专利名称：制备基因库的方法
技术领域：
本发明涉及从生物的环境库中制备基因库的方法，该基因库富含编码具有目的活性的多肽的DNA。
背景技术：
重组DNA技术的出现使得筛选具有目的特性的单个蛋白成分并且大量生产它们成为可能。这代表了对以前使用的生产方法的改进，以前的生产方法是应用从自然中分离的微生物而且生产蛋白质混合物，然后直接应用或在生产步骤之后进行分离。人们已经发展了用来快速鉴定编码目的多肽的基因的方法。
在WO93/11249(Novo Nordisk A/S)中叙述了所谓的表达克隆技术的实例。在WO93/11249中公开的技术包括从生物中制备DNA文库，该生物被怀疑携带编码具有产生目的活性的多肽的基因。传统上，用从单个已知的微生物中分离的DNA产生这样的文库。
WO97/37036中设计了筛选具有可选择特性的微生物的区域化方法，并且在WO97/37036中叙述了用于从环境样本中制备标准化的基因组DNA文库的方法。
然而，从未有人描述从生物的环境库中制备基因库(其中该基因库富含编码具有目的活性的多肽的DNA)的方法。因此，需要建立基于生物学富集从生物的环境库中筛选潜在的目的基因的方法。
发明概述已发现可应用生物学富集从生物的环境库中筛选潜在的目的基因。因此本发明提供了从生物的环境库中产生基因库的方法，该基因库富含编码具有目的活性的多肽的DNA，该方法包括a)对所述生物的环境库进行培养，所用培养基和/或条件适于在该生物库中富集携有所述DNA的生物，和b)从所富集的生物库中制备基因库。
本发明还提供了从生物的环境库中筛选目的DNA序列的方法，该方法包括a)对所述生物的环境库进行培养，所用培养基和/或条件适于在该生物库中富集携有所述DNA序列的生物；b)从所富集的生物库制备基因库；c)筛选包含携带有目的基因之DNA的文库；和d)筛选从步骤c)中获得的目的DNA序列。
发明详述本发明的目的是提供从生物的环境库中制备基因库的方法，该基因库富含编码具有目的活性的多肽的DNA，该方法包括a)对所述生物的环境库进行培养，所用培养基和/或条件适于在该生物库中富集携有所述DNA的生物，和b)从所富集的生物库中制备基因库。
在本发明中，术语“生物的环境库”意指环境样本，该样本包括微生物和高等动物的细胞，它们含有编码具有目的活性的多肽的DNA。例如，环境样本可以是土壤或植物物质、动物或昆虫的粪便、昆虫的内脏、动物的胃等环境样本，海水或湖水、污水、废水等水样本，污泥或沉淀样本等，这些样本包含一种或(在大部分情况下)大量的不同微生物或活细胞。
在步骤a)中，培养所述样本，且不需要进一步纯化。通过选择培养样本的培养基和培养条件，可富集或(扩增)在特定培养条件下具有最佳生长并且表达具有适应于培养条件之特点的多肽。在步骤b)中制备的文库可以通过在本领域中任何已知的适当技术进行制备，并不限定于实施例3和实施例4中叙述的实例。
本筛选方法的优点主要是新基因的分离，及所致新产物的产生速度大大提高。而且，本方法允许对多个多肽活性进行筛选，并且可以导致分离编码同类多肽的几个不同基因。通过利用本发明，可开发用于分析新酶和其它具有目的活性的多肽的富集培养物。
在优选的实施方案中，本发明的方法包括在培养基中培养生物的环境库，该培养基含有针对具有目的活性的多肽的底物。可用于富集含不同类型基因产物之生物环境库的底物有很多。例如，编码具有目的活性的多肽(例如果胶酶)的DNA可用其底物(如果胶)进行筛选。
在优选的实施方案中，底物构成培养基的碳源和/或氮源。
在更优选的实施方案中，底物包括果胶、直链淀粉、纤维素、半乳聚糖、木聚糖、阿拉伯聚糖、甘露聚糖、脂类、半纤维素或者它们的组合。
