专利名称：分离含锗的药用植物或其加工产品中的有机锗和无机锗的方法及分析其中锗含量的方法
技术领域：
本发明涉及一种分离含锗的药用植物或其加工产品中的有机锗和无机锗的方法，特别是有关于利用下层充填有阳离子交换树脂、上层充填有阴离子交换树脂的一组合型分离管柱，以将药用植物或其加工产品中的有机锗和无机锗分离开的方法。本发明亦涉及一种利用感应耦合电浆发散光谱仪(ICP-AES)来分析含锗的药用植物或其加工产品中总锗含量、有机锗含量、及无机锗含量的方法。
早期日本研究者分析治疗癌症的药用植物之后，发现这些治疗癌症的药用植物的锗含量比一般植物的锗含量来得高，例如大灵芝(Ganodermaressile)之锗含量即高达22.02ppm(姜宏哲等人，台湾药学杂志，第三十八卷，第三期，p.189-198(1986))，因此认为药用植物中的锗含量多寡，与药性之间存在着微妙的关系。其中灵芝更被认为对过敏、免疫、高血压、糖尿病、动脉硬化、血栓症等均有疗效。
因此，目前一般市面上药用植物的加工产品莫不以其含有高锗含量为诉求重点。由于一般更相信，药用植物中所含的有机锗比无机锗更具疗效，故更有许多药用植物的加工产品是以其含有高量有机锗为诉求重点。
然而，以现行的分析方法根本无法将药用植物或药用植物的加工产品中的有机锗和无机锗分离，因此目前业者所标示的有机锗含量，应只是总锗含量。但若以总锗含量来表示有机锗含量，实在值得商榷。因而有必要发展出一种可将药用植物或其加工产品中的有机锗和无机锗分离开的方法。
锗-132(Carboxyethylgermanium sesquioxide)((GeCH2COOH)2O3)为一人工合成之酸式有机锗(Kakimoto et al.，1987，Heterocycles，Vol.26，No.2，p.347-353)，在临床上也宣称具有抗癌疗效，因此在日本，有些健康钦料中有添加锗-132。Itano等人曾利用锗-132会与Dowex 1-X2(CH3Coo-)树脂结合之特性，将健康饮料中所添加的人工合成之锗-132与二氧化锗分离定量。但仅止于分离人工合成的锗-132与二氧化锗，对于药用植物或其加工产品中所含有的天然的有机锗和无机锗，仍无相关研究报导。
至于药用植物中总锗含量的测定方法，目前普遍采用的为呈色定量法。姜等人(1986，同前)即先将药用植物打碎成粉末状，于600℃灰化1小时后，将灰分中之锗成分萃取出，经锗呈色剂(苯夫伦)(phenylfluorone)或橡素磺酸(quercetinsulfonic acid))呈色，再利用分光光度法，在507nm比色定量。这种方法的缺点是需经过灰化步骤，但灰化步骤会破坏植物体中的有机部份，使有机锗转变为无机锗，故以此种苯夫伦呈色法或橡素磺酸呈色法均只能测到总锗含量(有机锗和无机锗含量之总和)，无法得到有机锗和无机锗分别的含量，且操作复杂、繁琐。
Tao等人曾使用感应耦合电浆发散光谱仪(ICP-AES)来测定水中的锗含量(Tao et al.，1991，Analytical Sciences，Vol.7，p.55-59)，但仍无有关有人使用感应耦合电浆发散光谱仪来测定含锗的药用植物或其加工产品中之总锗含量、乃至于有机锗含量及无机锗含量的报导。
因此，本发明之目的即在于解决上述问题及缺点，进而提供一种可将含锗的药用植物或其加工产品中的有机锗和无机锗有效分离的方法。
本发明之另一目的为提供一种分析含锗的药用植物或其加工产品中的总锗含量、有机锗含量及无机锗含量的方法。
为达到本发明的目的，本发明的分离含锗之药用植物或其加工产品中之有机锗和无机锗的方法，包括以下依序进行的步骤(a)取含锗的药用植物或其加工产品的萃取液，倒入一组合型管柱中，该组合型管柱之下层充填有阳离子交换树脂，上层充填有阴离子交换树脂，使得该萃取液中的有机锗可与组合型管柱上层之阴离子交换树脂结合；(b)以去离子水流洗该组合型管柱，并收集析出液(eluate)，得到实质上不含有机锗的无机锗溶液；(c)以碱性溶液流洗该组合型管柱，使得原本与管柱上层之阴离子交换树脂结合的有机锗会被流洗出来，该碱性溶液中之碱基质会在流经管柱下层的阳离子交换树脂时与树脂结合而与有机锗有效分离；以及(d)以去离子水流洗该组合型管柱，并收集析出液，得到实质上不含无机锗的有机锗溶液。
