专利名称：通过发酵生产l－谷氨酸的方法
技术领域：
本发明涉及一种通过发酵来生产L-谷氨酸的方法。L-谷氨酸是一种重要的氨基酸，被应用于食品，临床药物及其它方面。
背景技术：
传统上，L-谷氨酸主要是通过发酵，用属于短杆菌属、棒状杆菌属或微菌属的所谓的生产L-谷氨酸棒状细菌或其突变体进行生产的(Amino Acid Fermentotios，Gakkai Shuppan Center，195-215(1986))。已知的使用其它细菌菌株来生产L-谷氨基的发酵方法有使用包括杆菌、链霉菌以及青霉素的微生物的方法(美国专利第3,220,929号)；以及使用包括假单孢菌属、节核细菌属、沙雷氏菌属以及假丝酵母的微生物的方法(美国专利第3,563,857号)。虽然通过使用传统的方法已经可以大大提高L-谷氨酸的生产能力，但是为了满足日益增加的需求，仍需要发展一种更有效、更廉价的生产L-谷氨酸的方法。
L-谷氨酸是由微生物细胞内柠檬酸循环的中间产物α-酮戊二酸通过生物合成而来的。由α-酮戊二酸通过铵离子的同化作用来形成L-谷氨酸的生物合成途径有两条。其中一条途径是在有高浓度的铵离子存在的情况下，通过谷氨酸脱氢酶(glutamate dehydrogenase，下文称“GDH”)的催化来合成L-谷氨酸。另外一条途径(GS/GOGAT途径)是由谷氨酰胺合成酶及谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶来合成L-谷氨酸。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase，下文称“GS”)催化L-谷氨酸和铵离子转化为谷氨酰胺的反应；谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶(glutamine-oxoglutaric acid amino transferase，也称“谷氨酸合成酶”(glutamate synthase，下文称“GOGAT”)催化L-谷氨酸合成反应，在该反应中，由已经由GS合成的一分子的谷氨酰胺和一分子的α-酮戊二酸分子合成两分子的L-谷氨酸。迄今为止，利用细菌菌株GDH途径生产L-谷氨酸并通过提高其GDH活性来增强L-谷氨酸生产的方面已有报道，但是利用细菌菌株GS/GOGAT途径生产L-谷氨酸并使其生产得以增强的方法尚不知晓。
本发明的说明本发明的一个目的是培养能高效生产L-谷氨酸的细菌菌株并提出一种更有效、更廉价的L-谷氨酸生产方法，以满足对L-谷氨酸的日益增长的需求。
本发明的发明者们已经使用其GOGAT活性得到增强的细菌菌株对L-谷氨酸的生产方法进行了研究，上述的GOGAT是参与GS/GOGAT途径的其中一种酶，它催化L-谷氨酸的生成。结果发明者们发现，当能够生产L-谷氨酸的细菌菌株的GOGAT活性被增强时，其生产L-谷氨酸的能力即得以提高，这样即完成了此发明。
也就是说，本发明提供了一种属于棒状杆菌属的细菌菌株，这一菌株具有生产L-谷氨酸的能力，其细胞中的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活性被增强。这种谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶活力的增强可以通过增加编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶基因的拷贝数来完成。另外，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶活性的增强也可以通过改变编码该酶基因的表达调控序列来完成。谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶可以得自属于埃希氏杆菌属或棒状杆菌属的微生物。
另外，本发明还提供了一个编码氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因，它包含的核苷酸序列至少对应于SEQ ID NO7中所描述的核苷酸序列的第565-6614位。
而且，本发明还提供了一种通过发酵来生产L-谷氨酸的方法，包括在液体培养基中培养一种属于棒状杆菌属的细菌菌株，该菌株具L-谷氨酸生产能力，其细胞内的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活力被增强；在培养基中生产并积累L-谷氨酸；以及从该培养基中回收L-谷氨酸的步骤。
本发明将在下面作详细说明。(1)属于棒状杆菌属的具有生产L-谷氨酸能力的细菌此处所指的属于棒状杆菌属的细菌是一组在Bergey′s Manual ofDeterminative Bacteriology第8版第599页(1974)中所定义的微生物。这些细菌是好氧、革兰氏阳性、不具有形成芽孢的能力的不耐酸杆菌，同时包括一些曾经被分类为短杆菌属而现在被统一到棒状杆菌属的细菌(见Int.J.Syst.Bacteriol.，41，225(1981))，以及与棒状杆菌属紧密相关的短杆菌属及微菌属中的一些细菌。在上述的属于棒状杆菌属的细菌中，列于下面的已知是L-谷氨酸生产细菌的，是本发明中最优选的。
嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum)美棒杆菌(Corynebacterium callunae)谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)Corynebacterium lilium(Corynebacterium glutamicum)Corynebacterium melassecolaBrevibacterium divaricatum(Corynebacterium glutamicum)Brevibacterium lactofermentum(Corynebacterium glutamicum)解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolyticum)Brevibacterium immariophilium玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum)Brevibacterium flavum(Corynebacterium glutamicum)生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis)具体地说，这些细菌中的下列菌株被作为例子采用嗜乙酰棒杆菌(Corynebacterium acetoacidophilum)ATCC 13870醋谷棒杆菌(Corynebacterium acetoglutamicum) ATCC 15806美棒杆菌(Corynebacterium callunae)ATCC 15991谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13032谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 13060Brevibacterium divaricatumATCC 14020Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869Corynebacterium liliumATCC 15990Corynebacterium melassecola ATCC 17965解糖短杆菌(Brevibacterium saccharolvticum)ATCC 14066Brevibacterium immariophilium ATCC 14068玫瑰色短杆菌(Brevibacterium roseum) ATCC 13825黄色短杆菌(Brevibacterium flavum) ATCC 13826生硫短杆菌(Brevibacterium thiogenitalis) ATCC 19240这些菌株可以从美国典型培养物保藏中心(ATCC)获得。每种细菌菌株都指定了一个保藏号。任何人都可以根据保藏号从ATCC中获得相应的细菌菌株。在ATCC的目录中描述了保藏于ATCC中的细菌菌株的保藏号。
当用上述的属于棒状杆菌属的细菌生产L-谷氨酸时，采用下述的任一方法都是可行的。
1.使培养基中生物素的浓度不达到最理想值。参阅S.Okumura，T.Tsugawa，T.Tsunoda及A.Kitai，Nippon Nogeikagaku Kaishi，36，197-203(1962)。
2.如果培养基中含足量的生物素，则向其中加入表面活化剂。参阅I.Shiio，H.Otsuka及N.Atsuya，J.Biochem.，53，333-340(1963)；K.Takinami，H.Okada及T.Tsunoda，Agr.Biol.Chem.，27，853-863(1963)。
3.如果培养基中含足量的生物素，则向其中加入青霉素。参阅美国专利第3,080,297号；日本专利公开第37-1695号(1962)；M.Shibui，T.Kurima，S.Okabe及T.Osawa，Amino Acid and Nucleic Acid，17，61-65(1968)。
另外，还可以通过使用以上所述的属于棒状杆菌属的细菌的突变体的方法来生产L-谷氨酸。值得提及的突变体有Brevibacterium lactofermentum AJ 12745(FERM-BP 2922)；见美国专利第5,272,067号。
Brevibacterium lactofermentum AJ 12746(FERM-BP 2923)；见美国专利第5,272,067号。
黄色短杆菌(Brevibacterium flavum)AJ 12747(FERM-BP2924)；见美国专利第5,272,067号。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)AJ 12478(FERM-BP 2925)；见美国专利第5,272,067号。
谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum) ATCC 21492。
在本发明中上述的产L-谷氨酸细菌是最优选使用的。(2)GOGAT活性的增强细菌细胞中GOGAT活性可以这样来增强连接编码GOGAT的基因片段与在棒状杆菌属细菌中发挥功能的载体以构建重组DNA，把这一重组DNA引入棒状杆菌属细菌的宿主菌株中对其进行转化，从而增强该细菌细胞中GOGAT的活性。GOGAT是由大小亚基组成的异寡聚物，其中大小亚基分别由gltB及gltD基因编码。在转化菌株细胞中编码GOGAT的基因(下文称“gltBD基因”)拷贝数的增加导致了GOGAT活性的增强。
