专利名称：用于在植物中诱导遗传单性结实的方法
技术领域：
本发明涉及用于产生单性结实植物的方法，更具体地说，它是一种用于产生遗传单性结实的方法。
背景技术：
座果和发育通常取决于是否成功受精。在番茄和许多其它物种中，座果的一个主要限制因子是花粉的产生对中等高温或者低温以及不充足的湿度的高度敏感性(Picken 1984)。单性结实(结无籽果实的能力)能够防止环境约束对果实产生的影响。因而，在许多产生果实的植物中，单性结实具有重大的经济意义。
单性结实可以在正常植物中进行人工诱导，或者可以作为遗传性状天然产生。遗传单性结实可以是专性的或者兼性的。前者从来不形成种子。在兼性单性结实中，当环境条件对传粉和受精来说不利时，将产生无籽果实。然而，当确实发生受精时，就形成有种子的果实，这可以使兼性单性结实植物进行繁殖性增殖。
在许多科学论文中讨论了单性结实，例如Abad M,Monteiro AA(1989)在冬天温和条件下植物生长素对生产温室番茄的运用评论.Sci Hort 38:167-192。
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在番茄中，诱导单性结实最有效的处理是利用植物生长素，合成植物生长素或者植物生长素转运抑制剂(由Ho和Hewitt 1986,Varga和Bruinsma 1986,Abad和Monteiro 1989综述)。然而，由于植物生长素不得不单独地运用于每一花束上，以避免应用到整个植物中所引起的特有的副作用，因而这种处理十分费力。
植物生长素看来对遗传(天然)单性结实的座果也起着重要的作用。例如，Gustafson(1939a,b)发现在单性结实的桔子，柠檬以及葡萄品种的子房中植物生长素浓度明显地比在有种子的品种中要高。以类似的数据为基础，Nitsch(1970)提出，天然的单性结实与无籽品种在开花时建立座果所要求的激素浓度极限的能力有关。
在植物中控制植物生长素作用的几个基因是本领域所熟知的。例如，一个这样的基因是包含在毛根土壤杆菌农杆氨酸型Ri-质粒的TL-DNA中的rolB基因(Chilton等1982,Spano等1982,White等1982,Willmitzer等1982,Peterson等1989)。
单独表达rolB基因的转基因植物显示出几种植物生长素毒性综合病症特征；如叶片异常，增加的柱头和花大小，花柱异长，以及在茎干上增加无定形根的形成(Schmulling等1988)。van Altvorst等(1992)描述了在转基因番茄中不同rol基因的表型作用，然而，他们没有报道当插入rolB基因时单性结实果实发育情况。
发明简述本发明提供一种用于在植物中产生遗传单性结实的改良的方法。
依据本发明的优选的实施方案，本发明提供了一种用于在植物中产生遗传单性结实的方法，该方法包括以下步骤提供一个包含DNA序列和启动子的盒，该DNA序列在植物中编码调节植物生长素作用，该启动子对在开花和果实早期发育之间的子房具有特异性并控制DNA序列，以及将该盒引入植物中。
优选地，该方法也包括以下步骤筛选具有兼性或者专性单性结实特征的植物。
依据本发明的优选的实施方案，所说的引入步骤包括以下步骤转化植物材料，以及再生所转化的植物。
依据本发明的另一个优选的实施方案，植物材料包括种子产生的子叶。
依据本发明的另一个优选的实施方案，所说的转化步骤包括以下步骤提供掺入所说的盒的质粒，将质粒引入根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumerfaciens)中，以及通过与包含质粒的根瘤土壤杆菌共培养将质粒掺入植物材料中。
依据本发明的另一个优选的实施方案，在植物中编码调节植物生长素作用的DNA序列包括rolB基因的序列。
依据本发明进一步的优选的实施方案，筛选步骤包括种植产生果实的植物，并且检验在允许受精条件下产生种子的果实。
依据本发明进一步的优选的实施方案，筛选步骤包括种植产生果实的植物，并且检验在限制受精条件下产生种子的果实。
优选地，该方法也包括以下步骤筛选具有兼性或者专性单性结实特征的植物。
依据本发明的优选的实施方案所说的番茄植物包括番茄植物的果实。
附图描述结合下列附图和表详细描述后，本发明将得到更充分地理解和领悟，其中