本发明的分析含锗的药用植物或其加工产品中之总锗含量、有机锗含量及无机锗含量的方法，乃利用感应耦合电浆发散光谱仪(ICP-AES)测定。
综上所述，本发明的效果是明显的，可以有效地将含锗的药用植物或其加工产品中的有机锗和无机锗分离，并且可以有效地分析含锗的药用植物或其加工产品中的总锗含量、有机锗含量及无机锗含量。
一般相信天然灵芝中有机锗比人工合成者更具疗效，由于天然界含高量有机锗之灵芝取得不易，因此盛行以添加二氧化锗(GeO2)或锗-132于培养基栽种，经由吸收转变来提高植物中有机锗含量(姜宏哲等，中华药学杂志，第四十一卷，第四期，p.339-344(1989))(简秋源等，中华药学杂志，第四十二卷，第四期，p.355-361(1990))。本发明以下实施例中所用的赤芝，由于本身有机锗含量并不高，因此亦使用添加二氧化锗于培养基的方式，以使二氧化锗在赤芝内转变吸收，以提高赤芝中的有机锗含量。
1989年姜宏哲等人(行政院国家科学委员会专题研究计划成果报告NSC76-0208-M008-14)指出有机锗易溶于极性强之溶剂，0.01 N NaOH之碱性溶液对加锗培养的赤芝有较高锗萃取率，证实有机锗可能以酸式的聚合体型态存在。
本发明乃使用碱性溶液来萃取药用植物或其加工产品的锗成分，由于有机锗被证实可能以酸式的聚合体型态存在，因此，理论上，任何碱性溶液均可萃取出药用植物或其加工产品中的有机锗。适用的碱性溶液可为碱金属或碱土金属的氢氧化物，例如氢氧化钠、氢氧化钾，氢氧化镁及氢氧化钙等。
如上述，使用碱性溶液萃取后，所得的萃取液为碱性的，这将会影响或干扰后续锗含量的测定结果。因此在测定总锗含量之前，有必要将碱性溶液中之碱基质除去。碱基质去除方式可采用任何公知的方法，或可依据本发明，利用阳离子交换树脂分离管柱来除去药用植物或其加工产品之萃取液的碱性基质，由于碱性溶液中的阳离子(例如钠离子)会与阳离子交换树脂中的阳离子(例如氢离子)交换，因而达到去除碱性基质的目的。适用于本发明的阳离子交换树脂可为氢离子型者，官能基可为-SO3-，商业上的例子包括Dowex 50W-X8，AG 50W-X8，Amberlite CG-120与Duolite225等。
依据本发明，接着将已除去碱性基质的药用植物或其加工产品的萃取液中的有机锗和无机锗分离开来。分离的方式是，将已除去碱性基质的药用植物或其加工产品的萃取液，倒入一组合型管柱中。此组合型管柱之下层充填有阳离子交换树脂，上层充填有阴离子交换树脂。由于有机锗被证实可能以酸式的聚合体型态存在，因此有机锗会与组合型管柱上层的阴离子交换树脂结合，然后再以去离子水流洗组合型管柱时，所得的析出液即为实质上不含有机锗的无机锗溶液。
为了进一步将组合型管柱中的有机锗流洗出来，本发明以碱性溶液流洗该组合型管柱。如此一来，原本与管柱上层之阴离子交换树脂结合的有机锗便会被释放出来，随着碱性溶液而流至管柱下层。该碱性溶液中的碱性基质会被管柱下层的阳离子交换树脂所除去，最后再以去离子水流洗该组合型管柱，即可得到实质上不含无机锗的有机锗溶液。
适用于本发明的组合型管柱的阴离子交换树脂可为醋酸型者，官能基可为-CH2N+(CH3)3，商业上的例子包括Dowex 1-X2，AG 1-X2，AmberliteCG-400，Duolite113。而适用于本发明之组合型管柱的阳离子交换树脂可为氢离子型者，官能基可为-SO3-，商业上的例子包括Dowex 50W-X8，AG50W-X8，Amberlite CG-120与Duolite225等。
本发明中所称之含锗的药用植物或其加工产品，举例而言，可包括灵芝、人参、栂茸、猪苓、紫根、甘草、茯苓、白花蛇舌草、厚朴、天门冬、金银花、黄耆、莪述、拜参、枸杞子、绿藻、小麦草、山豆根等常见的药用植物或其加工产品，但并不仅限于上述所提。事实上，任何含锗的药用植物或其加工产品，均可采用本发明的萃取方法及分离有机锗和无机锗的方法。
本发明所称的含锗的药用植物加工产品可为各种形式，包括原料锭剂、胶囊、微胶囊、饮料等等。
若含锗的药用植物加工产品为固体时，欲将此加工产品的有机锗和无机锗分离时，必须先经过萃取步骤，再将萃取液利用本发明的组合型管柱分离。若含锗的药用植物加工产品为液体时(如饮料)，欲将此加工产品之有机锗和无机锗分离时，需先经过一般过滤杂质的步骤后，则可直接利用本发明的组合型管柱分离，而不须经过萃取步骤。