至于gltBD基因，属于棒状杆菌属的细菌的基因以及来源于包括大肠杆菌的其它生物体的基因都可被使用。得自属于棒状杆菌属的细菌的gltBD基因的核苷酸序列尚未知道，但大肠杆菌K-12(Gene，60，1-11(1987))以及酵母(Saccharomyces cerevisiae，GenBank访问号码X89221)的gltBD基因的核苷酸序列早已被阐明。因此，可以根据这些gltBD基因的核苷酸序列合成引物，并通过PCR方法用从例如大肠杆菌K12及Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869中制备的染色体DNA当模板获得这些微生物的gltBD基因。这些引物可以由SEQ IDNos3-6中所示的引物来举例说明。在随后所述的实施例中所分离的Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因的核苷酸序列示于SEQ ID NO7中。Brevibacterium lactofermentum的gltBD基因是一新颖的基因。
至于用于基因克隆的质粒，任何可以在如大肠杆菌的微生物细胞中复制的质粒都是可用的，而pBR322、pTWV228、pMW119以及pUC19则被具体地举例说明。
此处所指的在棒状杆菌属细菌中发挥功能的载体是，例如，一种可以在棒状杆菌属细菌中自主复制的质粒。下列的是载体的一些具体的例子。
pAM 330，见日本专利申请公开58-67699号(1983)pHM 1519，见日本专利申请公开58-77895号(1983)pAJ 655，见日本专利申请公开58-192900号(1983)pAJ 611，见日本专利申请公开58-192900号(1983)pAJ 1844，见日本专利申请公开58-192900号(1983)pCG 1，见日本专利申请公开57-134500号(1982)pCG 2，见日本专利申请公开58-35197(1983)pCG 4，见日本专利申请公开57-183799号(1982)pCG 11，见日本专利申请公开57-183799号(1983)为了通过连接编码GOGAT的gltBD基因及在棒状杆菌属细菌的细胞中发挥功能的载体来制备重组DNA，用与gltBD基因末端相应的限制性酶对载体进行消化。连接通常是用连接酶，如T4 DNA连接酶来进行的。
当要把如上述所制备的重组DNA导入到棒状杆菌属细菌中时，可以采用任何已知的转化方法。例如，可用的一种方法是用氯化钙对受体细胞进行处理以增加DNA的通透性，这一方法已被报导用于大肠杆菌K-12中(见Mandel，M.及Higa，A.，J.Mol.Bid.，53，159(1970))；可用的另一种方法是用处于生长期的细胞制备感受态细胞随后再把DNA导入其中，这一方法已被报导用于枯草杆菌中(见Duncan，C.H.，Wilson，GA.及Young，F.E.，Gene，1，153(1977))。除此之外，可用的另一种方法是把DNA受体细胞制成原生质体或原生质球形体，它们在重组DNA被导入细胞之后可以容易地吸收重组DNA，这种方法已知可被用于枯草杆菌、放线菌类及酵母中(见Chang，S.及Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet.，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.及Hopwood，O.A.，Nature，274，398(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.及Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。
在本发明的实施例中所用的转化的方法是电脉冲法(参阅日本专利申请公开2-207291号)。
GOGAT活性的增强也可以通过把多拷贝的gltBD基因导入到上述宿主菌株的染色体DNA中。为了把多拷贝的gltBD基因导入到棒状杆菌属细菌的染色体DNA中，用在染色体DNA中有多拷贝的序列作为目标进行同源重组。可被使用的在染色体DNA上存在多拷贝的序列有重复性DNA、转座元件末端的反向重复序列。而且，如日本专利申请公开2-109985号中所揭示的，可以把gltBD基因整合到转座子中并让转座子转移以把多拷贝的gltBD基因导入到染色体中。通过任何一种方法都可以使经转化的菌株细胞中gltBD基因的拷贝数增加，结果使GOGAT活性增强。
除了上述的基因扩增法之外，GOGAT活性的增强还可以通过把gltBD基因的表达调控序列，如启动子替换成更强的来实现。例如，已知的强有力的启动子有lac启动子、trp启动子、trc启动子、tac启动子、以及λ噬菌体的PR及PL启动子。通过把gltBD基因固有的启动子替代成这些启动子即可增强gltBD基因的表达，从而增强GOGAT的活性。(3)使用本发明的细菌菌株生产L-谷氨酸。
通过使用一种具L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌属细菌菌株(这一菌株细胞中的GOGAT活性已被增强)即可以普通的方法来生产L-谷氨酸，上述方法使用含有碳源、氮源、无机盐并根据需要含有其它次要有机营养物，如氨基酸及维生素的普通营养培养基。任何可以被用于待培养的细菌菌株的碳源及氮源都可被用于培养基中。
一些糖类，如葡萄糖、甘油、果糖、蔗糖、木糖、甘露糖、半乳糖、淀粉水解物以及糖蜜被用作碳源。而其它的有机酸如乙醇及柠檬酸也可被单独用作碳源，或与其它的碳源结合使用。
可用作氮源的是氨、铵盐如硫酸铵、碳酸铵、氯化铵、磷酸铵以及乙醇铵或者硝酸盐。
