专利名称：载体固相培养固定化酶方法
现有技术中利用多孔惰性载体颗粒支持菌体的固定化细胞技术均为液体深层培养法(Atkinson，B.，Black，G.M.et al.Biologicalparticles of Given size，shape，and Density for use in Biological Reactors，Biotechnol，Bioeng.Vol.21，193-200，1979)。其过程是多孔惰性载体—液体深层培养—固定化细胞。这种方法也可用于固定化酶(Nakashima，T.，Fukuda，H.et al.Culture conditions for IntracellularLipase production by Rhizopus Chinenis and Its Immobiolizationwithin Biomass support particles，J.Ferment，Technol.，Vol.66，No.4.441-448，1988)。其过程是多孔惰性载体—液体深层培养—后处理—固定化胞内酶。
以制备固定化胞内酶为目的采用上述深层培养法，虽然避免了酶的提取过程，但其缺点是(1) 深层培养物中，除载体与生长细胞外，还有大量的游离细胞；(2) 由细胞产生的胞外酶分泌到培养液中，随发酵液被排放丢弃；(3) 排放大量废水污染环境。
本发明目的在于提供一种多孔载体固相培养固定化酶方法，即多孔惰性载体—固态培养—固定化酶的过程。该方法利用固态发酵的优点，使微生物以自然方式生长后，经简易处理即可得到载体支持的细胞结合酶(固定化酶)，无废水排放，方法简易。
本发明实现发明目的的方法是以一定的配比将接种孢子或细胞的液体培养基注入已灭菌的惰性载体中，固态培养后进行后处理，从而制备出固定化酶。
以下为本发明的详细说明在固定化细胞技术中，利用载体支持细胞的固定化酶的优点是目标酶不必经过分离提取即可实现固定化。本发明对已有固定化方法加以改进，利用载体固相培养法制备载体支持的细胞固定化酶和胞外酶在内的固定化酶。
本发明的方法中不采用液体深层培养法，也不采用传统的固态底物的固态培养法，而是利用惰性多孔载体，其中饱含液体培养基的载体固相培养方法。这样，可使菌体在载体孔隙和表面上充分生长而产生大量的酶(胞内酶和胞外酶)，不必经过固液分离，使工艺简单易行。
本发明首先将灭菌载体装入容器内，按载体吸水量，加入一定比例的液体培养基(培养基内事先接种适量的细胞或孢子)经一定时间的通气摇瓶或旋转培养，即可在载体孔隙与表面长满细胞，并得到一定的目标酶酶活性。这种工艺不仅实现了细胞生长和酶的合成，而且避免了菌体分离和废水排放。
本发明的主要工艺过程如下1.选取多孔载体，吸水率在50％～97％，孔隙大小(每英寸线性长度的孔隙数目)40ppi～90ppi作为固定化载体；2.装所用容器1/5～1/3量的已灭菌上述多孔载体；3.按所培养丝状真菌的需要配制液体培养基，灭菌冷却后，接种适量细胞或孢子，成为“液体—种子液”；4.向上述容器中加入“液体—种子液”，成为“载体—液体培养基—种子”体系，液体培养基加入量以载体吸饱液体而无可见液相为限度；5.将上述体系置于恒温摇床中摇荡培养或旋转培养，或通风培养，培养温度为酶源微生物最适生长温度，一般为28℃～40℃，培养时间视酶活性高峰而定，一般为24～96小时，达到酶活性高峰时停止培养，取出载体培养物；6.取出载体培养物后，先用无菌水洗涤，再用丙酮洗涤，真空干燥，即得到固定化酶。
下面通过三个实施例对本发明进一步说明，下面的实施例只是用于说明本发明，而不对本发明起限定作用。实施例1制备培养基蛋白胨7％，硝酸钠0.1％，磷酸氢二钾0.1％，硫酸镁0.05％，灭菌并冷却后，接入中华根酶(Rhizopus chinenis，AS3.817诱变菌株)的孢子一环。另取500毫升三角瓶，装入灭菌的聚氨酯塑料小块(6×6×6mm孔隙度0.97，密度44.32Kg/m3)装入量为200个小块，加入上述培养基一种子液100毫升，恒温摇床200转/分，30℃振荡培养36小时。取出载体培养物，用无菌水洗涤，淋干水后，浸泡于200毫升丙酮中，30秒后取出，真空干燥，即得固定化酶，其脂肪酶酶活性为274.8U/g。实施例2少根根霉，诱变菌株，采用如实施例1同样的方法进行载体固相培养，只是液体培养基采用土豆汁培养基，脂肪酶活力为415.7U/g。实施例3100毫升土豆汁培养基经灭菌冷却后，接种米曲霉3042孢子一环，另取500毫升三角瓶，装入灭菌的丝瓜瓤200块(6×6×6mm)，加入上述液体—种子培养基后，32℃下恒温摇床培养30小时。取出载体培养物，用无菌水洗涤，淋干后，250毫升丙酮淋洗，然后真空干燥，得到固定化蛋白酶，活力为960单位/克。
权利要求
1.一种载体固相培养固定化方法的特征在于，多孔载体吸纳微生物生长所需的液体培养基后，进行固相培养，再经后处理得到固定化酶。
2.根据权利要求1所述的多孔载体其特征在于，吸水率在30％以上，以60％～90％为最佳；孔隙率为50％～98％，以80％～97％为最佳；孔隙大小(每英寸线性长度的孔隙数目)为40ppi～90ppi以80ppi～90ppi为最佳。
3.根据权利要求1所述的微生物是指丝状真菌，诸如米曲霉、根霉、黑曲霉等。
4.根据权利要求1所述的液体培养基组成是指权利要求2所述的微生物实际要求配制组分。
5.根据权利要求1所述的固相培养是多孔载体吸纳了液体培养基后，在通风条件下或震荡旋转条件下恒温培养。
6.根据权利要求1所述的和根据权利要求5所述的固相培养是指体系没有可见的水相的培养。
7.根据权利要求1所述和根据权利要求5所述以及权利要求6所述的液体培养基中含有一定比例的细胞和孢子，一般为液体培养基的2～10％(重量/体积)。
8.根据权利要求1所述的和根据权利要求5所述的培养温度采用培养微生物的最适温度，一般为28～40℃。
9.根据权利要求1所述后处理是指载体固相培养物用水洗涤后再用丙酮洗涤，然后真空下干燥，得到固定化酶。
全文摘要
本发明涉及载体固相培养固定化酶的制备方法。本发明的特征是:以人工合成或天然的无机多孔材料或有机高分子材料为载体,在吸纳液体培养基后,经固态培养,使微生物细胞在载体孔隙和表面生长。然后,经水洗和丙酮处理、真空干燥,制得固定化酶。本发明免除了酶的分离提取的繁琐过程,避免了酶提取和细胞培养过程中的废水排放。
文档编号C12N11/04GK1256311SQ9812105
公开日2000年6月14日 申请日期1998年12月8日 优先权日1998年12月8日
发明者王运吉, 张苓花, 田兵 申请人:大连轻工业学院