本发明首次使用感应耦合电浆发散光谱仪(ICP-AES)来分析含锗的药用植物或其加工产品中的锗含量。当欲分析的样品为固体的含锗的药用植物或其加工产品时，必须先以任何公知的萃取方法(或依据本发明所述的萃取方法)，将固体中的含锗成分萃取出来，然后再以ICP-AES测定总锗含量。若需个别分析有机锗和无机锗的含量，则必须依据本发明特殊的分离方式，亦即将含锗的药用植物或其加工产品的萃取液倒入下层充填有阳离子交换树脂、上层充填有阴离子交换树脂的一组合型分离管柱中将有机锗和无机锗分离出来，然后再利用ICP-AES分别测定有机锗和无机锗含量。
当欲分析的含锗的药用植物加工产品为液体时，则在经过一般的过滤杂质步骤后，即可直接以ICP-AES来测定总锗含量。若需个别分析有机锗和无机锗的含量，则必须依据本发明特殊的分离方式，亦即使用上述特殊之组合型分离管柱中将有机锗和无机锗分离出来，然后再利用ICP-AES分别测定有机锗和无机锗含量。
实施例灵芝的培养将赤芝(Ganoderma lucidum)之菌丝体(由食品工业发展研究所菌种中心提供)植入太空包中培养，培养基中添加200ppm二氧化锗。太空包之培养基配方与赤芝生长发育条件乃参考1989年姜宏哲等人所发表的文献(姜等人，1989，中华药学杂志，第四十一卷，第四期，p.339-344)。赤芝成长之子实体采收后，于90℃下干燥2小时。再以均质搅拌器均质处理后，分装于样品瓶中于室温下保存。二次去离子水(简称二次水)的准备本发明的实施例所用的去离子水为经阳离子交换树脂与逆渗透制得的一次去离子水，再经混合式核级(Nuclear grade)离子交换树脂处理后，再经Millipore的LLI-QSP reagent water system处理得18.3MΩ-cm的二次去离子水。分离管柱(A)[Dowex 50W-X8树脂分离管柱]的制备取20mL Econo-Pac管柱(1.5cm×12cm)，依照管柱上的刻度充填约10mL的Dowex 50W-X8阳离子交换树脂，于树脂上方放置高分子隔板，再以二次水流洗数次后封存备用。(注)Dowex 50W-X8(H+)树脂，交联(cross-linkage)8％，50-100目(mesh)，购自Sigma公司。分离管柱(B)[Dowex 1-X2(CH3COO-)树脂与Dowex 50W-X8树脂的组合管柱]的制备取20mL Econo-Pac管柱(1.5cm×12cm)，依照管柱上的刻度充填约10mL之Dowex 50W-X8阳离子交换树脂，于树脂上方放置高分子隔板。再充填入约1mL管柱高之Dowex 1-X2(CH3COO-)树脂后，于树脂上方放置高分子隔板，再以二次水流洗数次后封存备用。(注)Dowex 1-X2(CH3COO-)树脂，交联(cross-linkage)2％，50-100目(mesh)，购自Sigma公司。感应耦合电浆发散光谱仪(ICP-AES)本发明实施例所使用的感应耦合电发散光谱仪为Jobin Yvon 24Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopic (ISAJobin Yvon，Longjumeau，Paris，France)，Sequential spectrometer，于206.86 nm波长下测定。灵芝萃取液取1g之上述经均质处理后的加锗培养灵芝子实体，置于圆底烧瓶中，加入0.01N NaOH，以热水浴回流萃取2小时，以滤纸过滤残渣并收集滤液。再依上述方法重覆萃取三次，合并所有萃取液，浓缩后倒入分离管柱(A)中去除NaOH，以二次水流洗分离管柱(A)并收集析出液。灵芝中有机锗和无机锗的分离将已去除NaOH之灵芝萃取液浓缩后倒入分离管柱(B)中，先使用二次水将不会与Dowex 1-X2树脂作用之无机锗流洗出来，收集析出液，浓缩后再使用感应耦合电浆发散光谱仪(ICP-AES)测定浓缩液中无机锗的含量，其值为519.65μg/g。