至于次要有机营养物，氨基酸、维生素、脂肪酸、核酸以及蛋白胨、酪蛋白氨基酸、酵母提取物以及大豆蛋白水解物这些含有上述营养成分的物质都可被使用。如果使用的是需要氨基酸或其它物质用于生长的营养突变型的突变体，则应该补充必需的营养物质。
可用作无机盐的有磷酸盐、镁盐、钙盐、铁盐、锰盐等等。
至于培养方法，培养是在有氧条件下进行的，发酵温度被控制在20至45℃之间，而pH值刚被控制于5至9之间。如果pH值在培养的过程中降低了，则加入碳酸钙或用碱性物质如氨气对培养基进行中和。如此培养10小时至4天之后，在培养基中即可积累大量的L-谷氨酸。
至于在培养后从培养基中回收L-谷氨酸的方法，任何已知的回收方法都可被使用。例如，可以在把细胞从培养基中除去之后用浓缩结晶法来收集产物。或者也可以用离子交换层析或其它方法。
附图的简要说明
图1中所示的是质粒pBD35-43的构建过程。
优选实施方案的描述以下参照实施例对本发明进行更具体的解释。实施例1(1)大肠杆菌K-12gltBD基因的克隆大肠杆菌K-12的gltBD基因的核苷酸序列是已知的(Gene，60，1-11(1987))。以上述报导的核苷酸序列为基础，合成了如序列表中SEQID NOs1及2中所示的引物并根据PCR方法用源于大肠杆菌K-12的JM 109菌株的染色体DNA(由Takara Shuzo Co.，Ltd生产)为模板对gltBD基因进行扩增。
在所合成的引物中，SEQ ID NO1对应于在Gene，60，6(1987)中所描述的gltBD基因核苷酸序列图中的第57至96位核苷酸，但是在引物中，第77及第78位核苷酸被从A替换为G，而且已在其中插入了限制性酶GamHI的识别位点。SEQ ID NO2对应于在Gene，60，7(1987)中所描述的gltBD基因核苷酸序列图中的第6261至第6290位核苷酸，但是在引物中，第6380位核苷酸被从T替换为G，第6282位核苷酸被从A替换成T，第6284位核苷酸被从A替换成C，这样就插入了限制性酶BamHI的识别位点。而且SEQ ID NO2中所示的核苷酸序列是在Gene，60，7(1987)中所描述的核苷酸序列图中第6261至6290位核苷酸的互补链，是从5′端开始的。
大肠杆菌K-12染色体DNA的制备是根据通常的方法进行的(Seibutsu-kogaku Jikken-sho，Nihon Seibutsu Kougaku-kai编辑，97-98，Baifu-kan，(1992))。而且，PCR反应也是用PCRTechnology(Henry Enrich编辑，Stockton Press，1989，第8页)中所描述的标准反应条件进行的。
把获得的PCR产物用通常的方法进行纯化，然后用限制性酶BamHI对其进行处理，接着用连接试剂盒把其与已经BamHI消化的pMW219(由Nippon Gene Co.，Ltd.生产)相连接，然后用大肠杆菌JM 109(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)的感受态细胞进行转化。然后把细胞涂布在含有10μg/ml IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、40μg/mlX-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)以及25μg/ml卡拉霉素的L培养基(10g/l细菌用胰蛋白胨，5g/l细菌用酵母提取物、15g/l NaCl，15g/l琼脂，pH7.2)上并培养过夜，然后挑出所形成的白色菌落并把其分离为单一菌落以获得转化菌株。
用碱法从转化菌株制备质粒(Seibutsu-kogaku Jikken-sho，NihonSeibutsu Kogaku-kai编辑，105，Baifu-kan，(1992))，然后给已被插入到载体中的DNA片段制作一张限制性位点图谱，然后根据它与已报导的gltBD基因限制性位点图谱的比较，把在其中已经插入了一个其限制性位点图谱与已报导的图谱一致的DNA片段的质粒命名为pMWGOGAT35。
另外，为了证实gltBD基因已被表达，用电穿孔法把pMWGOGAT35导入到缺乏gdh及gltB并有L-谷氨酸需求的大肠杆菌PA340菌株中。结果，导入了pMWGOGAT35的转化菌株的L-谷氨酸需要消失了，这样，gltBD基因的表达即得确证实。(2)构建一个含有大肠杆菌K-12 gltBD基因及一棒状杆菌属细菌复制起始位点的质粒。
图1中示出了构建一个含有大肠杆菌K-12 gltBD基因以及棒状杆菌属细菌复制起始位点的质粒的过程。具体地说，用限制性酶BamHI及KpnI对质粒pHK4(日本专利申请公开5-7491号)进行消化(这一质粒带有来源于可以在棒状杆菌属细菌中自主复制的质粒pHM 1519(Agric.Biol.Chem.，48，2901-2903(1984)的复制起始位点(日本专利申请公开Hei 5-7491号))以获得包括复制起始位点的基因片段，然后用DNA切齐试剂盒(由Takara Shuzo Co.，Ltd.，Blunting Kit)把所得片段的末端切齐，然后把这一片段导入到质粒pMWGOGAT 35的XbaI位点上，此前在质粒pMWGOGAT中已经用XbaI连接序列(由TakaraCo.，Ltd.生产)插入了被克隆的大肠杆菌K-12菌株的gltBD基因。把这一质粒命名为pBD 35-43。