专利名称：分离和纯化的包括在蛇麻腺中特异性表达的基因的核酸的利记博彩app
技术领域：
本发明的背景本发明领域本发明涉及包含一个在蛇麻的蛇麻腺中特异表达的基因的核酸，还涉及该基因的调节序列。
背景描述植物产生和储藏多种低分子量有机化合物，包括萜类化合物、生物碱、酚、皂角苷等等。由于以前认为这些化合物不直接参与支持生活物质，只有微小的生物学功能，传统上称它们为“次级代谢产物。”但是现在，已经阐明这些次级代谢产物功能是促进细胞分化和保护细胞免受外来损伤因子影响，并且，更进一步，植物产生的这些次级代谢产物已经用于多种大众化食物、药品、染料等等。
这些次级代谢产物由于其用途而得到重视，因而它们在植物细胞中的产生途径也已成功阐释，表明这些化合物是通过涉及多种酶的复杂的生物合成级联产生的。多数这种通过级联的酶反应生物合成的化合物可以直接从植物材料提取，但是这种从植物的直接提取不但不适合大批量生产的需要，而且通常很昂贵。因而，正在开发使用培养细胞体外合成这些化合物的方法。
另一方面，已经阐明蛇麻，给予啤酒清爽的苦味和风味的一种主要原料，在球果的蛇麻腺中分泌多种次级代谢产物，对啤酒的苦味和风味起很大作用。
基于这种情况，已经对蛇麻进行了多种育种的尝试，除了改进其耕作特征外，集中于蛇麻腺中积累的次级代谢产物诸如苦味物质、精油等。
但是，蛇麻是雌雄异株植物，特别是雄性植株不产生球果，啤酒所需的原料，因而不是商业所需的，相应的没有得到积极地研究，根本没能阐释它的对于啤酒酿造有益的遗传特征。所以，目前通过常规杂交方法进行的蛇麻育种大多依靠培育者的经验和直觉，特别是在实际结球果之前根本不能对发酵产物的质量进行预测。
另一方面，目前对多种植物已经存在使用遗传工程诸如转化技术和标记协助的筛选等育种方法。与主要依靠培育者的经验和直觉的传统育种方法相比，在这些方法中可以进行更客观的进行育种。转化技术是一种通过将外源基因转入和表达在植物细胞来直接引入所需特征的技术。通过将所需结构基因和能在植物细胞中起作用的终止子与能在植物细胞中起作用的基因表达调节启动子连接，并将产生的转化启动子转移到植物细胞进行外源基因的表达。实验中常用的启动子的例子是CaMV 35S，能够在相对多种植物中的任何组织表达转移的基因，以及用于胭脂氨酸合成酶基因的启动子(Sanders，P．R．，et al．，核酸研究，15(1987)1543-1558)。另外，在遗传转化方面，转移的基因可能对植株的生长等有害。因而，还需要能使外源基因在所需组织、所需时间和按所需的量表达的启动子。与常规的传统育种方法相比，使用转化技术的育种方法的优点是能够在短时间内以相对高的准确度将所需特征转导到植株中而不必在意其物种种类。在蛇麻中，由于可以用根载植而增殖，不需要固定转导特征的步骤。因而，使用转化技术的育种方法对蛇麻是特别有效的。
标记协助选择是使用DNA标记诸如RFLP(限制性片段长度多态性)标记的育种方法的一个实例，已经进入实际应用，特别是对稻和小麦。通常认为，转化技术可用于转导单基因调控的特征，但不能转导多基因调控的特征。标记协助选择能够补偿转化技术的这些缺陷。
这种使用基因技术的育种方法的先决条件是阐明与所需特征相关的基因和调节这些基因的序列。特别地，对于作为啤酒原料和有效药物成分来源的蛇麻，如果阐明了与雌性植株球果中含有的蛇麻腺分泌的次级代谢产物有关的基因，可将这些基因用于利用基因技术的蛇麻育种方法，并且亦可用于医疗领域。
本发明总结因而，为了阐明在蛇麻腺中特异表达的基因和促进其实际应用，本发明的一个目的是分离、纯化和提供这类基因，及这类基因的调节序列，诸如启动子。
如上所述，本发明分离和纯化的核酸含有在蛇麻的蛇麻腺中特异表达的基因，特异地在蛇麻腺中起作用的启动子，及其部分。
使用这些核酸，可从全部依靠育种者的经验和直觉的的蛇麻育种常规方法转移到使用遗传工程的更客观的方法。如上所述，由于重要的次级代谢产物诸如啤酒原料和有效药物成分是从蛇麻球果的蛇麻腺中专有分泌的，在蛇麻腺中特异表达起作用的基因很可能与次级代谢产物的生物合成有关。这样，通过使用能够参与次级代谢产物生物合成的基因作为标记，可以开发出用于蛇麻育种的改进的标记协助选择，显著有利于食品和药物工业。另外，使用转化技术将上述基因转移到蛇麻，可以进行工业用途品种的育种。也就是说，使用遗传工程技术用这些核酸进行蛇麻育种，可以调节蛇麻腺中积累的次级代谢产物组分。另外，本发明的核酸能够保持和改进用于啤酒酿造的蛇麻的质量，以及将蛇麻用于药物产生。