在本发明方法的优选实施方案中，富集是通过一个或更多的生长条件完成的。在另一个优选的实施方案中，所述生长条件包括pH值和温度。而在另一个实施方案中，被用来完成富集步骤a)的生长条件包括任何pH值范围，即pH0-12，优选约pH6-9，特别是pH9-12，以及任何温度范围，即0-120℃，优选约25-30℃，优选约30-50℃，更优选50-70℃。
在用于筛选潜在的目的生物环境库的方法中，重要的步骤是选择最佳起始库。为了选择可分解植物(或动物)来源的天然化合物的多肽的编码DNA，优选观察可有效分解这类起始物质的天然群落生境。在分解植物物质中特别有效的动物的实例是反刍动物、白蚁和昆虫(sensu lato)。
在优选的实施方案中，从动物的胃或昆虫内脏中分离微生物库。
在更优选的实施方案中，从牛的瘤胃中分离微生物库。
同样，当筛选编码具有目的活性(即能在诸如强碱性条件下工作)的多肽的DNA时，重要的是从同等强碱性群落生境中分离微生物库。本领域中众所周知，为了使苏云金杆菌(Bt)毒素具有活性，强碱性条件是必须的[苏云金杆菌，环境杀虫剂理论和实践，1993,P.F.Entwistl等编，Wiley和Son，英国]。已知对Bt毒素敏感的昆虫目幼虫的内脏包含强碱性(pH约为10)环境库。这样的昆虫目尤其是指等翅目、鳞翅目、鞘翅目和双翅目昆虫。
因此在优选的实施方案中，从等翅目、鳞翅目、鞘翅目或双翅目昆虫的内脏中分离微生物库。
在更优选的实施方案中，从选自地夜蛾属(Agrotis)、Neotermescastaneus、幕谷蛾(Tineola bisselliella)和五月鳃金龟(Melolontha vulgaris)的昆虫的内脏中分离微生物库。
在从动物胃或昆虫内脏中分离生物的环境库之前，可用包含针对目的多肽活性之底物的食物饲养或提供给动物或昆虫甚至可以作为主要的碳源和/或氮源，如此进行富集是有利的。这使牛的瘤胃和来自鳞翅目、鞘翅目以及双翅目幼虫的内脏对于进一步经特异性底物饲养动物富集非常有利。
在优选的实施方案中，通过给动物或昆虫提供食物对微生物库进行富集，该食物包括针对具有目的活性的多肽的底物。
“编码具有目的活性的多肽的DNA”的具体实施例包括抗微生物活性和其它酶活性。
在优选实施方案中，所述基因库富含编码目的酶活性的DNA。
在本发明的更优选实施方案中，目的活性是选自下组的酶活性磷酸酶、氧化还原酶(E.C.1)、转移酶(E.C.2)；水解酶(E.C3)如酯酶(E.C.3.1)，尤其是脂肪酶和植酸酶，例如糖苷酶(E.C.3.2)，尤其是木聚糖酶、纤维素酶、半纤维素酶和淀粉酶，例如肽酶(E.C.3.4)，尤其是蛋白酶；裂解酶(E.C.4)；异构酶(E.C.5)；连接酶(E.C.6)在另一个优选实施方案中，目的酶包括蛋白酶、脂肪酶、β半乳糖苷酶、乳糖酶、聚半乳糖醛酸酶、β葡萄糖淀粉酶、酯酶、半纤维素酶、过氧化酶、氧化酶、漆酶或葡萄糖氧化酶。
在更优选的实施方案中，用所述方法获得的酶是淀粉酶，尤其α淀粉酶或β淀粉酶、阿拉伯糖醇酶、阿拉伯呋喃糖苷酶、半乳聚糖酶、α半乳糖苷酶、β半乳糖苷酶、聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase)、果胶甲基酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸酶、鼠李糖半乳糖醛酸己酰酯酶、果胶裂解酶、木聚糖酶、纤维素酶、β葡萄糖苷酶、纤维素生物水解酶、木糖苷酶、甘露聚糖酶(mannanase)和/或葡萄糖醛酸酶(glucuronisidase)。
包含编码具有目的活性的多肽的DNA的生物的环境库通常是微生物，例如真细菌、古细菌、真菌、藻类和/或原生动物。
多肽可以是从任何已知生物中获得的目的酶。优选所述酶可来自微生物，尤其细菌、丝状真菌或酵母。