接着以3N NaOH流洗分离管柱(B)，使得原本与上层之Dowex 1-X2树脂结合的有机锗会被NaOH取代出来，继之NaOH会被下层的Dowex 50W-X8树脂所除去。再以二次水流洗分离管柱(B)，所收集得之析出液即为实质上不含无机锗的有机锗溶液。将析出液浓缩后再用ICP-AES测定有机锗含量，其值为99.43μg/g。所分离出的有机锗和无机锗的回收率另取新的1g之上述经均质处理后的加锗培养灵芝子实体，依上述方法进行萃取、以分离管柱(A)去除NaOH，以二次水流洗、浓缩，但并不经过分离管柱(B)，直接以ICP测定总锗含量，其值为637.94μg/g。
故可知所分离出的有机锗和无机锗的回收率(％)＝(有机锗含量+无机锗含量)/总锗含量×100％＝97.04％，回收率相当高。
权利要求
1.一种分离含锗的药用植物或其加工产品中的有机锗和无机锗的方法，包括以下依序进行的步骤(a)取含锗的药用植物或其加工产品的萃取液，倒入一组合型管柱中，该组合型管柱之下层充填有阳离子交换树脂，上层充填有阴离子交换树脂，使得该萃取液中的有机锗可与组合型管柱上层的阴离子交换树脂结合；(b)以去离子水流洗该组合型管柱，并收集析出液，得到实质上不含有机锗的无机锗溶液；(c)以碱性溶液流洗该组合型管柱，使得原本与管柱上层的阴离子交换树脂结合的有机锗会被流洗出来，该碱性溶液中的碱基质会在流经管柱下层的阳离子交换树脂时与树脂结合而与有机锗有效分离；以及(d)以去离子水流洗该组合型管柱，并收集析出液，得到实质上不含无机锗的有机锗溶液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征是该阳离子交换树脂为氢离子型。
3.如权利要求1所述的方法，其特征是该阳离子交换树脂的官能基为-SO3-。
4.如权利要求1所述的方法，其特征是该阴离子交换树脂为醋酸型。
5.如权利要求1所述的方法，其特征是该阴离子交换树脂的官能基为-CH2N+(CH3)3。
6.如权利要求1所述的方法，其特征是步骤(c)所用之该碱性溶液为碱金属或碱土金属之氢氧化物。
7.如权利要求6所述的方法，其特征是该碱性溶液为氢氧化钠。
8.如权利要求1所述的方法，其特征是该含锗的药用植物或其加工产品为择自灵芝、人参、栂茸、猪苓、紫根、甘草、茯苓、白花蛇舌草、厚朴、天门冬、金银花、黄耆、莪述、拜参、枸杞子、绿藻、小麦草、山豆根所组成的族群中的药用植物或其加工产品。
9.如权利要求1所述的方法，其特征是该含锗的药用植物加工产品的萃取液为一含锗的药用植物饮料。
10.如权利要求1所述的方法，其特征是该步骤(a)所用的含锗的药用植物或其加工产品的萃取液乃依下列步骤而取得(a1)使用碱性溶液将该含锗的药用植物或其加工产品进行萃取；(a2)将步骤(a1)所得的萃取液倒入一充填有阳离子交换树脂的管柱中以除去碱性溶液中的碱性基质；以及(a3)以去离子水流洗该充填有阳离子交换树脂的管柱，并收集析出液。
11.如权利要求10所述的方法，其特征是步骤(a1)所用之该碱性溶液为碱金属或碱土金属的氢氧化物。
12.如权利要求11所述的方法，其特征是该碱性溶液为氢氧化钠。
13.一种分析含锗的药用植物或其加工产品中总锗含量的方法，包括取含锗的药用植物或其加工产品的萃取液，利用感应耦合电浆发散光谱仪作分析。
14.如权利要求13所述的方法，其特征是该含锗的药用植物加工产品的萃取液为一含锗的药用植物饮料。
15.一种分析含锗的药用植物或其加工产品中的无机锗含量的方法，包括取权利要求1(b)所得的实质上不含有机锗的无机锗溶液，利用感应耦合电浆发散光谱仪作分析。
16.一种分析含锗的药用植物或其加工产品中的有机锗含量的方法，包括取权利要求1(d)项所得的实质上不含无机锗的有机锗溶液，利用感应耦合电浆发散光谱仪作分析。
全文摘要
本发明提供一种分离含锗的药用植物或其加工产品中的有机锗和无机锗的方法,乃使用下层充填有阳离子交换树脂、上层充填有阴离子交换树脂的一组合型分离管柱,以将含锗的药用植物或其加工产品萃取液中的有机锗和无机锗分离开来。本发明亦提供利用感应耦合电浆发散光谱仪(Inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy;ICP－AES)来分析含锗的药用植物或其加工产品中总锗含量、有机锗含量、及无机锗含量的方法。
文档编号A23L2/38GK1181260SQ9612042
公开日1998年5月13日 申请日期1996年10月29日 优先权日1996年10月29日
发明者陈孟堂 申请人:食品工业发展研究所