通过参考下面的详细描述及其附图，可以更好的理解本发明及其多种优点。
图2使用蛇麻素特异性基因作为探针，从富蛇麻素级分和贫蛇麻素级分回收和电泳的RNA的Northern印迹检测结果。检测结果表明了蛇麻腺中蛇麻素特异基因表达的特异性。
优选实施方案的详细描述上述“特异表达”和“特异作用”的表述意思不仅是这些基因只在蛇麻腺中表达和起作用，而且指在这些腺体中比在其它器官中更强。也就是说，这些基因是否在蛇麻腺中“特异”表达或起作用可通过它们在蛇麻腺中与在其它器官中的表达量和起作用强度来确定。
此外，“特异表达”和“特异作用”的表述不仅是指这些基因在整个发育期等有如上定义的特异性，而且指与其它器官相比，这些基因的表达和起作用被特定发育阶段或外界影响升高的更高。
上述核酸包括DNA和RNA。上述核酸中编码的“基因”的类型包括任何类型诸如基因组DNA，cDNA和mRNA。
另外，本发明还包括上述核酸的部分。在有些应用中，甚至一段单独的序列本身即能实现功能而不需所需的全长，即，使用一个具有全长序列的所需功能特征的片段。例如，当使用基于RFLP的标记协助选择的育种方法应用这些核酸时，通过杂交和PCR来确认分子，其中如果它们含有上述来自蛇麻腺的特异核酸的一部分，例如，几十至几百bp长度的部分连续序列，则使用的探针和PCR引物的大小就足够了。
此外，在本发明中，上述在蛇麻腺中特异表达的基因特征是该基因编码与蛇麻腺中产生的次级代谢产物的生物合成有关的蛋白质。
此处使用的蛋白质包括，例如，序列1中的氨基酸序列。编码该蛋白质的基因包括具有序列2的碱基序列，以及与序列2的碱基序列部分地不同但保持编码上述氨基酸序列的碱基序列。在使用此碱基序列作为探针和PCR引物时，可以进行一定程度修饰但要保持产生的序列有所需的功能。所有编码上述氨基酸序列的氨基酸序列均在本发明范围内。除了上述的外，使用已经建立的编码上述蛋白质的氨基酸残基的密码子的遗传密码很容易确定特异的核酸序列。遗传密码列于L．Stryer，生物化学，第三版，1988，W．H．Freeman and Co．，以参考文献完整并于此处。
另外，本发明的分离和纯化的核酸包括编码查耳酮合成酶的基因。这种查耳酮合成酶是与苯丙氨酸和酪氨酸代谢有关的酶，并且更具体地，确定它在类黄酮的生物合成中能将1摩尔香豆酰辅酶A和3摩尔丙二酰辅酶A催化转化为4，2，4，6-四羟基查耳酮(柚配基-查耳酮)。因而，上述核酸可用于调节涉及植物的类黄酮生物合成的代谢系统。更进一步，最近，已经查明查耳酮合成酶-样酶可能具有戊酰苯(valerophenone)合成酶活性，能够催化苦味物质α-酸和β-酸的前体根皮异戊酰苯和根皮异丁酰苯的生物合成(欧洲酿造大会，26届会议的会议录，第215页(1997))。这些事实表明，本发明分离的基因编码的蛋白质作用是戊酰苯合成酶，参与苦味物质的生物合成。相应地，上述核酸可用于调节与蛇麻中苦味物质生物合成有关的代谢系统，以及用作与苦味物质有关的特征的基因标记。
本发明分离和纯化的核酸还包括用于基因在蛇麻腺中特异表达的调节序列，以及含有在蛇麻腺中活化的启动子的序列。这种序列包括，例如，由序列7所示的碱基序列的序列。这种在蛇麻腺中特异的调节序列可用于促进连接在其下游的基因在蛇麻腺中的表达。
此外，本发明的一个目标是提供一种载体，它携带在蛇麻腺中特异表达的基因或专一调节基因在蛇麻腺中表达的调节序列。
使用一种携带在上述蛇麻腺中特异表达基因的载体转化包括蛇麻的植物，可以进行诸如蛇麻等植物育种。特别地，这种载体通过提高／抑制次级代谢产物的产生而可有效用于育种。进一步，此载体不但可用于植物育种，而且通过在培养细胞中表达与次级代谢产物生物合成有关的基因来产生次级代谢产物。如果可能在培养细胞中产生次级代谢产物，可以容易地分离次级代谢产物。
同时，上述携带调节序列的载体不仅可用于特定基因的表达，而且可通过将从蛇麻或不同植物物种衍生的基因连接到调节序列的下游来实现所需基因在蛇麻中的特异表达。这样可以在蛇麻腺中表达任何所需基因。
另外，本发明还包括由上述载体转化的植物细胞。在这里，不为它们的形态或生长阶段所限制，植物细胞可包括多种类型的细胞诸如培养细胞、愈伤组织、原生质体、植株等。本发明不仅可包括第一代植物细胞，而且可包括从第一代植物细胞产生的植株。
通过上述载体的转移，上述转化的植物可以实现所需基因包括编码次级代谢产物的基因的表达，增加了植物作为食品和药物原料的用途。