图1是在具有各种TPRP-F1启动子序列的缺失的转基因植物中GUS表达的图表分析；在图1中，a栏表明独立转化的数量。b拦描述用4MU.从定量荧光测量分析中所获得的数据(++表明高荧光，+中高，+/-中低-无荧光)。c栏是以X-Gluc.组织化学测定为基础(++表明在2小时内所显现的深色，+经温育一夜所显现的深色，+/-经温育一夜所显现的浅色，-经温育一夜未显色)。d行将最小的-46 CaMV-35S启动子安装在GUS-ORF(开放读框)的前面。在所有其它质粒中，保持TPRP-F1启动子的5＇UTR非翻译区。
图2是质粒pSB171的构建图；将λG16的7Kbp HindⅢ片段插入到质粒pBluescript SK+的HindⅢ位点中。
图3是pSBN28的构建图；将pBS171的NsiⅠ片段插入到pBluescript的PstⅠ位点中。
图4是质粒pPSN33的构建图；将突变pTPRP-F1片段插入到pBluescript KS+的XbaⅠ和KpnⅠ位点中。
图5是质粒pBSrolB的构建图；将pUC19-B26的EcoRⅠ-HindⅢ片段连接到pBluescript SK+的相应位点上。
图6是质粒pBSNrolB的构建图；将pBSrolB的KpnⅠ片段连接到pBSN33的KpnⅠ位点上。
图7是质粒pGB18的构建图，由pUC19的多克隆位点代替pGA492的多克隆位点。
图8是质粒pGB18rolB的构建图；将pBSNrolB的Xba-HindHⅢ片段连接到pGB18的相应位点上。
表1显示TPRP-F1基因组克隆的序列，该序列包括2643bp的启动子区。早期未公开过从1-2483延伸的启动子区序列。早期公开过从2484-4320延伸的序列(Salts等1992)。用黑体字母印刷的ATG密码子(位置2644-2647)是TPRP-F1翻译起始密码子。下划线的黑体字母G(位置2235)是转录起始位点(未发表过的数据)。
表2显示包含在二分质粒pGB18rolB(图7)中的TPRP-F1启动子的序列。该序列符合表1中的101-2643。
表3显示一个较短启动子，该启动子赋予子房和胚特异性(表1从943-2643)。
表4显示来源于TPRP-F1启动子序列的选择性结合，该TPRP-F1启动子赋予子房和胚特异性(融合到2079-2643的1-1728，表1)。
表5显示包含在二分载体pGB18rolB(参见图5)中的rolB基因的序列。Slightom等1986描述了该序列。用黑体字母指出翻译起始密码子(位置40)。
表6显示各种具有转基因植物(R0)的和它们子代(R1)的表型的种子。
表7显示在R2转基因植物和亲本系MP-1上发育的果实的特征分析。在P=0.05时栏中后跟普通字母的值没有显著性差异。
在表7中1)nP1=抽样检验的植物数量，nFr=从给定数量的植物中抽样检验的果实总数，果实是在1995年6月14-30日之间收集的。
2)抽样检验的植物果实的总数(仅仅计数大于15mm的果实)。
3)用于在纵列描述的数据的F和P值，利用MacIntosh的GraphpadInstat 2.01程序包进行Anova检验，包括对所有纵列内成对分析的Turkey检验。优选的实施方案的详细描述现在，参照在植物中产生遗传单性结实中所涉及的方法。用于产生的方法包括提供包含DNA序列和启动子的盒，该DNA序列编码调节植物生长素作用，并且该启动子对开花和果实早期发育之间子房具有特异性并控制DNA序列，将该盒引入植物中，以及筛选具有单性结实特征的植物。材料和方法细菌菌株和培养物大肠杆菌菌株DH5α(Raleigh等1989)适用于所有质粒构建步骤，以及菌株SM10(Simon等1983)适用于质粒连接到根瘤土壤杆菌中。按照所建立的方法，完成PCR、DNA和RNA分析，以及重组质粒的构建(Ausubel等1987,Sambrook等1989)实施例1子房和早期果实特异性TPRP-F1启动子的详细分析在确定作为子房的和早期果实的特异性基因的TPRP-F1基因的特征后，并且在对基因编码区进行测序(Salts等1991,1992)后，将TPRP-F1基因启动子进行分离。稍后分离基因组克隆。表1描述了基因组克隆序列，该序列包含5＇延伸2643bp到翻译起始密码子上的推定启动子区。以前发表了包含5＇的20bp到翻译起始密码子(位置2623，表1)编码区的测序(Salts等1992)，而在1-2622之间延伸的序列(表1)没有发表。
