专利名称：酶催化不对称水解反应制备s－(+)－萘普生的方法
技术领域：
本发明涉及在水饱和非极性有机溶剂中利用脂肪酶催化的萘普生甲酯的不对称水解反应制备S-(+)-萘普生的方法。
化学学科中最困难和最富于挑战的领域之一就是合成光学活性的化合物。酶法动力学拆分对映异构体目前已成为有机化学制备光学活性的化合物普遍采用的方法。为了得到高光学活性的产物，酶要有非常高的对映体选择性。假如反应平衡有利，在一个特定的转化率下，应该可以获得高光学活性的产物(Chen，C.-S.，Wu，S.-H.，Girdauks.G.，et al.Quantitative analyses of biochemicalkinetic resolution of enantiomers.2.Enzyme-catalyzedesterifications in water-organic solvent biphase system.J.AmChem.Soc.1987，109，2812-2817.)。从产量、产品分离难易、反应步骤多少等角度考虑，脂肪酶催化的不对称水解反应是拆分消旋酸(如萘普生)最好的方法(Cambou，B and Klibanov，A.M.，Comparision of different strategies for the lipase-catalyzedresolution of racemic acid and alcoholsasymmetric hydrolysis，esterification，and transesterification.Biotech.Bioeng.，1984，26，1449-1454.)。酶法动力学拆分萘普生常用的是在水溶液中进行的水解反应。由于相对高的水浓度(55.5mol/L)，有利于反应完成。但也有许多缺点(Akita，H.Enoki，Y.Yamada，H.et al.Enzymatic hydrolysis in organic solveints for kineticresolution of water-insoluble a-acyloxy esters withimmobilized lipases.Chem.Pharm.Bull.1988，37 2876-2878；Kise，H.and Tomiuchi，Y.Unusual solvent effect on proteaseactivity and effective optical resolution of amino acids byhydrolytic reactions in organic solvent s.Biotech.Lett.1991，13，317-322；Caron，G.And Kazlauskas，R，J.Sequential resolution of(2，3)-butanediol in organic solvent using lipase.Tetrahedron.Asymmetry.1993，4，1995-2000)首先，底物在水中的低溶解度导致低的反应速度；其次，水中可能发生使产物对映体纯度降低的非选择性化学水解。三是从水中提纯产物有时很困难。四是酶的稳定性较差。选择水-有机溶剂两相体系可以克服萘普生酯在水中溶解度低的问题，可是它也不适合于此反应在两相体系中使用酶，反应器设计较困难。搅拌条件可能会影响到两相界面进而影响反应速度。另外，两相间形成的乳化状态可能会不宜于底物与产物及酶的分离纯化(Halling，P.J.，Biocatalysis in multi-phase reactionmixtures containing organicliquids，Biotech.Adv.1987，547-84)。假如酶能够在有机溶剂中保持活性和立体选择性，另一种选择是在水饱和有机溶剂中进行水解反应，此时底物溶解度高，酶和产物易于分离再利用，酶在有机溶剂中可表现出极高的热稳定性。