专利名称:通过与固定化寡核苷酸形成三螺旋纯化dna的方法
技术领域:
本发明涉及纯化DNA的新方法。本发明方法能快速分离得到适于药理应用的双链DNA。具体讲,本发明的纯化方法涉及DNA序列与寡核苷酸之间的特异杂交。
基因治疗和细胞治疗技术如今正在迅猛发展。但这些技术涉及能否产生大量药学纯DNA的问题。实际上,在这些新疗法中药物经常由DNA本身构成,所以适量地制备DNA、以适于人体治疗应用的方式分离和纯化DNA的能力是很重要的。
本发明描述一种纯化DNA的简便而特别有效的新方法,这种方法尤其能获得高纯度和高产率。
本发明方法关键在于待纯化的被插入DNA序列与由天然或修饰碱基组成的寡核苷酸之间的特异性相互作用。
最近已表明某些寡核苷酸能够在DNA双螺旋的大沟槽中特异性地相互作用局部形成三螺旋,导致对靶基因转录的抑制(Helene和Toulme,生化生物物理杂志,1049(1990)99)。这些寡核苷酸在寡聚嘌-呤寡聚嘧啶序列水平(即在这样的区域寡聚嘌呤序列在一条链上,寡聚嘧啶序列在其互补链上)识别DNA双螺旋,并在此局部形成三螺旋。第三条链(寡核苷酸)的碱基与Watson-Crick碱基对的嘌呤形成氢键(Hoogsteen键或反Hoogsteen键)。
现有技术中已描述了此类相互作用在分离质粒中的应用。例如,Ito等(PNAS 89(1992)495)描述了一些生物素化寡核苷酸的应用,这些寡核苷酸能够识别某质粒决定的序列并与其形成三螺旋。这样形成的复合物随后与包有抗生蛋白链菌素的磁珠接触。生物素与抗生蛋白链菌素间的相互作用使得能够通过磁力分离磁珠然后洗脱而分离质粒。但该方法存在一些缺点。特别是需要两种连续的特异相互作用,第一种是寡核苷酸与质粒间,第二种是生物素化复合物和抗生蛋白链菌素珠之间。另外,最终溶液可能被生物素化寡核苷酸污染,而后者不能用于药物组合物中。
本发明描述一种利用这种相互作用的改进的纯化DNA新方法。更具体地讲,本发明方法使用与载体共价偶联的寡核苷酸。该方法特别快,并产生特别高的产率和纯度。另外,本方法能从尤其含有其他核酸、蛋白、内毒素(如脂多糖)、核酸酶等的复杂混合物中纯化DNA。所用载体易于回收,所得DNA具有改善的药物安全性。最后,该方法仅含有一个步骤,不同于现有技术。
本发明的第一个目的在于一种双链DNA的纯化方法,根据该方法,将含有所述DNA和其他成份的混合物溶液在一共价偶联有一寡核苷酸的载体上通过,所述寡核苷酸能够通过杂交与所述DNA中某特定序列形成三螺旋。该特异序列可以是双链DNA上天然存在的序列或人工引入其中的合成序列。
用于本发明的寡核苷酸是与双链DNA直接杂交的寡核苷酸。这些寡核苷酸可含有下列碱基-胸腺嘧啶(T),它能与双链DNA的A-T二联体形成三联体(Rajagogal等,生物化学28(1989)7889);-腺嘌蛉(A),它能与双链DNA的A-T二联体形成三联体;-鸟嘌呤(G),它能与双链DNA的G-C二联体形成三联体;-质子化胞嘧啶(C+),它能与双链DNA的G-C二联体形成三联体(Rajagogal等,同上);-尿嘧啶(U),它能与A-U或A-T碱基对形成三联体。
优选地,所用的寡核苷酸包含一种富集胞嘧啶的高嘧啶序列,DNA中的特定序列则为一种高嘌呤-高嘧啶序列。胞嘧啶的存在使得形成酸性pH下稳定的三螺旋,此时胞嘧啶被质子化,而在碱性pH下胞嘧啶被中和,三螺旋不稳定。
为了通过杂交形成三螺旋,寡核苷酸与DNA上的特异序列互补是很重要的。为了获得最佳产率和最佳选择性,在本发明方法中应使用完全互补的寡核苷酸和特定序列。特别可以是多聚CTT寡核苷酸和多聚GAA特异序列。例如,寡核苷酸序列可以是5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(GAGG(CTT)7;(SEQ ID NO.1),其中碱基GAGG不形成三螺旋,但使寡核苷酸与偶联臂间有一间隔;还可以指出序列(CTT)7(SEQ IDNo.26)。这些寡核苷酸能够与含有互补基元(GAA)的特定序列形成三螺旋。尤其涉及到如实施例中所述包含7、14或17个GAA基元的区域。