在本发明的方法中，所述微生物是富集的培养物，即用特异性底物筛选的培养物，其它生物不能在该底物上生长或生长减慢。
本发明方法的另一个目的是提供从生物的环境库中筛选目的DNA序列的方法，该方法包括a)对所述生物的环境库进行培养，所用培养基和/或条件适于在该生物库中富集携有所述DNA序列的生物；b)从所富集的生物库制备基因库；c)筛选包含携带有目的基因之DNA的文库；和d)筛选从步骤c)中获得的目的DNA序列。
步骤a)和b)已经在上面叙述。在步骤c)中，可筛选具有任何目的活性的克隆，所述克隆经证实含有来源于步骤b)中制备的基因库的DNA序列。这些活性的实例包括酶活性、抗微生物活性或生物活性。在步骤c)中，筛选包含目的基因的基因组DNA的基因库，在步骤d)中，从在步骤c)中筛选的DNA基因库中筛选目的DNA序列。步骤c)和d)可以按照在本领域中熟知的标准方法进行。
然后在特定的条件下和/或与如化学化合物或试剂联合，分析具有目的活性的多肽是否具有所需性能。可根据本发明的方法，筛选包含具有目的活性的多肽的基因库，所述目的活性如特异性活性和/或特异性目的特性，例如热稳定性、高pH耐受性、洗涤特性、纺织染色、毛染色或漂白特性、在饲养或食物中的影响等。本领域技术人员熟知用于分析目的活性和/或特性的适当的分析方法。
在本方法的优选实施方案中，所述基因库包括编码酶的目的基因，在使酶具有活性的条件下筛选含该酶的基因库。这指在例如高温(如60-110℃)和高pH(如10-12)条件(其可对具有相对较高热稳定性的碱性酶DNA序列进行分离)下，筛选含此酶的文库。然而，pH值可以为约0-约12的任何范围，温度可为约5-110℃的任何范围，优选约60-约90℃。
本发明的另一个目的是提供从生物的环境库中制备的基因库，该环境库富含编码具有目的活性的多肽的DNA。在优选的实施方案中，该基因库包括具有酶、激素或毒素活性的多肽。在更优选的实施方案中，该基因库包括如上所述目的酶活性。
在下面的实施例中进一步举例说明了本发明，不认为这些实施例以任何方式限定本发明的范围。
实施例实施例1富集程序用约1g土壤样本(NS Collection)接种分别装有100ml下述培养基的摇瓶，并在250rpm 60℃保温过夜。保温以后摇瓶中的pH值为9.7-9.9。所有富集均用显微镜检查其生长。
混合下述10倍浓缩的原液，制备富集培养基。
A: KH2PO44.25g/l
NH4Cl 4.25g/lKCl4.25g/lMgSO4,7H2O 6.25g/lCaCl2,2H2O 3.12g/lB: NaHCO330g/lNa2CO330g/lC 酵母提取物 5g/l果胶果胶35 20g/l纤维素 CMC C-48888 Sigma 10g/l纤维素粉末 20g/l淀粉可溶性淀粉 50g/l在高压灭菌前煮沸。
所有储存液均高压灭菌。
混合100ml A+B+C+100ml果胶或纤维素或淀粉和600无菌水，制备各种液态富集培养基。
实施例2富集文库物质所述富集被用于制备混合的富集文库。取所选富集培养物各50ml离心，所得细胞沉淀用于产生基因库。分别根据淀粉酶、阿拉伯聚糖酶、木聚糖酶、半乳聚糖酶和果胶酶活性筛选文库而获得克隆。
实施例31号基因库的制备用0.9％NaCl洗涤培养物中的细胞，并汇集到一个试管中。用Pitcher等(Pitcher D.G.,saunders N.A.,Owen R.J.(1989)用硫氰酸胍快速提取细菌染色体DNA.Lett.Appl.Microbiol.,8,151-156)叙述的方法提取DNA。回收170微克高分子量DNA。在15PSI压力下，将溶在25％甘油中的约90微克DNA在雾化器(带DNA插入子的Bio Neb细胞破碎系统，Glas-Col仪公司)中破碎45秒。得到2-5kb的DNA。将此DNA在蔗糖梯度上分级分离(Maniatis等)，收集目的级分并用EtOH或异丙醇沉淀的方法浓缩。为了修整末端，将4微克DNA用EtOH沉淀并重悬于35微升H2O中。