(3)把pBD 35-43导入棒状杆菌属AJ 12036及AJ 13029的野生型细菌株菌中并通过培养来估计所获得的转化子用电脉冲法(参照日本专利公开公告2-207791号)用质粒pBD35-43对棒状杆菌属AJ 12036(Agric.Giod.Chem.，51，93-100(1987))及AJ 13029的野生型细菌株菌进行转化并获得转化菌株。培养通过在野生型菌株AJ 12036中导入质粒pBD 35-43而获得的转化菌株AJ 12036/pBD 35-43以便在下述的生物素限制条件下生产L-谷氨酸。把培养在含有25μg/ml卡拉霉素的CM2B培养基平板上的AJ12036/pBD35-43菌株的细胞接种在培养基(80g葡萄糖、1g KH2PO4、0.4g MgSO4·7H2O、30g(NH4)2SO4、0.01g FeSO4·7H2O、0.01gMnSO4·7H2O、15ml大豆水解物、200μg盐酸硫胺素、60μg生物素、25mg卡拉霉素、50g CaCO3加入1升纯水中，用KOH调到pH8.0)中，细胞在31.5℃下振荡培养，直到培养基中的糖耗尽为止。把所获得的培养物接种在不加生物素和卡拉霉素的上述培养基(下文称“生物素限制培养基”)中，培养数量为5％，31.5℃振荡培养直到培养基中的糖耗尽为止。在对照实验中，用如上所述的同样的方法培养AJ 12036菌株。培养完成之后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产的Biotech Analyzer AS-210测量培养基中所积累的L-谷氨酸的数量。所得结果示于表1中。
表1
另外，通过把质粒pBD 35-43导入AJ 13029菌株获得转化菌株AJ13029/pBD 35-43并如下进行培养以生产L-谷氨酸。把培养在含有25μg/ml卡拉霉素的CM2B培养基平板上的AJ 13029/pBD35-43菌株的细胞接种到培养基(30g葡萄糖、1g KH2PO4、0.4g MgSO4·7H2O、30g(NH4)2SO4、0.01g FeSO4·7H2O、0.01g MnSO4·7H2O、15ml大豆水解物、200μg盐酸硫胺素、60μg生物素、25mg卡拉霉素以及50g CaCO3加入到1升纯水中，用KOH调到pH8.0)，在31.5℃进行振荡培养直到培养基中的糖耗尽为止。以5％的量将获得的培养物接种进相同组成的培养基中，然后在37.0℃振动培养直至培养基中的糖耗尽为止。作为对照，用如上所述的同样方法培养AJ 12029菌株。培养完成后，用Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产的Biotech AnalyzerAS-210测量培养基中所积累的L-谷氨酸的数量。所得结果示于表2中。AJ 12029菌株是在WO 96/06180中所描述的一种菌株，它对生物素活性抑制物质具温度敏感性。这一菌株被根据布达佩斯条约保藏于National Institute of Bioscience and Human Technology，Agencyof Industrial Science and Technology，Ministry of InternationalTrade and Industry(邮编305-8566，1-3 Higashi 1-Chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，Japan)中。这一菌株的保藏号为FERM BP-5189。
表
><p>SEQ ID NOs3及4中所示的寡核苷酸是根据由在大肠杆菌和酵母中高度同源的gltB基因产物的选定区域的氨基酸序列推断而得的核苷酸序列合成的。用Bacterial Genomic DNA纯化试剂盒(由Advancedgenetic Technologies Corp.生产)制备Brevibacterium lactofermentumATCC 13869的染色体DNA。以上述的寡核苷酸为引物、以染色体DNA为模板，用“PCR Technology”(Henry Enrich编辑，Stockton Press，1989，第8页)中所描述的标准反应条件进行PCR反应。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现扩增出了一个长度大概为1.4Kbp的DNA片段。用SEQ ID NOs3及4中的寡核苷酸对所得DNA的两端进行测序。测序是用DNA测序试剂盒(由Applied Biosystems Co.，Ltd.生产)根据Sanger的方法(J.Mol.Boil.，143，161(1980))进行的。把所确定的核苷酸序列翻译为氨基酸并把这一氨基酸序列与由大肠杆菌及酵母的gltB基因推断的氨基酸序列进行比较。结果，因为存在高度的同源性，所以可以下结论由PCR扩增的DNA片段是Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869的gltB基因的一部分。然后，用通常的方法用ECoRI、BamHI、HindIII、PstI以及SalI(由Takara Shuzo Co.，Ltd生产)对通过上述方法所制备的Brevibacterium lactofermentumATCC 13869染色体DNA进行消化并用经扩增的DNA片段作为探针以及DIG DNA标记及检测试剂盒(由Boeringer Mannhein生产)进行Southern杂交。结果发现有由HindIII酶切而得的大约14kb的片段与DNA探针发生杂交。