在下列描述中，将参考优选实施方案详细描述本发明。1．分离核酸，该核酸包含蛇麻腺特异基因及其表达调节序列。(1)制备总RNA和mRNA通过现有方法可以制备总RNA，例如“植物PCR实验方法(Protocolsof Plant PCR Experiment)，”Shujun-sha，56页(1995)中描述的方法，并于此处作为参考。通过现有方法可以从总RNA制备mRNA，例如根据Takara-Shuzo的附于“Oligotex-dT30<Super>”的方法。(2)制备cDNA库通过现有技术可以从mRNA制备cDNA库。可以按照例如Amersham附于“cDNA合成组件(cDNA sythesis module)”的方法制备cDNA。也可以按照例如Amersham的附于“cDNA快速衔接子连接组件(cDNA rapidadaptor ligation module)”和“cDNA快速克隆组件(cDNA rapid cloningmodule)”以及Stratogene的“GIGAPACK Ⅱ加包装提取物(GIGAPACKⅡPlus Packaging Extract)”的方法制备cDNA库。上面引用的所有出版物并于此处作为参考。(3)制备蛇麻素专一探针蛇麻素专一探针是指与在蛇麻腺中特异表达的基因互补的基因片段。在本优选实施方案中，可通过下面方法获得蛇麻素专一探针。
将开花大约15天后的球果分为主要含有蛇麻腺和小苞片基(bracteole base)且蛇麻腺密集的部分(富蛇麻腺级分)和主要含有托叶苞叶(stipular bract)且有极少量蛇麻腺的部分(贫蛇麻腺级分)。从富蛇麻腺级分表达的一组基因中减去亦在贫蛇麻腺级分中表达的一组基因，认为剩余的一组基因更可能是在蛇麻腺中特异表达的基因。
可通过现有方法从在富蛇麻腺级分中表达的一组基因中减去亦在贫蛇麻腺中表达的基因，方便地例如根据附于Invitrogen的“减法试剂盒(Subtractor Kit)”的方法。(4)分离蛇麻素特异的cDNA
“蛇麻素特异cDNA”是指从在蛇麻腺中特异表达的基因衍生的cDNA。使用蛇麻素专一探针筛选从富蛇麻素级分制备的cDNA库，可以分离蛇麻素特异cDNA。可通过现有方法进行筛选，例如“使用DIG系统进行杂交的使用指南”(Boehringer Mannheim，第37页(1995))中所述的方法，并于此处作为参考。
蛇麻素特异探针的标记也可使用现有技术进行，例如，根据附于“DIG-High Prime，”Boehringer Mannheim的方法。(5)制备蛇麻基因组DNA可通过现有方法制备蛇麻基因组DNA，例如“植物PCR实验方法(Protocols for plant PCR experiment)”(Shu-jun Sha，54页，(1995))中所述的方法，并于此处作为参考。(6)分离含有蛇麻素特异基因表达的调节区的核酸。
“含有蛇麻素特异基因表达的调节区的核酸”是指含有调节区域的核酸，该区域包括在蛇麻腺中可特定行使功能的启动子。使用反向PCR(reverse PCR)以蛇麻素特异cDNA的DNA序列为探针，可根据现有方法分离核酸，例如“植物PCR实验方法(Protocols for plant PCRexperiment)”(Shu-jun Sha，69页，(1995))中所述的方法，并于此处作为参考。(7)DNA测序可根据现有方法测定这样分离的DNA序列，例如根据附于“ABI PRISMDye Primer Cycle Sequencing Ready Reaction Kit”(Perkin-Elmer)的方法，并于此处作为参考。可检测这样确定的DNA序列与其它植物物种的现存基因的同源性。(8)Northern杂交检测(后面称为Northern检测)以分离的蛇麻素特异基因为探针，通过Northern检测可以证实是否分离的蛇麻素特异基因确实在蛇麻腺中特异表达以及分离的含能够调节基因的蛇麻素特异表达的调节区的核酸是否确实在蛇麻腺中特异的起作用。可根据现有方法进行Northern检测，例如基于“非同位素实验DIG杂交方法(Protocols for non-isotope experiments-DIGhybridization)”(Shu-Jun Sha，45页，(1994))和“使用DIG系统进行杂交的使用指南(User’s guide for performing the hybridizationusing DIG system)”(Boehringer Mannheim，40页(1995))中所述的方法，均并于此处作为参考。2．制备携带上述分离的蛇麻素特异基因或蛇麻素特异表达调节序列的载体根据现有技术，通过将基因插入到携带表达调节序列的适当载体中的表达调节序列的下游和随后将转化的载体转移到合适的细胞，可以表达如上所述证实了在蛇麻腺中的特异性的蛇麻素特异基因。对于携带表达调节序列的载体类型没有限制，可以使用下面所述的携带蛇麻素特异表达调节序列的载体和市售的表达载体(例如，pBI121(CLONTECH))。