但不利于水解的反应平衡和一些有机溶剂极低的含水能力可能会阻碍反应达到要求的转化率和对映体过量值。后一个问题可以通过将水用一些溶解度高的亲核试剂如醇或胺代替，进行转酯化或胺解反应来克服。但此时的平衡位点可能仍是不利的。Rekels等(Rakels，J.L.L.，Straathof，A.J.J.，and Hei jnen，J.J.，Improvement ofenantioselective enzymatic ester hydrolysis in organic solvent，TetrahedronAsymmetry，1994，5，93-100)通过在反应混合物中添加非反应胺(吡咯烷)，使之与产物酸形成离子对的方法来解决上述问题，提高了反应的转化率和对映体过量值。但缺少底物水仍是限制因素，所以必须在反应过程中小心地补充消耗掉的水以维持有机溶剂处于水饱和状态。另外，吡咯烷的强碱性(pKA＝11.4)可抑制酶的活性。
本发明的目的在于克服现有技术的不足而提供一种酶催化不对称水解反应制备S-(+)-萘普生的方法。
本发明的目的可由如下措施实现本发明提出了一个在水饱和有机溶剂中进行酶催化水解反应的的方法，通过将酶催化不对称水解反应与光催化醇解反应偶联，在酶催化水解反应原位消除非目的性产物和构建水循环，来克服有机溶剂中不利的反应平衡和含水能力极低问题，达到提高有机溶剂中酶催化萘普生酯水解的对映体选择性的目的。
本发明的方法包括如下步骤a.在水饱和异辛烷中添加柱状假丝酵母脂肪酶和二氧化钛、三氧化二铁光催化剂，搅拌后从混合物中收集得到吸附或沉积在光催化剂表面或内部孔道的固定化脂肪酶。
b.向固定化酶中加入含有底物萘普生甲酯的水饱和异辛烷，在波长为254-365纳米紫外光照射下搅拌反应后，得到S-(+)-萘普生和R-(-)-萘普生甲酯。
在水饱和异辛烷中，脂肪酶可以催化萘普生甲酯发生不对称水解反应(反应式1)，它是一个消耗水的反应，反应进行到一定程度会达到热力学平衡。向该酶催化体系中添加光催化剂，在紫外光照射下会导致萘普生甲酯水解的非目的性产物甲醇光解成CO2和水(反应式2，3，4)。通过将脂肪酶固定在该光催化剂上，在酶水解反应中介入一个光催化的醇解反应原位构建了水循环和消除了非目的性产物，结果增加了水解反应的平衡产率和剩余底物可获得的最大对映体过量值，从而使一定转化率下产物萘普生的对映体过量值增加。
(1)(酶催化的不对称水解反应)(2)(3)(4)(光催化甲醇分解反应)本发明中采用的不对称水解反应催化剂柱状假丝酵母脂肪酶和醇光解光催化剂二氧化钛或三氧化二铁的质量比为1∶2～1∶10。
本发明选用的底物萘普生甲酯的浓度为2毫克/毫升～15毫克/毫升。
本发明与已有技术相比具有如下优点1.通过将生物催化剂固定在光催化剂上的方法，实现反应水的原位循环和非目的性产物的原位消除，增加了平衡产率、剩余底物可获得的最大对映体过量值、一定转化率下产物萘普生的对映体过量值。
2.减小了非目的性产物甲醇对酶的抑制作用。
3.不需要在反应过程中对水解反应消耗的水随时进行补充。
4.水饱和有机溶剂代替水作为反应介质，酶的热稳定性明显提高，防止了水敏性化合物的非选择性化学水解，有利于与化学步骤串接。
现进一步提高最佳实施例来阐述发明的实现方式实施例1本发明在20毫升水饱和异辛烷中添加100毫克柱状假丝酵母脂肪酶和200毫克二氧化钛(P25)(比表面50平方米/克.80％锐钛矿型和.20％金红石型)，或250毫克二氧化钛(A)(比表面7平方米/克.64％锐钛矿型和36％金红石型)，或1000毫克三氧化二铁，搅拌30分钟后倾析去水饱和异辛烷，得到吸附或沉积在不同光催化剂表面或内部孔道的固定化脂肪酶。