修整DNA以产生钝性末端。
35μl DNA(4μg)5μl NEB4缓冲液4μl dNTP(2.5mM原液)4μl T4DNA聚合酶2μl Klenow在室温使反应混合液保温30分钟，加入200μl1×TE,pH8.0。用1X酚-氯仿抽提混合物，加入1×CIA、0.1体积的3M NaOAC(pH5.2)，并加入2倍体积的96％EtOH，在冰上放置30分钟，或于-20℃过夜，并重溶于16μl H2O中。
将末端修整的DNA与EcoRⅤ新鲜消化的pZero(Invitrogen)连接。
用电穿孔法将连接混合物转入DH10B大肠杆菌细胞中，按300个zeocin抗性菌落一等份分装并冻存。这些冻存物构成1号文库。
实施例4从土壤中分离细菌并制备2号基因库按Prieme A等和Bakken L.R.(FEMS微生物生态学21:59-68,1996)描述的方法从土壤中分离细菌。50g土壤(从丹麦的Roskilde Fjord获得)与200ml dH2O搅拌1分钟(Waring搅拌器)并在冰上放置1分钟。重复3次。悬浮液静置2分钟，以使大的土壤颗粒沉淀。将30ml悬浮液加到离心管中，随后通过注射器将10ml Nycodenz(Nycodenz，溶于水中，浓度为0.8g/ml，过滤除菌，Nycomed pharma A/S批号207051)加到该管底部。将样本用摇旋转(swing-out)转头以10000×g于20℃不间断离心2小时。细菌集中在Nycodenz相和水相的交界面(土样沉在管底)，用注射器吸出细菌。
如Pitcher等(Pitcher D.G.,saunders N.A.,Owen R.J.(1989)用硫氰酸胍快速提取细菌染色体DNA.Lett.Appl.Microbiol.,8,151-156)叙述的方法提取DNA。
用Sau3A限制性内切酶部分消化该DNA，并且在1％琼脂糖凝胶上进行大小分级(Maniatis等)。从琼脂糖上切下包含大小相当于3kb及3kb以上的DNA的琼脂糖，并且通过在1.2％琼脂糖凝胶上的进一步电泳浓缩DNA。用GFX试剂盒(Pharmacia)从琼脂糖块中分离DNA。
Sau3A消化的DNA与BamHⅠ新鲜消化的pZero-2(Invitrogen)连接。用电穿孔法将连接混合物转入DH10B大肠杆菌细胞中，按300个卡那霉素抗性菌落一等份分装并冻存。这些冻存物构成2号文库。
实施例5分析1号文库的酶活性淀粉酶分析分析包括以下试剂1:0.1％AZCL直链淀粉(MegaZyme，澳大利亚)2:0.1M Tris-Cl缓冲液pH93:MilliQ H2O96孔板每孔中标准体积为150μl(15ml/微平板)。
384孔板每孔中为标准体积60μl(25ml/微平板)。
将细胞培养65小时，然后将50μl细胞吸到96孔板的150μl分析底物中；或将20μl细胞吸到384孔板的60μl分析底物中。将分析平板置一袋中50℃保温过夜。孔中为兰色时为阳性反应。
阿拉伯聚糖酶分析分析包括以下试剂1:0.1％AZCL去支链阿拉伯聚糖(MegaZyme，澳大利亚)2:0.1M Tris-Cl缓冲液pH93:MilliQ H2O96孔板每孔中标准体积为150μl。
384孔板每孔中为标准体积60μl。
将细胞培养65小时，然后将50μl细胞吸到96孔板的150μl分析底物中；或将20μl细胞吸到384孔板的60μl分析底物中。将分析平板置一袋中50℃保温过夜。孔中为兰色时为阳性反应。