另一个具有特异性的序列是如下序列5′-AAGGGAGGGAGGAGAGGAA-3′(SEQ ID n°5)该序列与下列寡核苷酸形成三螺旋5′-AAGGAGAGGAGGGAGGGAA-3′(SEQ ID n°6)或5′-TTGGTGTGGTGGGTGGGTT-3′(SEQ ID n°7)此时,寡核苷酸以与多嘌呤链反向平行的方向定位。这些三螺旋在Mg2+存在下不稳定(Vasguez等,生物化学,1995,34,7243-7251;Beal和Dervan,科学,1991,251,1360-1363)。
如上文所指出的那样,特定序列可以是双链DNA上天然存在的序列,或者人工引入其中的合成序列。使用能与双链DNA上天然存在的序列形成三螺旋的寡核苷酸特别有意义,例如存在于质粒复制起始区或基因标志区中的天然序列。关于这一点,申请人进行了质粒序列的分析,并表明这些DNA的某些区域(尤其是复制起始区)可能具有高嘌呤-高嘧啶区。合成能与这些高嘌呤-高嘧啶区形成三螺旋的寡核苷酸,则可以用未经修饰的质粒(尤其是pUC,pBR322、pSV等类型的商业质粒)有利地实施本发明的方法。对天然存在于双链DNA中的高嘌呤-高嘧啶序列,可以列举大肠杆菌复制起始区colE1中的含序列5'-CTTCCCGAAGGGAGAAAGG-3′(SEQID No.2)的全部或一部分的序列。此时,形成三螺旋的寡核苷酸具有这样的序列5′-GAAGGGTTCTTCCCTCTTTCC-3′(SEQ ID No.3),并如Beal和Dervan(美国化学协会杂志,1992,114,4976-4982)及Jayasena和Johnston(核酸研究,1992,20,5279-5288)所述在双螺旋的两条链上择一固定。还可以举出质粒pBR322的β-内酰胺酶基因的5'-GAAAAAGGAAGAG-3′(SEQ ID No.4)序列(Duval-valentin等,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89,504-508)。应用能与复制起动区或基因标志区中存在的序列形成三螺旋的寡核苷酸特别有利,因为用相同的寡核苷酸可以纯化所有含所述复制起始区或所述基因标志区的DNA。这样就没有必要为使其含有人工特异序列而修饰质粒或双链DNA。
虽然优选那些完全互补的序列,但应认识到只要不引起太大的亲和力损失,在寡核苷酸序列和DNA中序列间容许有一定的错配。可举出大肠杆菌β-内酰胺酶基因中的序列5′-AAAAAAGGGAATAAGGG-3′(SEQ IDNo.8),其中中断多嘌呤序列的胸嘧啶可能被第三条链的鸟嘌呤所认别,从而形成ATG三联体,它在被夹在两个TAT三联体之间时是稳定的(Kiessling等,生物化学,1992,31,2829-2834)。
根据一种特别的实施方案,本发明的寡核苷酸包含(CCT)n序列、(CT)n序列或(CTT)n序列,其中n为包括端点的1-15间的整数。使用(CT)n或(CTT)n型序列特别有利。实际上申请人已证明纯化产率受寡核苷酸中C的含量的影响。特别如实施例7中所示,当寡核苷酸含有较少胞嘧啶时则纯化收率提高。应认识到,本发明的寡核苷酸还可以将(CCT)、(CT)或(CTT)基元结合在一起。
所用寡核苷酸可以是天然的(由天然碱基而非修饰碱基组成)或化学修饰的。具体地,寡核苷酸含有某些化学修饰是有利的,可以提高其对核酸酶的抗性或保护其不受核酸酶降解、或者提高对特定序列的亲和力。
