专利名称：一种葡萄糖异构酶的247位单突变体酶和138位,247位双突变体酶及其构建方法
技术领域：
本发明涉及利用蛋白质工程的定点突变方法改良葡萄糖异构酶的技术领域。
中国专利申请号95112782.9“SM33 GI的突变酶GI G138P及一种提高GI热稳定性的突变方案”给出了有关7号淀粉酶链霉菌M1033葡萄糖异构酶(SM33 GI)的来源、特性及蛋白质工程对该酶改造的一般情况。但现有技术未能提高该酶的活力。
本发明的目的是提出一种使SM33 GI酶活力提高的突变体酶SM33 GI G247D，热稳定性和酶活力同时得以提高的双突变体酶SM33 GI(G138P,G247D)，及其构建方法。
本发明SM33 GI的突变体酶SM33 GI G247D，其特征在于所述SM33 GI的Gly247或某些GI中在同源性比较上相当于SM33 GI的Gly247位的甘氨酸(Gly)变成了天门冬氨酸(Asp)。
本发明SM33 GI G247D的制备方法，其特征在于根据SM33 GI的基因序列，设计并合成引入Asp247密码子的定点突变引物，对SM33 G1基因进行定点突变，测定DNA序列，鉴别出Gly247密码子变成Asp247密码子的突变体，并进行表达。
本发明SM33 GI的双突变体酶SM33 GI(G138P,G247D)，其特征在于将带有Asp247密码子的SM33 GI基因片段，或某些GI中在同源性比较上相当于SM33 GI的G247D，替代了SM33 GI G138P上的相应的DNA片段或相应位点。
本发明5M33 GI双突变体酶SM33 GI(G138P,G247D)的制备方法，先按中国专利申请号95112782.9技术获得SM33 GI的突变体酶SM33 GI G138P，其特征在于根据SM33 GI的基因序列，设计并合成引入Asp247密码子的定点突变引物，对SM33 GI基因进行定点突变，测定DNA序列，鉴别出Gly247密码子变成Asp247密码子的突变体，并进行表达，获得SM33 GI的突变体酶SM33 GI G247D；再将SM33 GI G138P及SM33 GI G247D分别用XhoI酶解，将带有G138P的SM33 GI基因5’端DNA片段与带有G247D的SM33 GI基因3’端DNA片段经T4连接酶连接而成为带有G138P、G247D双突变位点的SM33 GI基因，并进行表达。
比较由上述突变体进行表达获得的突变体粗酶的性质，可以发现单突变体酶SM33 GIG247D与野生型粗酶GI相比，酶比活有较明显的提高，但热稳定性下降；而双突变体酶SM33 GI(G138P,G247D)在热稳定性和酶比活上均优于野生型GI、单突变体酶GI G138P及GI G247D；进一步比较双突变体酶GI(G138P,G247D)及单突变体酶GI G138P的纯酶，前者比活及其热稳定性均优于后者。
由此可知，本发明SM33 GI的单突变体酶SM33 GI G247D具有提高酶活的优点；而将带有此Asp247位的片段替换了SM33 GI G138P相应片段所构成的SM33 GI双突变体酶GI(G138P,G247D)，比这两种单突变体酶中任一种具有更高的酶活及热稳定性。
依据分子的空间结构，当247位引入Asp后，局部构象发生细微调整，但不会产生大的空间障碍。因为247位接近不对称单位二体的结合面，且此结合面主要由G260、A261、G262的主链构成，而Gly残基主链构象允许有较大的变化，允许247D的引入。尽管如此，247D位的引入对分子中的二体形成仍有一定的影响，可影响分子的热稳定性。
247位引入Asp产生的效应是在分子中引入电荷，从而改变分子的静电场分布。根据枯草杆菌蛋白酶的相应研究结果，这种远离活性中心的电荷引入会影响酶的催化活力。
专利申请号95112782.9已分析表明，138位引入Pro会增加酶的热稳定性，原因可能是引入Pro会限制酶的柔性，使其对温度变得不十分敏感。
空间结构表明，138位和247位相距甚远，彼此构象改变不会相互影响，故而上述138位和247位分别引入Pro和Asp，其对酶的影响效应同时存在。
因此，采用本发明构建方法，可使SM33 GI的酶活提高，以及酶活和热稳定性同时获得提高；尤其是双突变体可构建工程菌株，具有广泛的应用前景。
实施例1．SM33 GI G247D的制备1)、合成寡核苷酸点突变引物根据SM33 GI的基因序列，设计将Gly247(GGC)的密码子改成Asp247(GAC)的密码子的寡核苷酸突变引物，例如5′-ACC TCA ACG ACC AGT CCG-3′；采用DNA合成法进行合成。