半乳聚糖酶分析包括以下试剂1:0.1％AZCL半乳聚糖(MegaZyme，澳大利亚)2:0.1M Tris-Cl缓冲液pH9
3:MilliQ H2O96孔板每孔中标准体积为150μl。
384孔板每孔中为标准体积60μl。
将细胞培养65小时，然后将50μl细胞吸到96孔板的150μl分析底物中；或将20μl细胞吸到384孔板的60μl分析底物中。将分析平板置一袋中50℃保温过夜。孔中为兰色时为阳性反应。
果胶酶分析利用multidrop仅将150ml分析混合物装入编号的黑色微滴板。随后用Plate Mate pipetting station将50ml细胞自动地加到分析平板中。平板在室温中(避光)放置约150-180分钟，随后用FPM-2荧光极性分析仅以激发滤光片(excitation-filter)458/22和激发滤光片530/30的进行分析。通常极化值为约90mP到50-70mP，阳性克隆的值低于该极化值。
150μl分析混合物34μg/ml荧光素标记的柠檬-果胶77％DE=5.0μl 1g/l溶液。
2mM CaCl2=0.5μl 1M溶液含0.1M NaCl的83体积％0.1M甘氨酸缓冲液=125μl缓冲液pH10.0Mili-Q-H2O=20μl。
木聚糖酶分析包括以下试剂1:0.1％AZCL半木聚糖(MegaZyme，澳大利亚)2:0.1M Tris-Cl缓冲液pH93:MilliQ H2O96孔板每孔中标准体积为150μl。
384孔板每孔中为标准体积60μl。
将细胞培养65小时，然后将50μl细胞吸到96孔板的150μl分析底物中；或将20μl细胞吸到384孔板的60μl分析底物中。将分析平板置一袋中50℃保温过夜。孔中为兰色时为阳性反应。
在平板上筛选木聚糖酶、半乳聚糖酶和淀粉酶的大肠杆菌转化子在LB琼脂平板中37℃条件下筛选2号基因库，该LB琼脂包括25μg/ml卡那霉素作为抗生素筛选标记，及0.03％AZCL-木聚糖+0.03％AZCL-半乳聚糖+0.03％AZCL-直链淀粉作为酶的底物。菌落周围形成蓝晕指示酶活性。为鉴定酶活性，将菌落在含每种AZCL底物的LB平板上再次划线分离，发现了3个淀粉酶阳性菌落。
通过上述分析筛选从1号文库中获得的阳性克隆。
发现了3个淀粉酶阳性克隆、2个木聚糖酶阳性克隆、2个果胶酶阳性克隆、2个半乳聚糖酶阳性克隆以及8个阿拉伯聚糖酶阳性克隆。
这些结果证明用本发明的方法筛选目的DNA序列是可能的。
实施例6从白蚁幼虫内脏中富集纤维素酶材料白蚁(Neotermes castaneus)幼虫从BAM(Bundesanstalt furMaterialforschung und-Prufung，柏林，德国)获得。
富集步骤连续饲养幼虫并用无菌植物物质喂养，所述植物物质来源于裸子植物或被子植物(单子叶或双子叶)，能够通过植物细胞壁的降解酶活性进行酶性(内源性或外源性)消化。
通过解剖进一步富集(任选)在立体显微镜下斩首处死幼虫，之后筛选内脏(包括内脏内容物)并将几个幼虫的内脏汇集到一起。
DNA制备利用市售DNA试剂盒(FAST DNA-KitH,Bio 101 Inc,1070Joshua Wav,California,US)，从这些混合的内脏物质中制备DNA。用这种高质量的DNA物质制备基因组文库，例如按如下的方法进行用Sau3A消化，进行大小分级分离并选择特定大小范围，将其克隆到λ噬菌体-Zap-Express(AH Diagnostic,Stratagene,US)上。试剂盒制造商提供了完整的实验方法。