根据本发明,寡核苷酸还指经过骨架修饰的任何核苷链,修饰的目的在于使其更耐核酸酶。在可能的修饰中,可列举能与DNA形成三螺旋的硫代磷酸酯寡核苷酸(Xodo等,核酸研究,1994,22,3322-3330),以及具有甲缩醛或甲基膦酸酯骨架的寡核苷酸(Matteucci等,美国化学协会杂志,1991,113,7767-7768)。还可以使用用核苷酸α-异构体合成的寡核苷酸,它们也与DNA形成三蚴旋(Le Doan等,核酸研究,1987,15,7749-7760)。另一种骨架修饰是氨基磷酸酯键。例如可以举出Gryaznov和Chen描述的N3′-P5′氨基磷酸酯这种核苷酸间键,它使得其核苷酸与DNA形成特别稳定的三螺旋(美国化学协会杂志,1994,116,3143-3144)。对于其他的骨架修饰,还可以举出核糖核苷酸、2′-O-甲基核糖、磷酸二酯等的应用(Sun和Helene,结构生物学的现代观点(curr.Opinon Struct.Biol.,116,3143-3144)。含磷骨架最终可以被如PNA中的聚酰胺骨架(《肽和核酸》)代替,PNA也可以形成三螺旋(Nielsen等,科学,1991,254,1497-1500;Kim等,美国化学协会杂志,1993,115,6477-6481)),或被以胍为基础的骨架代替,如DNG中的骨架(脱氧核糖核酸胍,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1995,92,6097-6101),DNA多阳离子类似物,它们也能形成三螺旋。
第三条链的胸腺嘧啶还可以用一种5-溴尿嘧啶代替,这可提高寡核苷酸对DNA的亲和力(Povsic和Dervan,美国化学协会杂志,1989,111,3059-3061)。第三条链也可以包含非天然碱基,例如,7-脱氮-2'-脱氧黄苷(Milligan等,核酸研究,1993,21,327-333)、1-(2-脱氧-β-D-呋喃核糖基)-3-甲基-5-氨基-1H-吡唑并[4,3-d]嘧啶-7-酮(Koh和Dervan,美国化学协会杂志,1992,114,1470-1478)、8-氧代腺嘌呤、2-氨基嘌呤、2′-O-甲基-假异胞嘧啶,或本领域技术人员已知的任何其他修饰(请查看Sun和Helene,Curr.Opinon Struct.Biol.,1993,3,345-356)。
另一类寡核苷酸修饰的目的更具体地在于改善寡核苷酸和特定序列间的相互作用和/或亲和力。按照本发明,一种十分有利的修饰是将寡核苷酸的胞嘧啶甲基化(参见实施例5)。如此甲基化的寡核苷酸具有显著的特性,能与特异序列形成在更接近中间的pH区(≥5)中稳定的三螺旋。这样就可以在高于现有技术寡核苷酸的pH的pH下工作,即在质粒DNA降解可能性小的pH下工作。
本发明方法中所用寡核苷酸的长度为至少3个碱基,优选5-30个。使用长度大于10个碱基的寡核苷酸有利。本领域技术人员可以根据所研究的相互作用的选择性和稳定性具体调节其长度。
本发明的寡核苷酸可用任何已知技术合成,尤其可以利用核酸合成仪来制备。当然可以使用本领域技术人员已知的任何其他方法。
为了能与载体共价偶联,寡核苷酸一般是官能化的。例如可以在5′或3′位经末端硫醇、氨基或羧基基团来修饰。尤其是,加入硫醇、氨基或羧基可使其与例如含有二硫键、马来酰亚胺、胺、羧基、酯、环氧、溴代氰或醛功能团的载体偶联。通过寡核苷酸和载体间建立二硫键、硫醚键、酯键、酰胺键或胺键来形成这种偶联。也可以使用本领域技术人员已知的任何其他已知方法,如双官能团偶联物的反应。
另外,为了改善与偶联寡核苷酸的杂交,寡核苷酸最好含有一“臂”和碱基序列“间隔”。应用“臂”使得寡核苷酸固定在距载体选定距离处,从而改善与DNA相作用的条件。所述臂最好由一条直碳链和一个氨基组成,该链含有1-18个,优选6或12个(CH2)基团,氨基使得与柱相连。该臂连接在寡核苷酸或由不影响杂交的碱基组成的“间隔”上的磷酸酯上。因此,“间隔”可包含嘌呤碱基,例如可含有GAGG序列。而臂最好由含6或12个碳原子的直碳链组成。
为了实施本发明,可以使用不同类型的载体。这可以是散装或柱装经过预调节的官能化色谱载体,官能化塑料表面或官能化橡胶珠(磁化或否)载体。优选色谱载体。可以使用的色谱载体例如是琼脂糖、丙烯酰胺或葡聚糖及其衍生物(如Sephadex,Sepharose,Superose…),诸如聚(苯乙烯二乙烯苯)的聚合物,或接枝或末接枝的二氧化硅。色谱柱可以按扩散或灌注方式起作用。