通过融合推定启动子序列的各种缺失到报道基因uidA(GUS)上进行启动子的初步功能性分析，并且在稳定转基因植物中进行GUS表达分析(Jefferson等1987)。简要报道了初步分析的结果(Carmi等1994)。启动子延伸分析表明TPRP-F1基因的被转录的转录物包含408bp的非翻译前导序列。进行了TPRP-F1基因的启动子区的详细分析，该分析包括附加缺失以及检验GUS在更多的器官中和在额外的发育阶段的表达。图1总结了这个分析的结果。这个分析的主要发现是1．5＇延伸2542bp到翻译起始密码子的序列作为启动子，在嵌合基因中将rolB基因融合到该启动子上(也参见图2-8)。以这个分析为基础(参见图1)，仅仅5＇延伸1701bp到翻译起始密码子的序列足够驱动rolB基因在子房和发育的胚中的特异性表达(表2)。
2．这个分析的结果也表明，将5＇延伸564bp到翻译起始密码子的启动子序列融合到5′延伸915-2643bp到翻译起始密码子序列，前者授予子房和早期果实以及发育的胚特异性(表3)。并且这条序列也可以用于驱动rolB特异地在果实中表达，该结果导致单性结实在其它器官和附加的发育期内没有副作用。嵌合基因TPRP-F1::rolB的构建质粒pSB171的构建通过亚克隆基因组7kbpgλG16 HindⅢ片段到pBluescript SK+的HindⅢ位点中获得重组质粒pSB171(图2)。质粒pBSN28的构建分离质粒pSB171的NsiⅠ内部片段，并且将该片段亚克隆到pBluescript的PstⅠ限制位点中(图3)。质粒pBSN33的构建为了保证将rolB基因从它的天然翻译起始密码子翻译，通过体外诱变取消包含在质粒pBSN28中的TPRP-F1基因的翻译起始密码子利用pBSN28克隆作为模板，T7启动子序列作为一个引物(3＇-5＇)以及第二个引物是下列序列5＇TGGTACCGGGCAATGAACAAAGTTCCA3＇制备一个包含具有突变起始密码子的启动子的PCR片段。黑体字母指出在启动子序列3′产生一个新KpnⅠ位点的突变序列。将PCR产物用KpnⅠ和XbaⅠ消化，并且连接到产生质粒pBSN33的pBluescript上(图4)。质粒pBSNrolB的构建pUC19-B26(由J.Schell提供)含有按照Slighton等(1986)的核苷酸9814和11324之间的序列。表5中给出了包含在这个质粒中的rolB序列。分离这个质粒的EcoRⅠ-HindⅢ片段，并且将它克隆到质粒pBluescript的EcoRⅠ/HindⅢ-限制性切割位点中形成pBSrolB(图5)。
分离pBSrolB的KpnⅠ片段，并且将它亚克隆到pBSN33的KpnⅠ位点中，同时通过限制酶分析确定具有以正确定向插入的rolB基因的克隆。将这个质粒命名为pBSNrolB(图6)。二分质粒pGB18rolB的构建分离质粒pUC18的EcoRⅠ-HindⅢ多位点接头，并且将它亚克隆到质粒pGA492的EcoRⅠ/HindⅢ-限制性切割位点(An1986)，形成质粒pGB18(图7)。分离pBSNrolB的XbaⅠ-BamHⅠ片段，并且将它亚克隆到质粒pGB18的XbaⅠ/BamHⅠ限制切割位点中，形成质粒pGB18rolB(图8)。在番茄中通过子房的TPRP-F1::rolB基因的特异性表达诱导单性结实植物转化通过由10日龄的籽苗产生的子叶与根瘤土壤杆菌菌株EAH105进行共培养，将二分载体pGB18rolB转化到分生番茄繁育系MP-1中(Hood等1993)。本质上，除了在注入子叶上之前，将“过夜”细菌培养物悬浮在液体MS(Murashige和Skoog1962)培养基中，以及用0.5mg/L头孢噻亏代替羧苄青霉素外，采用McCormick(1991)描述的方案。将从它们再生的子叶和小植株在100mg/L的卡那霉素存在下繁殖，直到生根为止。将再生的植物种植在变硬的泥煤沉淀(Jiffy-7,a/s Jiffy Products，挪威)中(1-2周)，然后转移到防虫的温室或者网室中。
为了选择转化的子代，将无菌种子在选择性培养基(1/2MS培养基，3％蔗糖和100mg/L卡那霉素)上萌芽，其中仅仅让转基因籽苗发育出须根系。