RNA制备利用市售RNA试剂盒和公开的方法(如H Dalboge,1997,FEMS微生物学综述，21,29-42)，从所述混合的内脏物质中制备总RNA。然后收获mRNA部分，根据这部分mRNA，制备相应的cDNA。将其用于构建cDNA文库，该文库代表在给定的时间表达的蛋白。用于mRNA、cDNA和cDNA文库产生的方法和参考文献可以在普通的教科书中得到(还有例如H Dalboge,1997,FEMS微生物学综述，21,29-42)。
基因组文库的筛选所制备的文库富含特别收益于幼虫饲养条件之生物的DNA改进噬菌斑筛选方法使之适用于携有酶底物的平板(例如，用AZCL兰色颗粒底物制备，其可从MegaZyme获得)。产生的色晕表明噬菌体上插入了完整的功能基因，其编码所需纤维素酶活性。将酶底物加到底层而将噬菌体加到另一上层时，此方法最为有效。阳性噬菌斑在AZCL底物平板上就通过其兰色晕测出。
cDNA文库的筛选按照表达克隆方案(如见HDalboge,1997,(FEMS微生物学综述21:29-42)，筛选富含高表达蛋白的cDNA文库，所述蛋白可有效降解喂给幼虫的食物。
鉴定所选的克隆在HE Azur交联的兰色颗粒底物(MegaZyme)上最终鉴定了200多个纤维素酶活性克隆。直接对各菌落进行PCR(PCR方法参照相关教科书，可用Advanced Biotechnologies,Surrey，英国提供的聚合酶)以便区别并分组。所用引物基于对正义和反义cDNA克隆质粒pYes-2的识别和扩增(购自Invitrogene，美国)。
据此至少鉴定了4个不同大小的功能基因。
实施例7从纺织蛾(textile moth)幼虫内脏富集蛋白酶材料幕谷蛾幼虫，鳞翅目纺织蛾从德国的BAM获得。标准方案在实施例6中提及。
富集步骤连续饲养幼虫并用富含蛋白的无菌物质(如革、毛发和羊毛)喂养。
通过解剖进一步富集(任选)在立体显微镜下斩首处死幼虫，之后筛选内脏(包括内脏内容物)并将几个幼虫的内脏汇集到一起。
DNA制备利用市售DNA试剂盒，从这些混合的内脏物质中制备DNA。用这种高质量的DNA物质制备基因组文库。
RNA制备利用市售RNA试剂盒和公开的方法，从所述混合的内脏物质中制备总RNA。然后收获mRNA部分，根据这部分mRNA，制备相应的cDNA。将其用于构建cDNA文库，该文库代表在给定的时间表达的蛋白。
基因组文库的筛选所制备的文库富含特别收益于幼虫饲养条件之生物的DNA改进噬菌斑筛选方法使之适用于携有酶底物的平板，其可指示噬菌体上的完整功能基因插入子，其编码所需蛋白酶活性。
cDNA文库的筛选按照表达克隆方案筛选富含高表达蛋白的cDNA文库，所述蛋白可有效降解喂给幼虫的食物。
鉴定所选克隆通过在含AZCL-酪蛋白兰色颗粒的底物平板(MegaZyme)上进行筛选，可以鉴定蛋白酶活性克隆。根据它们特异性裂解的蛋白键的类型，可以将所选蛋白酶克隆进一步细分。
实施例8从五月鳃金龟的幼虫内脏富集植物细胞壁降解酶材料从丹麦的栖息地(Zealand)收集五月鳃金龟的幼虫，那里的土壤中富含非常多样的各种植物碎屑成分。所述幼虫在土壤中自由生长，用植物物质饲养达3年。
富集步骤连续饲养幼虫并用非特异性无菌植物碎屑喂养，所述植物碎屑包括非常广泛的分类学组合物。
通过解剖进一步富集(任选)在立体显微镜下斩首处死幼虫，之后筛选内脏(包括内脏内容物)并将几个幼虫的内脏汇集到一起。
DNA制备利用市售DNA试剂盒，从这些混合的内脏物质中制备DNA。用这种高质量的DNA物质制备基因组文库。
RNA制备利用市售RNA试剂盒和公开的方法，从所述混合的内脏物质中制备总RNA。然后收获mRNA部分，根据这部分mRNA，制备相应的cDNA。将其用于构建cDNA文库，该文库代表在给定的时间表达的蛋白。
