专利名称：通过转入抗病相关基因进行草鱼,对虾抗病育种的利记博彩app
技术领域：
本发明涉及将抗病基因如人α-干扰素基因转入鱼、虾体内，培育抗病的转基因鱼、虾。本发明还涉及利用鲤鱼β-肌动蛋白基因启动子与人α-干扰素基因构建成在鱼、虾体内表达的重组基因。
草鱼是我国淡水养殖的四大家鱼之一，年产量占我国淡水鱼产量的30％。由于草鱼饵料来源广泛且廉价，而且草鱼肉质细嫩鲜美，广受养殖户和消费者欢迎。目前世界五大洲都有引种养殖。
草鱼由于自身的生理特点，在苗种期易受病害的侵染，如草鱼出血病、草鱼肠炎和烂腮病等。其中草鱼出血病为病毒性(草鱼出血病毒GCHV)传染疾病(毛树坚等，1989)，危害最为严重，高发病期死亡率可达85％，给养殖业造成极大经济损失。我国科学家经过十余年的研究，提出了用疫苗防治的方法，由于水生生物接种疫苗效率低，因而难以普遍推广应用。
对虾是我国沿海海产养殖的重要生物，每年为国家创造数十亿元的税利，而对虾的皮下及造血组织坏死杆状病毒(HHNBV)及肝胰腺细小病毒样病毒(Hepatopancreatic Parvo-like Virus，HPV)病也是危害极严重的暴发性流行疾病(陈世阳，1985)。因此，采用新方法和新技术的抗病育种异常迫切。
鱼类基因工程近年来发展迅速，为基因工程进行鱼类抗病育种提供了技术支持。转生长激素基因鱼已经在国内外取得了实际成效。Hew等(HSC RES&DEV LP，et al.)利用鱼抗冻蛋白基因启动子构建成转基因载体，用于外源基因如生长激素基因的转移，并获得了这一载体的专利；加拿大J.R.White等(小詹姆斯.R.怀特 比尔·波亥吉达克，1997)将人胰岛素基因转入鱼体，用于人糖尿病的治疗；日本山下伸(NIPPON SUISANKAISHA LTD.)则取得了电场转移外源基因进入鱼类卵细胞的方法专利。
本发明的目的在于针对鱼、虾等水生经济动物病毒性疾病，通过转入外源抗病基因，获得转基因个体来进行鱼类抗病的基因工程及育种。本发明所采用的基因启动子为鲤鱼β-肌动蛋白基因启动子，所采用的基因为抗病相关基因如人α-干扰素基因，由此构建成能在鱼体中表达的重组基因。
人α-干扰素是人白细胞在病原侵染时产生的一种广谱抗病毒蛋白，它通过启动一系列抗病基因的表达，促使生物体细胞合成出多种对付病原的蛋白质而抑制病原繁殖，从而起到抗病的作用(侯云德，1990)。本发明人采用草鱼、对虾体细胞离体培养并以干扰素处理及接种病毒的实验，研究了人α-干扰素在鱼、虾细胞抗御相关病毒中的作用。结果表明用一定浓度的人α-干扰素，在病毒接种前1小时以上处理培养细胞，能使细胞免受接种病毒的侵噬。通过向鱼体、虾体注射一定量的人α-干扰素再接种病毒的实验，证明在接种病毒8小时以前将人α-干扰素注入鱼、虾体内，能显著提高其抗性，在病毒接种前48小时注入干扰素，可使鱼、虾的成活率提高40％。这些研究证明人α-干扰素可以显著提高鱼、虾对相应病原的抗性。
当前，通过基因工程技术构建重组分子(基因)已经是一种常规化了的技术。同时采用通用的显微注射法将外源分子注入受精卵细胞，在鱼类转基因操作中有明显优势(Chen，T.T.et al.，1990)。将抗病基因构建成能在鱼体内表达的重组基因，转入草鱼、对虾等水生经济动物受精卵中，并选育出抗病新品种(系)，可望从根本上消除诸如草鱼出血病、对虾病毒病的危害，这是本发明的基本构思。
图1给出了人α-干扰素-鲤鱼β-肌动蛋白基因启动子重组质粒(pCI质粒)的结构。
图2给出了pCI质粒的构建过程。
本发明提供了一种通过转入抗病基因进行草鱼、对虾抗病育种的方法，该方法包括以下步骤1.重组基因构建本发明采用鲤鱼β-肌动蛋白基因启动子作为外源基因在受体中表达的启动子，人α-干扰素基因作为转化的目的基因，通过重组构建成pCI重组质粒，并转化进大肠杆菌中扩增，分离出扩增质粒后，以限制性内切酶Pvu II切下重组基因片段用于显微注射的转化(重组基因结构见附图1) ；2.显微注射转化受体收取草鱼、对虾受精卵，在1-4胞期通过显微操作仪将重组基因溶液注入细胞中的核区。
3.孵化注射外源基因的受精卵按常规方法进行孵化；草鱼在环道流水孵化，对虾在孵化池充氧孵化；4.转基因个体的标记对转基因个体进行编号标记；5.转基因个体的检测转基因鱼、虾先进行病毒抗性筛选，即通过接种病毒的攻毒实验，筛选出具有抗性的转基因个体。抗性个体采血或剪取肌肉组织分离其DNA，进行分子检测和基因表达水平测定。分子检测的具体方法是以转入基因内的特异序列合成一对引物，并用这一对引物对个体DNA样品进行PCR扩增，扩增产物凝胶电泳分离后能观察到特定的分子带的个体即为转基因个体。可通过采用Southern杂交的方法进一步予以确证。基因表达水平测定则以人α-干扰素ELISA检测试剂盒对血清进行定量分析。