也可以根据目的从现存质粒中选择合适的载体并插入上述表达调节序列例如序列7，来类似的构建携带蛇麻素特异表达调节序列的载体。这种情况下，可任选的在表达调节序列的下游包括含有用于连接结构基因的多种限制性位点的克隆区。3．应用由于在蛇麻腺中大量分泌了次级代谢产物，上面分离的蛇麻素特异基因很可能是与次级代谢产物的生物合成有关的基因。因此，将上述获得基因应用于转化技术和标记协助选择可以使例如基于蛇麻腺中形成的次级代谢产物的改进的蛇麻育种能够进行。对于上述的转化技术，可以使用熟知的方法。
已经概括描述了本发明，参考此处提供的一些特定实施例可以得到进一步理解，除非另外说明，实施例的目的仅是为了说明而不是为了限制本发明的范围。
实施例实施例1制备富蛇麻素级分和贫蛇麻素级分开花15天后收获蛇麻球果，在液氮中冷冻。在干冰中解剖这些冷冻球果，并使用解剖钳分为主要含有蛇麻腺和内囊基(endocyte base)的有密集蛇麻腺的级分和主要含有内囊(endocyst)的有少量蛇麻腺的级分。这些级分分别称为富蛇麻腺级分和贫蛇麻腺级分，并贮存于-80℃。实施例2从富蛇麻素级分和贫蛇麻素级分制备总RNA和mRNA如下制备了富蛇麻素级分和贫蛇麻素级分的总RNA和mRNA。将各级分在液氮中冷冻和研成粉末，悬浮于2％CATB溶液(由2％十六烷基三甲基溴化铵，0．1M Tris(pH 9．5)，20 mM EDTA，1．4M NaCl和1％β-巯基乙醇组成)，在65℃温育30分钟。用氯仿／异戊醇(24:1)将悬浮液提取两次后，向提取液中加入四分之三体积的异丙醇以沉淀DNA和RNA。将沉淀的DNA和RNA溶解于水，加入1／3体积的10M氯化锂，将混合液在-20℃放置过夜，然后在15，000 rpm离心10分钟。用70％乙醇洗涤获得的沉淀并溶于DNA酶反应缓冲液(含有100mM乙酸钠(pH5．2)和5mM氯化镁)。向混合物中加入DNA酶，将产生的混合物在37℃温育以降解DNA。向温育混合液加入1／3体积10M氯化锂，将混合物在-20℃放置过夜，然后在15，000rpm离心10分钟。将获得的沉淀溶于水，通过酚-氯仿的抽提纯化产生的溶液，并用乙醇沉淀。将获得的沉淀溶于水用作总RNA制备物，使用“Oligotex-dT30<Super>”(Takara-Shuzo)按照所附的方法从中制备mRNA。实施例3制备蛇麻素特异性探针此处，通过从富蛇麻素级分的mRNA中减去亦在贫蛇麻素级分中存在的mRNA制备蛇麻素专一性探针。更具体的，使用“减法试剂盒(SubtractorKit)”按照试剂盒所附的方法制备蛇麻素专一性探针。
首先，从富蛇麻素级分的mRNA合成cDNA。同时，用生物素标记贫蛇麻素级分中的mRNA。然后，将制备的富蛇麻素级分的cDNA与贫蛇麻素级分的生物素化mRNA混合形成杂交体，然后加入链霉亲和素与杂交体上的生物素化mRNA结合。然后通过用酚-氯仿抽提杂交体除去了生物素化mRNA，导致从富蛇麻素级分的cDNA中删除了亦在贫蛇麻素中存在的从mRNA衍生的cDNA。结果是，获得了只从富蛇麻素中衍生的cDNA，用作探针。然后使用“DIG-High Prime”(Boehringer Mannheim)用地高辛配基标记了获得的蛇麻素专一性探针。实施例4分离蛇麻素特异性cDNA使用“cDNA合成组件(cDNA sythesis module)”、“cDNA快速衔接子连接组件(cDNA rapid adaptor ligation module)”和“cDNA快速克隆组件-MOSSlox(cDNA rapid cloning module-MOSSlox)”(Amersham)以及-MOSSlox作为载体的“GIGAPACK Ⅱ包装提取物(GIGAPACK Ⅱpackaging Extract)”(Stratogene)，从富蛇麻素中的mRNA制备了cDNA库。使用地高辛配基标记的蛇麻素专一性探针通过杂交方法筛选了此库。