基因组文库的筛选所制备的文库富含特别收益于幼虫饲养条件之生物的DNA改进噬菌斑筛选方法使之适用于携有酶底物的平板，其可指示噬菌体上携有(功能性)基因插入子，其编码所需植物细胞壁降解活性。
cDNA文库的筛选按照表达克隆方案(如见H Dalboge,1997,(FEMS微生物学综述21:29-42)筛选富含高表达蛋白的cDNA文库，所述蛋白可有效降解喂给幼虫的食物。
鉴定所选克隆通过用各种AZCL交联型兰色颗粒底物(MegaZyme)进行筛选，可以鉴定多种类型的细胞壁降解酶。
实施例9从地夜蛾属幼虫富集淀粉酶材料地夜蛾属幼虫(鳞翅目)从哥本哈根RVAU(皇家兽医和农业大学)(Peter Esbjerg教授)获得。
富集步骤连续饲养幼虫并用无菌的富含淀粉的物质喂养幼虫。
通过解剖进一步富集(任选)在立体显微镜下斩首处死幼虫，之后筛选内脏(包括内脏内容物)并将几个幼虫的内脏汇集到一起。
DNA制备利用市售DNA试剂盒，从这些混合的内脏物质中制备DNA。用这种高质量的DNA物质制备基因组文库。
RNA制备利用市售RNA试剂盒和公开的方法，从所述混合的内脏物质中制备总RNA。然后收获mRNA部分，根据这部分mRNA，制备相应的cDNA。将其用于构建cDNA文库，该文库代表在给定的时间表达的蛋白。
基因组文库的筛选所制备的文库富含特别收益于幼虫饲养条件之生物的DNA改进噬菌斑筛选方法使之适用于携有酶底物的平板，其可指示噬菌体上携有功能基因插入子，其编码所需淀粉酶活性。
cDNA文库的筛选按照表达克隆方案(如见H Dalboge,1997,(FEMS微生物学综述21:29-42)筛选富含高表达蛋白的cDNA文库，所述蛋白可有效降解喂给幼虫的食物。
鉴定所选克隆用AZCL-直链淀粉兰色颗粒底物在平板上筛选酵母(和噬菌体)菌落。用甘氨酸缓冲液(pH10)覆盖表达克隆酵母平板可找出强碱性淀粉酶。经缓冲液处理后，仅在颗粒周围出现扩散性兰色晕的菌落是已插入了编码碱性淀粉酶的基因并已表达的克隆。
实施例10从牛的瘤胃内容物富集纤维素酶、蛋白酶和淀粉酶材料用半厌氧方式直接从带瘘管的牛(在RVAU,Rorrendegard,Tastrup，丹麦)中取样富集方法在取样前几周内，用特定成分的物质喂牛，例如喂富含纤维素酶和其它植物细胞壁降解酶的干草，喂富含淀粉酶的谷粒以及喂富含蛋白酶大豆的。
通过解剖进一步富集(任选)对进一步解剖的部分进行显微镜检，显示瘤胃中不同程度的食物降解。
DNA制备利用市售DNA试剂盒，从这些混合的瘤胃物质中制备DNA。用这种高质量的DNA物质制备基因组文库。
RNA制备利用市售RNA试剂盒和公开的方法，从所述混合的瘤胃物质中制备总RNA。然后收获mRNA部分，根据这部分mRNA，制备相应的cDNA。将其用于构建cDNA文库，该文库代表在给定的时间表达的蛋白。
基因组文库的筛选所制备的文库富含特别收益于饲养条件之生物的DNA改进噬菌斑筛选方法使之适用于携有酶底物的平板，其可指示噬菌体上携有完整功能基因的插入子，其编码具有目的活性的酶。
cDNA文库的筛选按照表达克隆方案(如见H Dalboge,1997,(FEMS微生物学综述21:29-42)筛选富含高表达蛋白的cDNA文库，所述蛋白可有效降解所喂食物。
鉴定所选克隆发现了几种酶活性，例如用HE Azur交联型兰色颗粒底物(MegaZyme)鉴定了20多个纤维素酶活性克隆。用菌落PCR对所选克隆进行辨别和分组。因此鉴定了至少4个不同大小的功能基因。
权利要求
1．一种从生物的环境库中产生基因库的方法，该基因库富含编码具有目的活性的多肽的DNA，该方法包括a)对所述生物的环境库进行培养，所用培养基和/或条件适于在该生物库中富集携有所述DNA的生物，和b)从所富集的生物库中制备基因库。
2．权利要求1的方法，其中所述培养基包括所述DNA编码的基因产物的底物。