这样，用琼脂糖凝胶对用通常方法制备的Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869染色体DNA的HindIII片段进行电泳，并用玻璃粉回收了大约10kb大小或更大的DNA片段。用连接试剂盒(Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)把经回收的DNA片段连接到已经限制性酶HindIII(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)酶切的载体pMW219(由Nippon Gene Corporation生产)上。用连接混合物对大肠杆菌JM109(由Takara Shuzo Co.，Ltd.生产)的感受态细胞进行转化。把转化菌株涂布在含有10μg/ml IPIG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)、40μg/ml X-Gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)以及25μg/ml卡拉霉素的L培养基(10g/l细菌用胰蛋白胨，5g/l细菌用酵母提取物，15g/l NaCl，15g/L琼脂糖，pH7.2)，培养过夜。把由此获得的白色菌落挑起来并把其分离为单菌落，获得大约1000个转化菌株。使用所获得的转化菌株，用碱性法(Seibutsu-kogaku Jikken-sho，Nihon Seibutsu-kogaku Gakkai，105，Baifu-kan，(1997))制备质粒。用如上所述的条件，用含有如SEQ ID NOs5及6中所示的核苷酸序列且是根据DNA序列中被用作探针的被测序的那一部分进行合成的合成寡核苷酸当引物，并且用上述的质粒当模板，进行PCR反应。然后挑选出那些能够扩增出长度大概为1.3kbp的片段的转化菌株，这一扩增片段与用上述引物并用Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的染色体当模板进行PCR反应所扩增出来的DNA片段大小是相同的。(2)Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869 gltBD基因核苷酸序列的测定从在(1)中通过碱法获得的转化菌株制备的质粒DNA含有来源于Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869染色体的大约为14kbp的DNA片段。用与如上所述同样的方法测定了来源于Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869染色体的长度大约为14kbp的DNA片段中所含的gltBD基因的核苷酸序列。
SEQ ID NO7中所示的如上所测定的这些核苷酸序列中含有gltBD基因的AatII片段。从核苷酸序列分析可以假定存在有两个开放阅读框。SEQ ID NO7中还示出了从核苷酸序列推定的翻译产物的氨基酸序列。也就是说，编码两个含有SEQ ID NO7中所示氨基酸序列的蛋白质的基因是Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因。在这一序列中，第565至5094号核苷酸对应于gltBD基因，第5097至6614则对应于gltD基因。SEQ ID NOs8及9分别示出了由gltB基因及gltD基因所编码的氨基酸序列。顺便提一下，由于位于蛋白质N端的甲硫氨酸残基是源于起始密码ATG的，所以这一残基通常与蛋白质自身的功能并不存在联系，而且公知的是它在翻译后将由肽酶除去。相应地，在上述蛋白质的情形中，甲硫氨酸残基也可能被除去了。
把核苷酸序列及氨基酸序列与已知的序列进行同源性比较。所用的数据库是EMBL及SWISS-PROT。结果发现，SEQ ID NO7中所示的DNA是棒状杆菌属细菌中一个新的基因，它与已被报导的大肠杆菌、酵母等等的gltBD基因具同源性。(3)制备含有Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因以及棒状杆菌属细菌的复制启始位点的质粒为了研究Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因的扩增效力，构建了一个含有Brevibacterium lactofermentum ATCC13869的gltBD基因以及棒状杆菌属细菌的复制启始位点的质粒。具体地说，用限制性酶AatII剪切质粒DNA，这一DNA含有源于Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869染色体的大约为14kbp的DNA片段，这一片段是从在(1)中获得的转化菌株用碱法制备的。剪切后获得含有Brevibacterium lactofermentum ATCC 13869的gltBD基因的DNA片段，把所得的这一片段的末端用DNA切平试剂盒(由Takara Shuzo Co.，Ltd生产，Blunting Kit)切平，然后把其插入到质粒pVC 7中限制性酶SmaI的位点中，其中质粒pVC 7含有源于质粒pAM 330的复制起始位点，而质粒pAM 330可以在棒状杆菌属细菌中自主复制(日本专利申请公开Sho 58-67699号)。这一质粒被命名为pVCGOGAT。把pHSG 399(一种大肠杆菌载体，Cmr；Takeshita，S.等人，Gene，61，63-74(1987)与pAM 330(一种Brevibacterium lactofermentum的隐藏质粒)连接在一起以构建质粒pVC 7。pAM 330是用Brevibacteriumlactofermentum ATCC 13869菌株制备的。用仅产生一个剪切位点的限制性酶AvaII(Takara Shuzo生产)对pHSG 399进行酶解，然后用T4DNA聚合酶把末端切平，再把其与已经过HindIII(Takara Shuzo生产)酶解并用T4 DNA聚合酶切平末端的pAM 330相连接。PVC 7在大肠杆菌及Brevibacterium lactofermentum中都可以自主复制并含有源于pHSG 339及lacZ′的多克隆位点。