6.转基因鱼、虾形成品系转基因个体的饲养按常规进行，性成熟后进行育种，形成转基因鱼、虾品系。具体方法是转基因鱼与普通草鱼杂交，从杂交后代F1中选择转基因的雌雄性个体作同胞间交配，从其后代中选择出外源基因纯合的个体。利用这一纯合个体与普通草鱼杂交，杂种一代用于养殖生产。对虾的育种过程与草鱼育种一致。
实施例1.草鱼的转基因抗病育种1.重组基因的构建鲤鱼β-肌动蛋白基因启动子克隆在通用的质粒载体pUC118中，在基因下游有一多克隆位点，用限制性内切酶SmaI和EcoRI将质粒切开成一端为平末端而另一端为EcoRI粘端的新载体分子。人α-干扰素基因cDNA克隆在通用载体pUC18中，可用PstI和EcoRI两限制性内切酶切下，先用PstI切开质粒成线性分子，再用核酸酶S1对线性分子进行有限酶解以将PstI的粘端切平，然后用EcoRI从分子上切下0.9kb的α-干扰素cDNA片段并经低熔点胶回收。
将新载体分子和回收的cDNA 0.9kb片段按1∶2分子比例混合，加入2个单位的T4 DNA连接酶，14℃连接16小时，转化感受态大肠杆菌，在氨苄青霉素和X-gal培养基上筛选阳性菌落。
阳性菌落扩增培养后分离质粒，对质粒进行限制性酶切、Southern杂交、顺序测定分析，确证获得正确的重组基因。
以限制性内切酶PvuII，对大量质粒分子酶切，并回收4kb分子，作为显微注射的基因分子(构建过程详见附图2)。
2.获得草鱼受精卵亲本草鱼人工注射催情激素，在约16小时后出现交尾现象，用纱网从交配池捞起刚产出的受精卵，置培养皿中在显微镜下观察，选择1-4胞期的受精卵进行显微注射。
3.显微注射转化草鱼受精卵按显微注射的常规方法，在显微镜下利用显微注射仪将5nl重组基因溶液约107-108分子注入受精卵细胞核中。
4.注射后的孵化注射后受精卵按常规草鱼孵化，即置于孵化池流水孵化。受精16小时后鱼花孵出，三天后出孵化池置发花池常规饲养。
5.转基因草鱼饲养按普通草鱼饲养。
6.攻毒实验转基因草鱼长至4月龄长约15-20cm，接种3.5倍半数致死量的草鱼出血病毒，筛选抗性草鱼。
7.PCR检测从抗性鱼尾动脉取血1ml，离心将血细胞和血清分离，从血细胞中按常规方法分离DNA，用于PCR检测。针对转入基因的顺序，设计一对25个碱基的特异引物，引物Tm为45℃，50ngDNA、5ppm引物、1.5mMMg+2、94℃变性5分钟、94℃变性1分钟→54℃复性30秒→72℃延伸45秒，30次循环扩增。抗性鱼80％有特异扩增带。
8.ELISA检测人α-干扰素ELISA检测试剂盒购于邦定生物医学公司(BiotingeBiomedicine Co.)，检测使用按生产商说明进行，显色后在酶标仪中测定吸光度并对照标准曲线，了解测定样品中α-干扰素的浓度。
9.转基因鱼育种形成品种(系)适效表达外源基因的转基因个体，常规饲养约四年至性成熟，即可进行常规育种。具体方法是转基因鱼与普通草鱼杂交，从杂交后代F1中选择转基因的雌雄性个体作同胞间交配，从其后代中选择出外源基因纯合的个体。利用这一纯合个体与普通草鱼杂交，杂种一代用于养殖生产。
实施例2.对虾的转基因抗病育种1.重组基因的构建重组基因构建同实施例1。
2.获得对虾受精卵对虾亲本置于暗房内交配，用流水冲洗受精卵，在显微镜下挑选出1-4胞期前的受精卵用于显微注射。
3.显微注射转化受精卵显微操作同实施例1。
4.注射后的孵化显微注射后的受精卵置孵化池，以充氧泵充氧孵化。
5.转基因虾的饲养按常规饲养方法饲养。
6.攻毒实验人工喂毒感染对虾。具体方法是以感染相应病毒病致死的对虾，去头部、尾部甲壳及附属物，取头胸部切碎作为病料，在23～28℃充气海水30L槽中饲喂体长长至2～3cm的转基因对虾，每槽10尾，投病料1.0g。5天后仍存活的对虾作检测分析。
7.PCR检测PCR检测同实施例1，但从肌肉组织中分离DNA。具体方法是从抗性对虾腹下剪取小团肌肉(约10mg)，按肌肉细胞DNA分离的常规方法分离DNA，以人α-干扰素基因内特异序列的引物对其进行PCR扩增。PCR阳性抗病个体用于杂交育种。
8.转基因抗病对虾育种PCR阳性个体与普通对虾杂交，从F1代中筛选抗病个体，并进行PCR检测，抗病同时为PCR阳性的雄性个体与雌性个体交配，获得F2代。从F2代中可选出转基因纯合的个体，用于杂交育种的亲本，与普通对虾杂交，杂种一代用于生产。
本发明主要参考文献有毛树坚等，1989，草鱼出血病的病原研究，水产学报，13(1)1～4。
陈世阳，1985，对虾的病毒性疾病，国外水产，(4)41～43。
侯云德，1990，分子病毒学，北京学苑出版社.
小詹姆斯.R.怀特比尔.波亥吉达克，1997，治疗糖尿病的转基因鱼，中国专利
发明者章怀云, 张学文, 符少辉 申请人:章怀云