3．权利要求2的方法，其中所述底物构成培养基的碳源和/或氮源。
4．权利要求2或3的方法，其中所述底物包括果胶、直链淀粉、纤维素、半乳糖、木糖或阿拉伯糖或者它们的组合。
5．权利要求1的方法，其中所述富集通过一个或多个生长限制完成。
6．权利要求5的方法，其中所述生长条件包括pH和温度。
7．权利要求1-6的方法，其中步骤a)中用于富集的生长条件为pH9-11和温度50-70℃。
8．权利要求1的方法，其中所述生物的环境库从动物胃或昆虫内脏中分离。
9．权利要求8的方法，其中所述微生物库从牛的瘤胃中分离。
10．权利要求8的方法，其中所述微生物库从等翅目、鳞翅目、鞘翅目或双翅目昆虫的内脏中分离。
11．权利要求10的方法，其中微生物库从选自地夜蛾属、Neotermescastaneus、幕谷蛾和五月鳃金龟的昆虫的内脏中分离。
12．权利要求8-11的方法，其中通过给动物或昆虫提供食物富集所述微生物库，该食物包含针对具有目的活性的多肽的底物。
13．权利要求1的方法，其中所述基因库富含编码目的酶活性的DNA。
14．权利要求13的方法，其中所述目的酶活性包括水解酶、氧化还原酶、转移酶、裂解酶或连接酶。
15．权利要求14的方法，其中所述目的酶包括蛋白酶、脂肪酶、β半乳糖苷酶、乳糖酶、聚半乳糖醛酸酶、β葡萄糖淀粉酶、酯酶、半纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶、漆酶或葡萄糖氧化酶。
16．权利要求14的方法，其中所述目的酶是果胶酶、淀粉酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖酶、木聚糖酶或纤维素酶。
17．权利要求1的方法，其中所述生物的环境库包含微生物。
18．权利要求17的方法，其中所述生物的环境库包含产酶微生物。
19．权利要求17的方法，其中所述微生物包括真细菌、古细菌、真菌、藻类和/或原生动物。
20．权利要求1的方法，其中所述生物为富集培养物。
21．从生物的环境库中筛选目的DNA序列的方法，该方法包括a)对所述生物的环境库进行培养，所用培养基和/或条件适于在该生物库中富集携有所述DNA序列的生物；b)从所富集的生物库制备基因库；c)筛选包含携带有目的基因之DNA的文库；和d)筛选从步骤c)中获得的目的DNA序列。
22．权利要求21的方法，其中所述基因库包括目的产酶基因。
23．权利要求21的方法，其中在使所述酶有活性的条件下在所述基因库中筛选酶。
24．权利要求21的方法，其中在所述基因库中筛选果胶酶、淀粉酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖酶、木聚糖酶或纤维素酶。
25．一个基因库，其从一个已富集过的生物环境库中制备，该环境库富含具有目的活性的多肽的编码DNA。
26．权利要求25的基因库，其中所述编码具有目的活性的多肽的DNA包括酶、激素或毒素。
27．权利要求26的基因库，其中DNA是酶，该酶包括果胶酶、淀粉酶、半乳聚糖酶、阿拉伯糖酶、木聚糖酶或纤维素酶。
全文摘要
本发明涉及从生物的环境库中制备基因库的方法,该基因库富含编码具有目的活性的多肽的DNA。本发明还提供了从生物的环境库中筛选目的DNA序列的方法。本发明进一步涉及从生物的环境库中制备的基因库,该环境库富含编码具有目的活性的多肽的DNA。
文档编号C12N1/19GK1325445SQ99812823
公开日2001年12月5日 申请日期1999年10月14日 优先权日1998年10月28日
发明者托马斯·桑德尔, 卡斯滕·肖霍尔姆, 托马斯·谢弗, 莱尼·兰格, 菲奥纳·达夫纳 申请人:诺维信公司