更具体的，将从上述cDNA库衍生的各蚀斑转移到滤膜上，并在杂交缓冲液中(含有5×SSC，100mM磷酸盐缓冲液，7％SDS，2％封闭试剂，0．1％N-月桂酰肌氨酸，50％甲酰氨和50g／ml鱼精DNA)封闭。然后，向杂交缓冲液中加入上述探针，将膜在产生的缓冲液中42℃温育过夜。在56℃用清洗溶液(含有1％SDS和2×SSC)5分钟洗膜两次，进一步在68℃用清洗溶液(含有0．1％SDS和0．1×SSC)5分钟洗膜两次。然后，通过检测阳性蚀斑，分离蛇麻素专一性cDNA。实施例5测定蛇麻素专一性cDNA的DNA序列及翻译产物的氨基酸序列然后测定了含有蛇麻素专一性cDNA和蛇麻素专一性启动子的基因片段的DNA序列。测序时，将各基因片段亚克隆到pUC载体或pBluescript载体。使用“ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing Ready ReactionKit”在DNA测序仪(ABI373S model)(Perkin-Elmer)上进行了测序。
这样测定的蛇麻素专一性cDNA的DNA序列示于序列2。从DNA序列推定的翻译产物的氨基酸序列示于序列1。这样，序列1的氨基酸序列对应序列2中从位置36-38的起始密码子(ATG)至位置1218-1220的终止密码子(TAA)的DNA序列。实施例6制备蛇麻基因组DNA如下制备了蛇麻基因组DNA。将蛇麻的叶和球果在液氮中冷冻和研成粉末，悬浮于2％CATB溶液(含有2％十六烷基三甲基溴化铵，0．1M Tris(pH 9．5)，20 mM EDTA，1．4M NaCl和1％β-巯基乙醇)，在65℃温育30分钟。用氯仿／异戊醇(24:1)将悬浮液提取两次后，向提取液中加入3／4体积的异丙醇以沉淀DNA和RNA。将沉淀的DNA和RNA溶解于高盐TE缓冲液(含1M氯化钠，10mM Tris(pH8．0)和1 mM EDTA)，加入RNA酶，将产生的混合物在60℃温育以降解RNA。向反应混合液中加入2体积异丙醇沉淀DNA，用70％乙醇清洗，然后溶于水获得基因组DNA样品。实施例7分离蛇麻素特异基因的表达调节序列。
使用如下的反向(inverse)PCR方法分离了蛇麻素特异基因的表达调节序列。
图1的表是实施例7的流程。
首先，用限制性酶Xho I(S1和S2)消化实施例6中获得的蛇麻基因组DNA。依据 DNA 连接试剂盒版本1(DNA Ligation Kit Ver．l)”(Takara-Shuzo)所附的方法将Xho Ⅰ消化物自环化。
随后，使用具有蛇麻素特异eDNA中的序列的引物，以这种连接反应混合液的一部分为模板(S4)，通过PCR扩增了含有蛇麻素特异基因启动子的侧翼区。此处使用的成对引物的序列示于序列3(引物1)和序列4(引物2)。这里，序列3是与序列2的位置137至166的序列互补的序列，序列4的序列是序列2的位置303至332的序列。
上述PCR是使用“扩展高可信度PCR系统(Expand Hig-Fidelity PCRSystem)”按照所附的方法进行的，以参考文献并于此处。反应条件如下在94℃ 1分钟，55℃ 1分钟和68℃ 4分钟温育30个循环后，将混合液在72℃再温育6分钟。
将获得的反应溶液电泳以鉴定PCR产物。由于除了扩增片段1之外，在上述PCR产物中可能含有非特异性扩增片段，使用不同的引物(S5)进一步尝试了仅对所需片段的选择性扩增。也就是说，为了只选择性扩增含蛇麻素特异性启动子的片段，使用引物3(序列5)和上述引物2(S6)以部分上述PCR溶液为模板进行了PCR，引物3(序列5)与比引物1在蛇麻素特异基因更上游的序列互补。引物3(序列5)含有与蛇麻素特异cDNA(序列2)的位置114至143的序列互补的序列。使用与上述相同的条件和装置进行PCR。然后，将使用引物2和3获得的PCR-扩增片段进行了DNA测序。实施例8蛇麻素特异基因的表达调节序列的DNA序列测定类似上面实施例5所述，通过将扩增片段亚克隆到pUC载体或pBluescript载体，使用ABI PRISM Dye Primer Cycle Sequencing ReadyReaction Kit在DNA测序仪(ABI373S model)(Perkin-Elmer)对上述扩增片段2上进行了碱基序列测定。结果示于序列6。