2)、构建重组M13DNA将重组表达质粒pTKD-GI和M13mp19RF用EcoRⅠ+SphⅠ双酶解，经琼脂糖凝胶电泳，分别从胶中抽提0.9kb和7.2kb片段，以T4DNA连接酶连接后，转染大肠杆菌XL1-blue。
3)、定点诱变采用双引物法，步骤简述如下a、制备重组M13DNA的参U单链模板，于大肠杆菌CJ236中完成；b、磷酸化寡核苷酸点突变引物；c、将磷酸化点突变引物、通用引物与参U单链模板退火，进行体外延伸与连接；d、转染突变反应液于XL1-blue感受态细胞。
具体过程可参见中国《(生物化学与生物物理学报》1995年27(5)470页。
然后挑取噬菌斑，小规模抽提单链，测定DNA序列，鉴定出Gly247的密码子变成Asp247的密码子的突变体。
4)、表达突变体基因将突变体基因克隆回原重组表达质粒pTKD-GI，转化大肠杆菌K38/pGP1-2。可采用中国《(高技术通讯)》1993年3(7)10页所述的方法，培养表达出SM33 GI G247D。
实施例2.SM33 GI(G138P,G247D)的构建及双突变体酶的制备1)、pTKD-GI(G138P,G247D)的构建附
图1是pTKD-GI(G138P,G247D)的构建图，图中A-Ⅰ是pTKD-GI G138P，其DNA大小为4.3Kb；A-Ⅱ是A-Ⅰ经XhoⅠ酶解后，经电泳分离获得的大片段，其DNA大小为3.6Kb，它由pTKD载体大片段以及带有G138P突变位点的GI基因5’端DNA片段构成。图中B-Ⅰ是pTKD-GI G247D，其DNA大小为4.3Kb,B-Ⅱ是B-Ⅰ经XhoⅠ酶解后，经电泳分离得到的小片段，其DNA大小为700bp，它是由pTKD载体小片段以及带有G247D突变位点的GI基因3’端DNA片段构成。
AB是指pTKD-GI(G138P,G247D)，是将A-ⅡDNA片段和B-ⅡDNA片段经T4连接酶(T4Ligase)连接而构成的带有G138P、G247D双突变位点的完整SM33 GI基因的pTKD表达质粒，其DNA大小为4.3Kb。
2)、表达SM33 GI(G138P,G247D)双突变体酶按实施例1所述方法将pTKD-GI(G138P,G247D)转化大肠杆菌K38/pGP1-2，培养表达可得到SM33 GI(G138P,G247D)双突变体酶。
实施例3.SM33 GI,SM33 GI G138P,SM33 GI G247D及SM33 GI(G138P,G247D)粗酶性质比较1)、比活测定采用半胱氨酸-咔唑法，以葡萄糖为底物。具体按《中国科学技术大学学报》1992年22(2),232-235页所述方法测定，结果列于表1表1
<p>2)、热稳定性的测定70℃，加热2小时，采用半胱氨酸-咔唑法，以葡萄糖为底物，测定其加热前后的相对活力，结果列于表2表2
由上述对粗酶性质的测定结果可以得出双突变体酶SM33 GI(G138P,G247D)的酶活及热稳定性为最佳。
由中国专利申请号95112782.9提出的“SM33 GI的突变酶GI G138P及一种提高GI热稳定性的突变方法”，突变体酶GI G138P的热稳定性较野生型有明显提高，酶活无明显下降；而双突变体酶SM33 GI(G138P,G247D)实质上也就是在SM33 GI G138P突变体酶的247位GIy又引入Asp的突变；故有必要进一步纯化及比较双突变体酶SM33 GI(G138P,G247D)与单突变体酶SM33 GI G138P的性质变化。
实施例4．双突变体酶SM33 GI(G138P,G247D)与单突变体酶SM33 GI G138P的分离纯化及酶学性质比较1)、纯化ⅰ)、加热变性除去杂蛋白70℃加热15’后酶蛋白及酶活的变化分别将SM33 GI(G138P,G247D)和SM33 GI G138P两种粗酶液于70℃加热15′后取出，立即冷却至4℃,10000rmp离心20分钟，去沉淀，由上清测得单突变体酶SM33 GI G138P和双突变体酶SM33 GI(G138P,G247D)加热前后的总蛋白和总活力(以加热前为100％)，结果列于表3表3
可见采用加热变性的方法除去了大部分杂蛋白。
ⅱ)、纯化按“生物化学与生物物理学报”1995年27(5)470页所述方法，将上清经DEAE-sepharose FF一次柱层析，即获得SDS-PAGE电泳纯酶。
2)、双突变体酶SM33 GI(G138P,G247D)与单突变体酶SM33 GIG138P的性质比较ⅰ)、热稳定性的测定选用10mM MgCl2/50mM Tris-HCl(PH7.0)缓冲液作为热稳定性实验的缓冲液。酶液在80℃水浴中保温，每20分钟取样100ul，分别以木糖和葡萄糖为底物，将酶液与底物分别混合后，在35℃水浴中反应15分钟，用半胱氨酸-咔唑法测活，数据分别列于表4和表5表4是以木糖为底物时不同保温时间后酶的相对活力；表5是以葡萄糖为底物时不同保温时间后酶的相对活力。表4