为了获得更好的纯化收率,在质粒上使用一种包含多个寡核苷酸杂交位点的序列是特别有利的。多个杂交位点的存在有利于所述序列与寡核苷酸间的相互作用,这导致纯化收率改善。因此,对于含n个(CCT)、(CT)或(CTT)重复基元的寡核苷酸,优选使用含至少n个互补基元(优选n+1个互补基元)的DNA序列。含n+1个互补基元的序列提供两个寡核苷酸杂交位点。有利地是,DNA序列含有多达11个杂交位点,即n+10个互补基元。
本发明的方法可用于纯化任何类型的DNA双链,例如环形DNA,如一般含一个或多个目的治疗基因的质粒。该质粒还可以含有一个复制起始区、基因标志等。本发明方法可直接应用于细胞裂解液。在此实施方式中,经转化接着细胞培养而被扩增后,质粒在细胞裂解后被直接纯化。本发明方法也可以应用于细胞裂解清液,即细胞裂解液在中和并离心后得到的上清液。当然还可以用于经已知方法预纯化的溶液。本方法还能从含有不同序列DNA的混合物中纯化含目标序列的线性或环形DNA。本发明方法还可以用于纯化双链RNA。
细胞裂解液可以是原核或真核细胞裂解液。
关于原核细胞,例如有大肠杆菌、枯草芽胞杆菌、鼠伤寒杆菌或链霉菌等细胞。关于真核细胞,例如有动物细胞、酵母、真菌等,尤其是克鲁维酵母或酵母属酵母,或COS、CHO、C127、NIH3T3细胞等。
本发明方法特别有利,因为它能快速简便地获得高纯度质粒DNA。尤其是如实施例中所述,本方法能将目标质粒DNA有效地与污染成份分离,如染色体DNA片段、内毒素、蛋白质、核酸酶等。尤其,本发明方法能获得染色体DNA含量低于或等于0.5%的双链DNA(特别是质粒DNA)制品。。更优选所得DNA制品中染色体DNA含量小于或等于0.2%。本发明接下来描述含质粒DNA的组合物,其中的DNA尤其在基因或细胞治疗中可以药用。关于这一点,本发明另一目的是含有按上述方法制备的线性或质粒双链DNA的药物组合物。
本发明还涉及染色体DNA含量小于或等于0.5%(优选小于或等于0.2%,更优选小于或等于0.1%)的质粒DNA制品。
本发明组合物可含有“裸”质粒DNA,或质粒DNA与转运载体例如脂质体、纳米颗粒、阳离子脂质、聚合物、蛋白质或重组病毒等结合。
借助下列实施例将更详细地描述本申请,这些实施例应视为说明性而非限制性的。克隆和分子生物学的一般技术诸如限制性内切酶消化、凝胶电泳、大肠杆菌中的转化、核酸沉淀等的经典分子生物学方法在文献中都有描述(Maniatis等,T.,E.F.Fritsch和J.Sambrook 1989,分子克隆实验室手册,第二版,美国纽约冷泉港实验室出版社;Ausubel F.M.,R.Brent,R.E.Kinston,D.D.Moore,J.A.Smith,J.G.Seindman和k.struhl.1987,现代分子生物学方法1987-1988,美国纽约John Willey and Sons出版)。按照文献实验方法(Ausubel等,1987),用链终止法确定了核苷酸序列。
限制酶由新英格兰生物实验室(Biolabs,Beverly,MA)提供。
为进行连接,在T4噬菌体DNA连接酶存在下,将DNA片段在缓冲液Tris-HCl pH7.4 50mM,MgCl210mM,DTT 10mM,ATP 2mM中保温。
在Biosearch 8600 DNA自动合成仪上按制造商的推荐方法,用β位氰乙基保护的氨基亚磷酸酯化学合成3寡核苷酸。