由于这种扩增片段是通反向PCR方法获得的，预期扩增片段含有如蛇麻素特异基因中的启动子(其部分)的表达调节序列。因而，为了鉴定该表达调节序列，将扩增的DNA片段与蛇麻素特异性cDNA的DNA序列进行了比较。比较揭示扩增的DNA片段(序列6)含有蛇麻素特异cDNA中启动子序列。更具体的，序列6的位置1-690的序列对应蛇麻素特异cDNA(序列2)的位置303-992的序列，序列6的位置3296-3438的序列对应蛇麻素特异cDNA(序列2)的位置1-143的序列。因此，这样表明了表达调节序列，诸如蛇麻素特异基因的启动子包括在序列6的691-3295的区域位置，示于序列7。实施例9蛇麻素特异cDNA和蛇麻素特异基因的表达调节序列的Northern印迹检测。
使用实施例5中的基于蛇麻素特异cDNA(序列2)制备的标记DNA，通过Northern印迹检测对从富蛇麻素和贫蛇麻素级分中提取的总RNA测定了是否上述蛇麻素特异cDNA在蛇麻腺中确实表达以及是否上述蛇麻素特异基因的启动子确实在蛇麻腺中起作用。
首先，通过类似实施例2的方法从富蛇麻素和贫蛇麻素级分制备了总RNA，并通过变性琼脂糖凝胶电泳(1％琼脂糖，18％甲醛，20mM MOPS，5mM乙酸钠和1mM EDTA(pH7))分级分离。将在琼脂糖凝胶上分级分离的RNA转移到尼龙膜，并按照DIG系统杂交使用指南(Boehringer-Mannheim，40页(1995))以上述得到的cDNA为探针进行杂交，以参考文献并于此处。
在下面条件下进行杂交。使用如实施例4中相同成分的杂交缓冲液封闭上述膜。向上述杂交缓冲液加入用地高辛配基标记的蛇麻素特异cDNA作为探针，将封闭的膜浸入混合液，并50℃温育过夜。然后，用清洗液(含1％SDS和2×SSC)在56℃10分钟洗涤膜两次，再用清洗液(含0．1％SDS和0．1×SSC)在68℃30分钟洗涤膜两次，然后寻找与探针融合的带。图2图示结果。
如图2所示，虽然有些上面获得的基因的mRNA亦在贫蛇麻素级分中存在，它们明显的在富蛇麻素级分中的量更大，表明该基因在蛇麻腺中有强烈表达。该基因的表达是受含有表达调节区域的核酸控制的，该区域含有在基因组DNA中位于结构基因上游的启动子，并且含有表达调节区域的核酸是上述实施例中分离和鉴定的序列，表明上述分离的含表达调节区域的核酸在蛇麻腺中有特异的强功能。认为在低分子量一侧检测到的信号带是上述获得的基因的mRNA的降解产物。
最近，已经查明查耳酮合成酶可能具有戊酰苯合成酶活性，能够催化苦味物质，α-酸和β-酸的前体，根皮异戊酰苯(phlorisovalerophenone)和根皮异丁酰苯(phlorisobutyrophenone)(欧洲酿造大会，26届会议的会议录，第215页(1997))，表明上述获得的基因的翻译产物可能如戊酰苯合成酶参与苦味物质的生物合成。
因而，如果该蛇麻腺中特异表达的基因编码查耳酮合成酶，该核酸可用于增进植物中的类黄酮。并且，如果该基因编码戊酰苯合成酶，该核酸可用于增进蛇麻中的苦味物质。另外，由于蛇麻苦味物质，α-酸和β-酸，具有医学活性(Biosci．Biotech．Biochem．61(1)，158(1997))，可能将上述核酸用于药物产品。
工业应用如上所述，含有在蛇麻的蛇麻腺中特异表达的基因的核酸可以通过集中于蛇麻腺中表达的次级代谢产物的遗传工程技术进行蛇麻育种。并且，在使用携带上述蛇麻素特异基因的载体时，期望可以在植物体外诸如培养细胞中获得次级代谢产物的产生。由于这类次级代谢产物包括重要的原料诸如食物和药物，并且由于查耳酮合成酶参与类黄酮的生物合成以及戊酰苯合成酶参与苦味物质的生物合成，预期本发明可大大有益于开发和改进食物和药物原料。
另外，本发明的蛇麻素特异性启动子可通过将感兴趣基因插入到启动子下游来增进次级代谢产物诸如蛇麻腺中积累的精油成分和苦味物质。该启动子也可用于向蛇麻引入其它新特征。
明显的，按照上述教导，本发明可以进行多种修改和变化。应当理解在附的权利要求范围内，可不同于此处的具体描述实施本发明。
本申请基于1998年2月19日提交的日本专利申请号Hei 10-37266和1998年6月22日提交的日本专利申请号Hei 10-174235，两者均完整并入本发明作为参考。
序列表(1)一般资料(ⅰ)申请人(A)名字SAPPORO BREWERIES LTD。