进而，为了证实gltBD基因已被表达，用电穿孔法把pVCGOGAT导入到缺少gdh及gltB并有L-谷氨酸需求的大肠杆菌PA 340菌株(E.Coli Genetic Stock Center(Yale University，U.S.A.))中。结果发现，含有pVCGOGAT的转化菌株不再对L-谷氨酸有需求，从而由此证实gltBD基因已被表达。(4)把pVCGOGAT导入到棒状杆菌属AJ 12036细菌野生型菌株中并对其估计其培养的情况通过电脉冲法(日本专利出版公开Hei 2-207791号)用质粒pVCGOGAT对棒状杆菌属AJ 12036细菌(Agric.Biol.Chem.，51，93-100(1987))的野生型菌株进行转化以获得转化菌株。把通过把质粒pVCGOGAT导入到AJ 12036野生型菌株而获得的转化菌株AJ12036/pVCGOGAT在如下的生物素限制条件中进行培养以生产L-谷氨酸。把通过培养于含有5mg/ml氯霉素的CM2B培养基平板而获得的AJ12036/pVCGOGAT菌株的细胞接种在培养基(80g葡萄糖、1gKH2PO4、0.4g MgSO4·7H2O，30g(NH4)2SO4、0.01gFeSO4·7H2O、0.01g MnSO4·7H2O、15ml大豆水解液、200μg盐酸硫胺素、60μg生物素、10mg氯霉素、50g CaCO3，加入到1升的纯水中，用KOH调到pH 8.0)中并在31.5℃振荡培养，直至培养基中的糖耗尽为止。
把所得的培养物以5％的数量接种到不含有生物素及氯霉素的上述培养基(下文称“生物素限制培养基”)中并在31.5℃振荡培养，直至培养基中的糖耗尽为止。作为对照，用如上所述的同样方法培养通过把pVC7用如上所述方法导入到AJ 12036菌株中而制备的细菌菌株。培养之后，用Biotech Analyzer AS-210(Asahi Chemical Industry Co.，Ltd.生产)测量培养基中所积累的L-谷氨酸的数量。结果示于表3中。
表3
工业实用性根据本发明的方法，属于棒状杆菌属的能够生产L-谷氨酸的细菌菌株，当其GOGAT活性被增强时，其L-谷氨酸的生产能力即可被提高，从而使L-谷氨酸的生产变得更加廉价和有效。而且，获得源于棒状杆菌属细菌的gltBD基因并把其有效地用于棒状杆菌属细菌的谷氨酸生产。
序列表<110>AJINOMOTO CO.，INC.<120>通过发酵生产L-谷氨酸的方法<130>OP 778<140>PCT/JP98/03535<141>1998-08-07<150>JP 9-216906<151>1997-08-12<160>9<170>PatentIn Ver.2.0<210>1<211>30<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述用于扩增大肠杆菌gltBD基因的引物<400>1agccttaaag ataggatcca ttttaatttc<210>2<211>30<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述用于扩增大肠杆菌gltBD基因的引物<400>2attcatggat ccctcgctta aacttccagc<210>3<211>17<212>DNA<213>人造序列<220><221>未确定<222>(3，9，12)<223>n＝a或c或g或t<220><223>人造序列的描述用于扩增Brevibacterium lactofermentumgltBD基因的引物<400>3ggngarggng gngarga<210>4<211>18<212>DNA<213>人造序列<220><221>未确定<222>(1，4，7)<223>n＝a或c或g或t<220><223>人造序列的描述用于扩增Brevibacterium lactofermentumgltBD基因的引物<400>4nccnccngtc atrtaytc<210>5<211>32<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述用于扩增Brevibacterium lactofermentumgltBD基因的引物<400>5aatccacgtg aagctagtgg cagaacaagg cg<210>6<211>30<212>DNA<213>人造序列<220><223>人造序列的描述用于扩增Brevibacterium lactofermentumgltBD基因的引物<400>6acgaatgaac aattcaccac tggttgcgcc<210>7<211>8734<212>DNA<213>Brevibacterium lactofermentum<220><221>CDS<222>(565)..