(Sinha.N.D.,J.Biernat,J.McManus and H.Kster.1984.Polymer support oligonucleotide synthesis,XVIIIUse of β-cyanoethyl-N,N-dialkylamino-/N-morpholino phosphoramidite of déoxynucleosides for the synthesisof DNA fragments simplifying deprotection and isolation of the final product.Nucl.AcidsRes.,12,4539-4557;Giles,J.W.1985.Advances in automated DNA synthesis.Am.Biotechnol.,Nov./Dec.)连接后的DNA或用于测试其转化效力的DNA用于转化感受态菌株大肠杆菌DH 5α(F′/end Al,hsdR 17,supE44,thi-1,recAl,gyrA96,relAl,Δ(lacZYA-argF)U169,deoR,cb80dlac[lacZΔM15)]。
按照klein等(1980)的实验方法进行质粒DNA的小量制备。
LB培养基用于大肠杆菌菌株的生长(Maniatis等,1982)。在37℃下培养菌株。将细胞铺在补有适当抗生素的LB培养皿中。实施例11.1色谱柱的准备材料所用柱是用1ml NHS(N-羟基琥珀酰亚胺,Pharmacia)活化的HiTrap柱,它与一蠕动泵(流速<1ml/min)连接。所用特异寡核苷酸在5′端具有NH2基团,其序列如下5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3'(SEQ ID n°1)本实施例中所用缓冲液如下酶切缓冲液NaHCO30.2M,NaCl 0.5M,pH8.3。缓冲液A乙醇胺0.5M,NaCl 0.5M,pH8.3。缓冲液B乙酸0.1M,NaCl 0.5M,pH4。方法用6ml 1mM HCl洗柱,然后将稀释在酶切缓冲液中的寡核苷酸(1ml,50nmol)上柱,室温下放置30分钟。用6ml缓冲液A连续洗柱三次,再用6ml缓冲液B洗涤,这样寡核苷酸就通过CONH键共价连接在柱上。该柱在4℃ PBS 0.1%NaN3中保存,至少可用4次。1.2质粒构建合成下列两个寡核苷酸。寡核苷酸48175′-GATCCGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGAAGG-3'(SEQ ID n°9)寡核苷酸4818
5′-AATTCCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTTCG-3′(SEQ ID n°10)这些寡核苷酸一旦合成并克隆在一质粒中,如上所述,它们给相应的质粒带来高嘌呤-高嘧啶序列(GAA)17。
相应于这两种杂交寡核苷酸的序列已被克隆在pBKS+质粒(Stratagene克隆系统,LaJolla CA)的多克隆位点上,该质粒带有氨苄青霉素抗性基因。为了实施这一点,按以下方式杂交这些寡核苷酸。将1μg这两种寡核苷酸混合在终体积40ml的缓冲液中50mM Tris-HClpH7.4,10mM MgCl2。将该混合物加热至95℃,然后置于室温下以使温度慢慢降低。10ng杂交寡核苷酸混合物与30ml终体积中BamHI和EcoRI消化的200ng pBKS+质粒(Stratagene克隆系统,La Jalla CA)连接。连接后,一份连接物用于转化DH5α。将转化混合物铺在补有氨苄青霉素(50mg/l)和x-gal(20mg/l)的L培养基上。亲本质粒(pBKS+)能进行大肠杆菌β-半乳糖苷酶ω片段的α-互补,而重组克隆在此培养基上应没有蓝色。六个克隆的质粒DNA小量制备后证明,它们在pBKS+的EcoRI和BamHI位点间缺失PstI位点,含多克隆位点的448pb的Pvu II带的分子量增加。保留了一个克隆,其相应质粒称为pXL2563。用来自质粒pBKS+(stratazene 克隆系统,La Jalla CA)的引物-20(5′-TGACCGGCAGCAAAATG-3′(SEQ ID No.11)测序验证了克隆的序列(Viera J.