分别向上述固定化脂肪酶或100毫克游离酶中加入25毫升含有底物萘普生甲酯的水饱和异辛烷(萘普生甲酯的浓度为10毫克/毫升)，在一个50毫升的锥形瓶中进行反应，在30度，150转/分钟，30瓦，波长为254-365纳米紫外光照射(距反应器10厘米)条件下反应16小时。测定底物的转化率如表1所示表1固定化脂肪酶 对照 二氧化钛(A) 二氧化钛(P25) 三氧化二铁的光催化剂转化率(％)2.39 4.96 7.39 4.40由表1可见，在该水饱和异辛烷体系中，脂肪酶是悬浮在有机溶剂中进行反应的，由于脂肪酶的有机溶剂不溶性，一些酶会聚集成团块，但当光催化剂存在时，脂肪酶被有效地分散并吸附在光催化剂表面，扩散限制减小。正由于这个原因，如表1所示，有光催化剂时反应初始的转化率较高。
实施例2分别向上述固定化脂肪酶或100毫克游离酶中加入25毫升含有底物萘普生甲酯的水饱和异辛烷(萘普生甲酯的浓度为10毫克/毫升)，在一个50毫升的锥形瓶中进行反应，在30度，150转/分钟，30瓦，波长为254-365纳米紫外光照射(距反应器10厘米)条件下反应直到快反应异构体达到平衡，测定反应平衡常数(K)酶的对
映体比率(E)和平衡转化率ξEq，结果见表2表2固定化脂肪酶 光催化剂用量 对映体比率 平衡常数 平衡转化率的光催化剂 (毫克) (E)(K) (ξEq)对照 / 7812.07二氧化钛(P25) 200821.2 45三氧化二铁1000 802.7 27实施例3分别向上述固定化脂肪酶或100毫克游离酶中加入25毫升含有底物萘普生甲酯的水饱和异辛烷(萘普生甲酯的浓度为10毫克/毫升)，在一个50毫升的锥形瓶中进行反应，在30度，150转/分钟，30瓦，波长为254-365纳米紫外光照射(距反应器10厘米)条件下反应，一定时间取样，测定转化率、剩余底物萘普生甲酯的对映体过量值和产物萘普生的对映体过量值，结果如
图1和图2所示。由表3和表4可见，水饱和异辛烷中脂肪酶催化的萘普生甲酯不对称水解反应的底物和产物对映体过量值在一定转化率下是很低的，而在光催化反应存在下，由于产物甲醇被转化成了H2O和CO2，原位构建起了一个水循环。这不仅改变了水解反应的平衡常数(K)和平衡转化率(ξEq)，并由此获得了特定转化率下较高的底物和产物对映体过量值。在萘普生甲酯的立体选择性水解反应中，目标化合物是水解反应的产物(S)-萘普生。由图1可看出，同样转化率下的产物对映体过量值，有光催化反应介入时明显高于无光催化反应。因此为了得到同样的产物对映体过量值，无光催化反应介入的水解反应必须在较低的转化率下终止反应。通过联结入一个醇的光解反应，改变了不对称水解反应的平衡常数(K)，对映体选择性明显提高。
表3
表权利要求
1.一种酶催化不对称水解反应制备S-(+)-萘普生的方法，其特征在于包括如下步骤a.在水饱和异辛烷中添加柱状假丝酵母脂肪酶酶催化剂和二氧化钛、三氧化二铁光催化剂，搅拌后从混合物中收集得到吸附或沉积在光催化剂表面或内部孔道的固定化脂肪酶；b.加入含有底物萘普生甲酯的水饱和异辛烷，在波长为254～365纳米紫外光照射下进行搅拌反应得到S-(+)-萘普生。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于采用的不对称水解反应催化剂柱状假丝酵母脂肪酶和醇光解光催化剂二氧化钛或三氧化二铁的质量比为1∶2～1∶10。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于选用的底物萘普生甲酯的浓度为2毫克/毫升～15毫克/毫升。
全文摘要
本发明公开了一种酶催化不对称水解反应制备S－(+)－萘普生的方法。本发明提出了一种提高脂肪酶在水饱和有机溶剂中水解萘普生酯对映体选择性的方法。通过在酶催化萘普生酯不对称水解反应中接合进一个光催化的醇解反应可以导致甲醇的原位消除和水的原位循环,可克服有机溶剂中不利的反应平衡和含水能力极低问题,达到提高有机溶剂中酶催化萘普生酯水解的对映体选择性的目的,有利于水敏性底物的拆分和提高酶的热稳定性。
文档编号C12P7/40GK1260400SQ9912658
公开日2000年7月19日 申请日期1999年12月18日 优先权日1999年12月18日
发明者辛嘉英, 徐毅, 李树本, 夏春谷, 王来来 申请人:中国科学院兰州化学物理研究所