表5
取横坐标为时间(单位分钟)，纵坐标为相对活力，以保温时间-相对活力的对数作图。图2为SM33 GI G138P和SM33 GI(G138P,G247D)在80℃，以木糖为底物时的热稳定性曲线；图3为SM33 GI G138P和SM33 GI(G138P,G247D)在80℃，以葡萄糖为底物时的热稳定性曲线。图中黑圆点是SM33 GI(G138P,G247D)的活力数据，黑方块是SM33 GI G138P的活力数据；实线表示SM33 GI(G138P,G247D)的时间-相对活力曲线，虚线表示SM33 GI G138P的时间-相对活力曲线。
根据附图2和3，从纵坐标上1g50所对应的横坐标，即可求得突变体葡萄糖异构酶的半衰期列于表6
表6
可以看出，双突变体酶8M33 GI(G138P,G247D)的热稳定性优于单突变体酶SM33 GIG138P，其热失活半衰期在以葡萄糖为底物时提高到1.24倍；在以木糖为底物时提高到4.06倍。
ⅱ)、比活测定经上述先加热变性，再经DEAE-sepharose FF柱层析获得的双突变体酶，采用半胱氨酸-咔唑法，以葡萄糖为底物，测得SM33 GI G138P的比活为113.3U/mg，而SM33 GI(G138P,G247D)为179.2 U/mg，即SM33 GI(G138P,G247D)的比活是SM33 GI G138P的1.58倍。
由上述结果可知，本发明制备的SM33 GI(G138P,G247D)是较单突变体酶SM33 GI G138P的热稳定性及酶活力同时得以提高的有意义的双突变体酶，其酶活较GI G138P提高到1.58倍，其热失活半衰期在以葡萄糖为底物时提高到1.24倍，在以木糖为底物时提高到4.06倍。
权利要求
1.一种SM33 GI的突变体酶SM33 GI G247D，其特征在于所述SM33 GI的Gly247或某些GI中在同源性比较上相当于SM33 GI的Gly247位的甘氨酸(Gly)变成了天门冬氨酸(Asp)。
2.一种SM33 GI的突变体酶SM33 GI G247D的制备方法，其特征在于根据SM33 GI的基因序列，设计并合成引入Asp247密码子的定点突变引物，对SM33 GI基因进行定点突变，测定DNA序列，鉴别出Gly247密码子变成Asp24 7密码子的突变体，并进行表达。
3.一种SM33 GI的双突变体酶SM33 GI(G138P,G247D)，其特征在于将带有Asp247密码子的SM33 GI基因片段，或某些GI中在同源性比较上相当于SM33 GI的G2 47D，替代了SM33 GI G1 38P上的相应片段或位点。
4.一种SM33 GI的双突变体酶SM33 GI(G138P,G247D)的制备方法，先按中国专利申请号95112782.9技术获得SM33 GI的突变体酶SM33 GI G138P，其特征在于根据SM33 GI的基因序列，设计并合成引入Asp247密码子的定点突变引物，对SM33GI基因进行定点突变，测定DNA序列，鉴别出Gly247密码子变成Asp247密码子的突变体，并进行表达，获得SM33 GI的突变体酶SM33 GI G247D；再将SM33 GIG138P及SM33 GI G247D分别用XhoI酶解，将带有G138P的SM33GI基因5’端DNA片段与带有G247D的SM33 GI基因3’端DNA片段经T4连接酶连接而成为带有G138P、G247D双突变位点的SM33 GI基因，并进行表达。
全文摘要
本发明提供一种蛋白质工程的定点突变方案及其SM33 GI的突变体酶和双突变体酶,其特征在于将SM33 GI的247位或在同源性比较相当于247位的Gly替换为Asp,获得的突变体酶SM33 GI G247D,其酶活较野生型粗酶GI有明显的提高;再将带有Asp247的SM 33 GI基因片段替代SM33 GI GI38P基因的相应片段,可获得双突变体酶SM33GI(GI38P,G247D),其酶活和热稳定性同时获得提高。
文档编号C12N9/92GK1213003SQ9711971
公开日1999年4月7日 申请日期1997年9月30日 优先权日1997年9月30日
发明者王玉珍, 徐冲, 牛立文, 王淳, 伍传金, 滕脉坤, 崔涛, 陶莉梅, 朱国萍, 杭俊, 朱学勇, 罗昭锋, 廖军 申请人:中国科学技术大学