(B)街道20-1，Ebisu-4chome(C)城市Shibuya-ku(D)州TOKYO(E)国家日本(F)邮编450-8686(ⅱ)发明题目分离和纯化的含有一个基因及该基因的基因表达的调节区域的核酸(ⅲ)序列数目7(ⅳ)通讯地址(A)联系YOSHIDA Kenji(B)街道34-12，Kichijoji-honcho 1-chome(C)城市Musashino-shi(D)州TOKYO(E)国家日本(F)邮编180-0004(ⅴ)计算机可读形式(A)媒介类型软盘(B)计算机ZBM P兼容机(C)操作系统WINDOWS 95(D)软件Microsoft Word(文本)(ⅵ)目前申请资料(A)申请号未知(B)提交时间1999年2月16日(ⅶ)在先申请资料(A)申请号日本专利申请号Hei 10-37266和日本专利申请号Hei 10-174235(B)提交时间1998年2月19日和1998年6月22日(ⅷ)律师／代理人资料(A)名字YOSHIDA Kenji(B)注册号7525(C)参考号1TP1-0043(ⅸ)电信资料(A)电话0422-21-2501(B)电传0422-21-2431(2)序列1资料(ⅰ)序列特征(A)序列长度394(B)类型氨基酸(ⅱ)序列描述序列11 10 20MetAlaSerValThrValGluGlnIleArgLysAlaGlnArgAlaGluGlyProAlaThr30 40IleLeuAlaIleGlyThrAlaValProAlaAsnCysPheAsnGlnAlaAspPheProAsp50 60TyrTyrPheArgValThrLysSerGluHisMetThrAspLeuLysLysLysPheGlnArg
70 80MetCysGluLysSerThrIleLysLysArgTyrLeuHisLeuThrGluGluHisLeuLys90100GlnAsnProHisLeuCysGluTyrAsnAlaProSerLeuAsnThrArgGlnAspMetLeu110120ValValGluValProLysLeuGlyLysGluAlaAlaIleAsnAlaIleLysGluTrpGly130140GlnProLysSerLysIleThrHisLeuIlePheCysThrGlySerSerIleAspMetPro150160GlyAlaAspTyrGlnCysAlaLysLeuLeuGlyLeuArgProSerValLysArgValMet170180LeuTyrGlnLeuGlyCysTyrAlaGlyGlyLysValLeuArgIleAlaLysAspIleAla190200GluAsnAsnLysGlyAlaArgValLeuIleValCysSerGluIleThrAlaCysIlePhe210220ArgGlyProSerGluLysHisLeuAspCysLeuValGlyGlnSerLeuPheGlyAspGly230240AlaSerSerValIleValGlyAlaAspProAspAlaSerValGlyGluArgProIlePhe250260GluLeuValSerAlaAlaGlnThrIleLeuProAsnSerAspGlyAlaIleAlaGlyHis270280ValThrGluAlaGlyLeuThrPheHisLeuLeuArgAspValProGlyLeuIleSerGln290300AsnIleGluLysSerLeuIleGluAlaPheThrProIleGlyIleAsnAspTrpAsnAsn310320IlePheTrpIleAlaHisProGlyGlyProAlaIleLeuAspGluIleGluAlaLysLeu330340GluLeuLysLysGluLysMetLysAlaSerArgGluMetLeuSerGluTyrGlyAsnMet350360SerCysAlaSerValPhePhelleValAspGluMetArgLysGlnSerSerLysGluGly370380LysSerThrThrGlyAspGlyLeuGluTrpGlyAlaLeuPheGlyPheGlyProGlyLeu390 394ThrValGluThrValValLeuHisSerValProThrAsnVal(3)序列2资料(ⅰ)序列特征