转基因植物的描述从繁育系MP-1再生三种单性结实的原代(Ro)转基因植物MPB-4,MPB-12和MPB-13，以及MPB-19。通过PCR分析，利用选择性标记基因nptⅡ的引物，并且通过Southern分析，利用rolB基因的KpnⅠ片段作为探针来确定Ro植物的转化。
Southern分析表明MPB-4 Ro植物包含至少四个嵌合基因的插入片段，而MPB-12和MPB-13都包含两个串联拷贝。通过MPB-12和MPB-13的R1和R2的Southern分析确定插入的串联模式。Ro植物的表型表6中总结了六种Ro植物的某些表型特征。
1．Ro植物的营养生长习性在把Ro植物移植到罐的时候，它们产生的营养生长习性与亲本栽培品种MP-1没有明显的不同。
2．Ro植物的繁殖发育所有的Ro植物发育出多花。植物MPB-4的花表现出发育的典型“单性结实”方式也就是说，相对于花发育来说子房很早就开始扩大，当时花瓣仍然完全关闭，花瓣没有枯萎并且仍然附着在发育果实的基部直到被生长的果实碰掉为止。通过荧光素二乙酸酯的活体染色(Widholm1972)和花粉萌发试验(Brewbaker和Kwack 1963)，MPB-4花粉是不能存活的。
MPB-13-Ro植物的花表现出单性结实样发育的中等方式(子房的早期扩大以及花瓣延迟萎蔫)，花粉仍能生存。MPB-12-Ro花表现出更温和的单性结实表型；它们的子房轻微地扩大并且花瓣延迟萎蔫。它们的花粉是能存活的。
3．Ro植物的无籽和果实特征如表6中所总结的，植物MPB-4是完全无籽的，并且在大多数果实中，与亲本栽培品种或者非单性结实转基因植物的果实相比，囊柱相当大。在大多数MPB-4果实中，室腔内充满了果浆，仅仅在极少数中果浆不完全充满。大多数果实包含4-5个子房室，而在相同的生长条件下，MP-1果实通常由3-4个子房室组成。不能从MPB-4获得有籽果实，即使采用亲本系MP-1的花粉给非常嫩的花芽进行人工传粉。这种雌性不育性明显地是因为在花芽发育的早期子房的迅速扩大，这导致花柱管的闭合或者松开阻止了受精。于是，人们认为植物PMB-4是专性单性结实植物。这种不定植物通过扦插保持繁殖。
植物MPB-12和MPB-13表现为兼性单性结实。它们的无籽果实充满果浆，并且包含4个或者更多个子房室。在大多数MPB-13果实和某些MPB-12果实中，囊轴比亲本系果实的稍大一些。在一些MPB-13果实中果浆是淡绿色的，尤其是在高温下发育的果实。对于植物生长素诱导的果实也报道了这种现象(Abad和Monteiro1989)。在MPB-12和MPB-13的无籽果实中没有观察到对植物生长素诱导的单性结实果实的典型扁化作用。
在夏天很高温度下发育的MPB-12-Ro的无籽果实中，具有典型的畸形趋势；果实椭圆而非圆形，稍微平坦，以及偶尔向横切面压缩(“花生样”外观)。R1植物的表型1．R1植物的营养生长习性大多数PMB-12-R1的Kanr籽苗和所有KanrMPB-13-R1植物成为向下卷的宽子叶的特征。此现象的严重程度随各种植物而变化。某些MPB-13-R1籽苗的根系比参照植物发育更多。发育的植物没有表现出植物生长素相关畸形(如叶片偏上性，茎干卷曲或者不定根发育)。
2．R1植物的繁殖发育各种KanrMPB-12-R1植物的花具有正常的外形和发育方式，除了缺乏花瓣的萎蔫(它仍然附着在发育的果实基部)之外，与MPB-12-Ro花的表型类似。KanrMPB-13-R1植物的花表现出“单性结实”发育的不同程度(子房的早期扩大以及花瓣萎蔫延迟)，并且花粉是能存活的。
3．在R1植物中无籽和果实特征如表6所限定的，大多数在各种KanrMPB-12-R1植物上发育的果实是无籽的并且充满了果浆。偶尔，发育的有籽果实与亲本栽培品种相比，它们大多数包含的种子明显地较少，并且种子的平均重量和大小比MP-1果实的明显地更高。有籽果实的频率在不同R1植物中发生变化。果实不是鼓起的；一些果实是稍微平坦的椭圆形。没有观察到横向压缩的形状，很明显这是因为果实没有在异常高的温度下发育。大多数不同的MPB-13-R1植物的果实具有规则形状，无籽，并且充满了果浆。极少的有籽果实发育，以及它们大多数包含比MP-1更少的种子。R2植物的表型1．R2植物的营养生长习性在MPB-12和MPB-13的KanrR2籽苗中也观察到宽子叶现象。发育的植物具有正常生长习性。