(5094)<220><221>CDS<222>(5097)..(6614)<400>7gacgtcgcgg aggaatgctg ccacgccttc gatttttccg gaatcgtctt tcaggatcgt 60gatggagaat tccagggaca ttttagatcc gtctgcacgc actcccggaa cattgagggg 120ctcggagccg tagcgggttt caccggattc catgacgtga tcccatccgt cccagtgtgc 180cttgcggtgt ttttcgggga tgatgatgtc gagggatttt ccgagtgctt cgccggccgt 240gtatccaaag agtttctcgg agccgccgtt ccagagtctg attattccat cgcgggtggc 300gtagatgatt gcttcttctg tttcggtgac aagtcgggct gcgatggtgt caaaatcgac 360catttttatc ttctttcacg gggtggatag gcgaacatct tctaccatat cctgtgatgt 420gtaacacagg agcgtaatct gacctcccgt tttcctatag attgatcgaa agtaaccctt 480ttgttacttg cgttgcaggt agtgcgcctg attttcttat tatcgaacga ttgatagaaa 540caggattaaa gtgaggtatc ccgc atg aaa cca caa gga ctc tac aac cct591Met Lys Pro Gln Gly Leu Tyr Asn Pro1 5gcg cat gaa cat gac gcc tgc ggt gtg gcg ttt att gcg gat atc cac 639Ala His Glu His Asp Ala Cys Gly Val Ala Phe Ile Ala Asp Ile His10 15 20 25ggt cga ccc agc cgc agc att gtt gat cgt gca ctt gag gcg ctt cgc 687Gly Arg Pro Ser Arg Ser Ile Val Asp Arg Ala Leu Glu Ala Leu Arg30 35 40aac att gac cac cgt ggc gca gcc ggt gca gag aag aac act ggc gat 735Asn Ile Asp His Arg Gly Ala Ala Gly Ala Glu Lys Asn Thr Gly Asp
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权利要求
1.一种具有L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌属细菌菌株，其中在所述的细菌菌株的细胞中，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活性被增强。
2.根据权利要求1的菌株，其中谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶活性的增强是通过扩增编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因的拷贝数来实现的。
3.根据权利要求1的菌株，其中谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶活性的增强是通过改变编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因的表达调控序列来实现的。
4.根据权利要求1的菌株，其中所述的谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶来源于埃希氏杆菌属或棒状杆菌属细菌。
5.根据权利要求2或3的菌株，其中所述编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因包含有至少对应于SEQ ID NO7中所描述的核苷酸序列中的第565至6614位核苷酸的核苷酸序列。
6.一种编码谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的基因，包含有至少对应于SEQ ID NO7中所描述的核苷酸序列中的第565至6614位核苷酸的核苷酸序列。
7.一种通过发酵生产L-谷氨酸的方法，包括如下步骤在液体培养基中培养具有L-谷氨酸生产能力的棒状杆菌属细菌菌株，其中，在所述细菌菌株的细胞中，谷氨酰胺-酮戊二酸氨基转移酶的活性被增强，在培养基中生产并积累L-谷氨酸，以及从培养基中回收L-谷氨酸。
全文摘要
通过在液体培养基中培养具有L－谷氨酸生产能力的棒状杆菌属细菌菌株,其中在这一细菌菌株的细胞中,谷氨酰胺—酮戊二酸氨基转移酶的活性被增强;在该培养基中生产并积累L－谷氨酸;并从该培养基中回收L－谷氨酸这些步骤来生产L－谷氨酸。
文档编号C12N9/06GK1275165SQ98810083
公开日2000年11月29日 申请日期1998年8月7日 优先权日1997年8月12日
发明者菅野壮平, 木村英一郎, 松井和彦, 中松亘, 大住刚 申请人:味之素株式会社