(A)长度1359(B)类型核酸(C)链型双链(D)拓扑线性(ⅱ)分子类型cDNA(ⅹⅰ)序列描述序列2TTTCACAGTA CTACTAGCTA TATATATATC AGGTAATGGC GTCCGTAACT GTAGAGCAAA 60TCCGAAAGGC TCAGCGAGCT GAAGGTCCGG CCACCATCCT CGCCATTGGC ACCGCCGTTC 120CTGCCAACTG TTTCAACCAA GCTGATTTTC CCGACTACTA CTTTCGTGTC ACCAAAAGTG 180AACACATGAC TGATCTCAAA AAGAAGTTCC AACGAATGTG TGAAAAATCC ACTATAAAAA 240AGCGTTACTT GCACTTGACC GAAGAGCATC TGAAGCAGAA CCCACATCTG TGCGAGTACA 300ATGCACCATC TCTGAACACA CGCCAAGACA TGTTGGTGGT TGAAGTTCCC AAGCTTGGGA 360AGGAGGCTGC AATCAATGCC ATCAAAGAAT GGGGCCAACC CAAGTCCAAG ATCACCCATC 420TCATCTTCTG CACCGGCTCC TCCATCGACA TGCCAGGAGC CGATTACCAA TGCGCCAAGC 480TTCTCGGCCT CCGACCCTCG GTGAAGCGAG TGATGCTGTA TCAACTCGGC TGTTATGCCG 540GTGGAAAAGT TCTTCGCATA GCCAAGGACA TAGCAGAGAA CAACAAGGGC GCTAGAGTTC 600TCATTGTGTG CTCTGAGATC ACAGCTTGTA TCTTTCGCGG GCCCTCGGAG AAACATTTGG 660ATTGCTTGGT GGGGCAATCT CTGTTCGGAG ACGGGGCATC TTCGGTCATC GTTGGTGCCG 720ACCCTGATGC CTCGGTAGGC GAGCGGCCGA TCTTCGAGTT GGTTTCAGCT GCGCAGACGA 780TTTTGCCTAA CTCGGATGGA GCCATAGCCG GGCACGTAAC 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权利要求
1．一种分离和纯化的核酸，含有在蛇麻的蛇麻腺中特异表达的基因及其部分。
2．权利要求1的核酸，其中的基因编码至少一种涉及次级代谢产物的生物合成的蛋白质。
3．权利要求2的核酸，其中的由该核酸编码的蛋白质由含有序列1的氨基酸序列。
4．权利要求1的核酸，其中的基因含有序列2的DNA序列。
5．权利要求1的核酸，其中的基因与序列2的DNA序列或其部分杂交。
6．权利要求2的核酸，其中由该核酸编码的蛋白质是查耳酮合成酶。
7．一种载体，含权利要求1的核酸。
8．一种分离和纯化的核酸，含有基因在蛇麻的蛇麻腺中特异表达的调节序列。
9．权利要求8的核酸，其中的调节序列含有一个启动子。
10．权利要求8的核酸，其中的调节序列含有序列7的DNA序列。
11．权利要求8的核酸，其中的调节序列含有序列6的DNA序列或其部分。
12．一种含有权利要求8的核酸的载体。
13．一种由权利要求7的载体转化的植物细胞。
14．一种由权利要求12的载体转化的植物细胞。
15．一种产生转化植物细胞的方法，包括用权利要求7的载体转化植物细胞。
16．产生转化植物细胞的方法，包括用权利要求12的载体转化植物细胞。
17．一种含有序列3、4或5的DNA序列的核酸引物。
18．检测蛇麻素特异表达基因的特异表达的调节序列的试剂盒，含有至少一种具有序列3、4或5的碱基序列的核酸。
全文摘要
一种分离和纯化的核酸,含有在蛇麻的蛇麻腺中特异表达的基因。蛇麻是雌雄异株的,只有雌株结球果,它的蛇麻腺含有提供啤酒苦味和风味的次级代谢产物。这些次级代谢产物含有一些药学有效化合物。为了依靠遗传工程技术通过操纵这些有用的次级代谢产物成分育出更有用的蛇麻品种,本发明提供了分离和纯化的含有在蛇麻的蛇麻腺中特异表达基因的核酸。通过利用该核酸,可以开发使用转化技术和分子选择技术的育种蛇麻新方法。此外,本发明还提供了含有在蛇麻腺中特异表达的基因的调节区域的核酸。该核酸亦可用于蛇麻育种。
文档编号C12N15/29GK1291234SQ99803097
公开日2001年4月11日 申请日期1999年2月16日 优先权日1998年2月19日
发明者冈田行夫, 伊藤一敏 申请人:札幌啤酒株式会社