2．在R2植物中无籽和果实特征检验MPB-12和MPB-13转化体的R2子代发育的果实的几个果实指数。这些植物生长在允许传粉的环境条件下。由于在各种由普通的R1植物所衍生的R2植物中没有发现明显的区别，因而以从R2代的两种或者三种植物所收集的信息为基础进行数据分析(表7)。
关于果实的平均重量，每个果实的子房室数目，或者Brix值，转基因果实与参照果实没有明显的不同(P＜0.05)。然而，即使在转基因植物中通过振动花来进行传粉，所有转基因植物的果实也比参照植物具有明显更少的种子(P＜0.001)。在相同转基因植物上发育的不同果实中，种子数目变化从零到每个果实30-50粒，这反映在这些转基因植物中单性结实的兼性性质(表7)。
在亲本系MP-1中，种子数量和果实重量之间具有一种明显的正相关(r2=0.386,P=0.023,n=14)。然而，在转基因植物中，种子数量的高度明显减少不会伴随果实重量的减少。果实重量/种子数量的回归对于MPB-12.5-R2(n=23),r2=0.0279,P=0.446，对于MPB-13.3-R2(n=15),r2=0.0086,P=0.7419，以及对于MPB-13.4-R2(n=7),r2=0.1115,P=0.4642是无关紧要的。这一事实表明转基因的表达完全弥补了种子对果实重量的贡献。
所有无籽果实都充满果浆。转基因果实的果浆的颜色并非总是象参照那样红；在许多果实中，它更多的是带有绿颜色痕迹的橙黄色。
本领域的技术人员将意识到，本发明不受上文所特别显示的和描述的限制。更确切地说，本发明的范围仅仅由所附权利要求限定。
权利要求
1．一种用于在植物中产生遗传单性结实的方法，该方法包括以下步骤提供一个包含DNA序列和启动子的盒，该DNA序列在植物中编码调节植物生长素作用，以及该启动子在开花和果实早期发育之间对子房具有特异性，并且该启动子控制DNA序列；将盒引入植物中，
2．按照权利要求1的方法，该方法也包括以下步骤筛选兼性或者专性单性结实特征的植物。
3．按照权利要求1或者权利要求2的方法，其中所说的引入步骤包括以下步骤转化植物材料；并且再生所转化的植物。
4．按照权利要求3的方法，其中所说的植物材料包括种子所产生的子叶。
5．按照权利要求3的方法，其中所说的转化步骤包括以下步骤提供掺入所说的盒的质粒；将质粒引入根瘤土壤杆菌(Agrobacteriumtumerfaciens)；并且通过与包含质粒的根瘤土壤杆菌进行共培养将质粒掺入植物材料中。
6．按照权利要求1的方法，其中所说的在植物中编码调节植物生长素作用的DNA序列包括rolB基因的序列。
7．按照权利要求1的方法，其中所说的在开花和果实早期发育之间对子房具有特异性的启动子包含在表1所限定的序列。
8．按照权利要求1的方法，其中所说的在开花和果实早期发育之间对子房具有特异性的启动子包含在表2所限定的序列。
9．按照权利要求1的方法，其中所说的在开花和果实早期发育之间对子房具有特异性的启动子包含在表3所限定的序列。
10．按照权利要求1的方法，其中所说的在开花和果实早期发育之间对子房具有特异性的启动子包含在表4所限定的序列。
11．按照权利要求2的方法，其中所说的筛选步骤包括种植产生果实的植物；并且测定在允许受精的条件和/或者限制受精的条件下产生种子的果实。
12．按照权利要求1的方法，其中所说的植物是番茄植物。
13．一种权利要求1的方法所产生的番茄植物。
14．权利要求1的方法所产生的植物的番茄植物的果实。
全文摘要
本发明提供一种用于在植物中产生遗传单性结实的改进方法,该方法包括以下步骤:提供一个盒,该盒包括在植物中编码调节植物生长素作用的DNA序列(如rolB基因的序列)和在开花和果实早期发育之间对子房具有特异性的启动子,该启动子控制DNA序列;将该盒引入植物中。优选地,通过植物材料(包括种子产生的子叶)的转化引入所说的DNA,以及再生所转化的植物。优选方法的步骤也包括筛选兼性或者专性单性结实特征的植物。
文档编号C12N15/82GK1213405SQ97193072
公开日1999年4月7日 申请日期1997年2月13日 优先权日1996年2月14日
发明者R·巴格, Y·萨勒特 申请人:以色列国农业部