源的序列的脱氧核糖核酸序列。
5.一个转化植物细胞的载体，其特征在于该载体含有SEQ IDNO23的脱氧核糖核酸序列，SEQ ID NO23是经过改变以含有一个81bp插入序列的SEQ ID NO1，因此推导出的所编码蛋白质的氨基酸序列含有SEQ ID NO25的重复序列SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK，其中加有下划线的氨基酸的间隔和同一性是相同的或者被保守性替换所取代。
6.一个根据权利要求3或权利要求5的载体，其特征在于该序列以有义方向存在于该载体中。
7.一个根据权利要求3的载体，其特征在于该序列以反义方向存在于该载体中。
8.质粒pDGAT cDNA(ATCC PTA-989)。
9.质粒pDGAT基因(ATCC PTA-988)。
10.具有特定基因组的植物，其特征在于该基因组含有导入的核苷酸序列，该序列是SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的一部分，或与SEQ ID NO1基本同源的序列。
11.具有特定基因组的植物种子，其特征在于该基因组含有一个导入的核苷酸序列，该序列是SEQ ID NO1或SEQ ID NO1的一部分，或与SEQ ID NO1基本同源的序列。
12.一种遗传转化植物，其特征在于该植物基因组被权利要求3或权利要求4或权利要求5的载体所转化。
13.一种遗传转化植物种子，其特征在于该植物种子的基因组被根据权利要求3或权利要求4或权利要求5的载体所转化。
14.根据权利要求11或权利要求13的植物种子，其特征在于与基因组未作修饰植物的统计学显著性数量种子的平均水平相比显示出改变的籽油含量，两者生长在相同时期、相同生长条件下，具有相同的基因型。
15.根据权利要求11或权利要求13的植物种子，其特征在于与基因组未作修饰植物的统计学显著性数量种子的平均水平相比在籽油中显示出改变的二酯酰甘油含量，两者生长在相同时期、相同生长条件下，具有相同基因型。
16.根据权利要求11或13的植物种子，其特征在于与基因组未作修饰植物的统计学显著性数量的种子的平均水平相比显示出具有改变的脂肪酰基组成的籽油，两者生长在相同时期、相同生长条件下，具有相同的基因型。
17.根据权利要求10或12的植物，其特征在于与统计学显著性数量的基因组未作修饰植物平均水平相比显示出增加的生物量，两者生长在相同时期、相同生长条件下，具有相同的基因型。
18.根据权利要求11或13的种子，其特征在于与基因组未作修饰植物的统计学显著性数量种子的平均水平相比显示出增加的生物量，两者生长在相同时期、相同生长条件下，具有相同的基因型。
19.一种通过将核酸序列导入特定植物的基因组而得到相应转基因植物的方法，其特征在于导入该基因组的核酸序列包括SEQ IDNO1或SEQ ID NO3或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的一部分，或一个与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或它们的一部分基本同源的序列，或一个与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或含有81bp插入序列[SEQID NO23]的SEQ ID NO1基本同源的序列，因此，推导出的编码蛋白质的氨基酸序列含有SEQ ID NO25的重复序列SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK，其中加有下划线的氨基酸的间隔和同一性是相同的或被保守替换所取代。
20.根据权利要求19的一种方法，其特征在于该植物是十字花科的成员。
21.根据权利要求19的一种方法，其特征在于该植物选自拟南芥、琉璃苣(Borago种)、canola、蓖麻(Ricinus comm unis)、可可豆(Theobroma cacao)、玉米(Zea mays)、棉花(Gossypium种)、海甘蓝、萼距花种、亚麻(Linum种)、Lesquerella和Limnanthes种、linola、旱金莲(Tropaeolum种)、月见草、橄榄树(Olea种)、棕榈树(Elaeis种)、花生(Arachis种)、油菜籽、红花(Carthamus种)、大豆(Glycine和Soja种)、向日葵(Helianthus种)、烟草(Nicotiana种)、Vernonia种、小麦(Triticum种)、大麦(Hordeum spp)、水稻(Oryza种)、燕麦(Avena种)、高梁(Sorghum种)、黑麦(Secale种)或其它禾本科成员。
22.一个植物DNA序列或其部分，其特征在于该序列至少与SEQID NO1或SEQ ID NO3的部分基本同源，还在于该序列已经利用由SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或含有81bp插入序列[SEQ ID NO23]的SEQ ID NO1得到的序列信息被分离、表征或设计，因此，推导出的编码蛋白质的氨基酸序列含有SEQ ID NO25的重复序列SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK，其中加有下划线的氨基酸的间隔和同一性是相同的或被保守替换所取代。
23.一种通过以有义或反义方向将核酸结构导入植物转化载体，利用该载体转化植物或植物种子的基因组，然后种植该植物或植物种子，从植物种子中提取籽油以改变植物种子的籽油中油含量、酰基组成或二酯酰甘油/三酯酰甘油比例的方法，其特征在于该核酸序列是SEQ ID NO1或SEQ ID NO3，或SEQ ID NO1或SEQ ID NO3的一个部分，或一个与SEQ ID NO1或SEQ ID NO3或含有81bp插入序列[SEQ ID NO23]的SEQ ID NO1基本同源的序列，因此，推导出的编码蛋白质的氨基酸序列含有SEQ ID NO25的重复序列SHAGLFNLCVVVLIAVNSRLIIENLMK，其中加有下划线的氨基酸的间隔和同一性是相同的或被保守替换所取代。
全文摘要
本发明涉及植物二酯酰甘油酰基转移酶(DGAT)基因及相关基因产品的分离、纯化、表征和利用。例如,本发明提供了DGAT cDNA[SEQ ID No:1](pDGATcDNA;ATCC No.PTA－989)和一种来源于十字花科植物(特别是拟南芥)的二酯酰甘油酰基转移酶基因[SEQ ID No:3](pDGATgene;ATCC No.PTA－988)。本发明包括经过分离和纯化的DGAT DNA,优选的是所述序列和同源染色体,以及涉及使用该基因调节籽油含量、籽油中二酯酰甘油/三酯酰甘油部分的比例、脂肪酸合成、籽油酰基组成、种子体积/重量比和进入其他种子组份的碳代谢流量的方法和涉及被该基因转染的植物或组织。本发明也涉及含有特定基因组的转基因植物、植物组织和植物种子,该特定基因组含有本发明引入的DNA序列,以及生产该植物和植物种子的方法。本发明也涉及含有一个81bp插入序列[SEQ ID No:23]的[SEQ ID No:1]序列,以及该序列在改变籽油含量、三酯酰甘油的酰基组成、种子大小或其他种子组份的碳代谢流量方面的用途。
文档编号C12N15/54GK1352690SQ99816248
公开日2002年6月5日 申请日期1999年12月16日 优先权日1998年12月17日
发明者J·邹, D·C·泰勒, Y·魏, C·C·雅科 申请人:加拿大国家研究局 被以下专利引用 (4),