和J.Messing,1982,pUC质粒,一种用于插入突变和用通用合成引物测序的M13mp7衍生系统。《基因》19,259-268)。用Wizard Megaprep试剂盒(Promega corp.,Madison,WI)按供应商的推荐方法纯化了质粒pXL2563。这种质粒DNA制品接下来用于下述实施例中。1.3质粒的纯化材料在1.1中描述的与寡核苷酸偶联的HiTrap柱上从含有pBKS+质粒的溶液中纯化了质粒pXL 2563(1.2中所述)。该纯化中所用缓冲液如下缓冲液FNaCl2M,乙酸0.2M,pH4.5-5。
缓冲液ETris1M,HCl pH9,EDTA 0.5mM。万去用6ml缓冲液F洗柱,然后将质粒(400μl缓冲液F中20μgpXL2563+20μg pBKS+)上柱,室温下保温2小时。用10ml缓冲液F洗柱,然后用缓冲液E洗脱。在1%琼脂糖凝胶上电泳并用溴化乙锭染色后检测质粒。通过测定质粒的大肠杆菌的转化活性来评定其在溶液中的比例。结果从含有30%pXL2563和70%pBKS+的混合物开始,在柱出口收集到100%的pXL2563溶液。通过260和280nm处O.D.值之比评定的纯度为1.9到2.5,这表明可用该方法除去污染蛋白。实施例22.1-该实施例描述一种质粒DNA的纯化实验。如实施例1中所述将寡核苷酸(5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCT-3′(SEQ ID No.1))偶联在柱上。为进行这一连接,用连在含六个碳原子的间隔臂之磷酸酯上的胺基团修饰寡核苷酸5′未端(修饰的寡核苷酸,比利时Eurogentec SA)。借助于Wizard Megoprep试剂盒(Promega Corp.Madison,WI)按供应商的推荐方法纯化了质粒pXL2563。该实施例中所用缓冲液如下缓冲液FNaCl 0.2M,乙酸0.2M,pH4.5-5。
缓冲液ETris 1M,HCl pH9,EDTA 0.5mM。
用6ml缓冲液F洗柱,然后将稀释在400μl缓冲液F中的100μg质粒pXL2563上柱,室温下保温2小时。用10ml缓冲液F洗柱,然后用缓冲液E洗脱。通过测定260nm处的光密度对质粒定量。在该实施例中,固定化在NaCl摩尔浓度为0-2M的缓冲液(缓冲液F)中进行。纯化收率随着NaCl的摩尔浓度降低而下降。固定化缓冲液的pH可在4.5-5间交化,纯化收率在4.5时较好。还可以使用另一种碱性pH洗脱缓冲液如用缓冲液硼酸盐50mM,pH9,EDTA 0.5mM进行洗脱。
2.2如实施例1中所示,将寡核苷酸(5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID No.1))偶联在柱上。借助Wizard Megaprep.试剂盒(Promege Corp.,Madison,WI)按供应商的推荐方法纯化质粒pXL2563。该实施例中所用缓冲液如下缓冲液FNaCL 0.1M,乙酸0.2M,pH5。
缓冲液ETris 1M,HCl pH9,EDTA 0.5mM。
用6ml缓冲液F洗柱,然后将稀释在400μl缓冲液F中的质粒pXL2563上柱,室温下保温1小时。用10ml缓冲液F洗柱,然后用缓冲液E洗脱。在通过寡核苷酸柱之前和之后,测定质粒样品中大肠杆菌基因组或染色体DNA的百分率。按下述方法用大肠杆菌galk基因中的引物经PCR对该基因组DNA定量。这些引物的序列如Debouck等所述(核酸研究,1985,13,1841-1853)5′-CCG AAT TCT GGG GAC CAA AGC AGT TTC-3′(SEQ ID N°24)和5′-CCA AGC TTC ACT GTT CAC GAC GGG TGT-3′(SEQ ID N°25)反应介质包括处在25μl PCR缓冲液(Promega France,Charbonnienes)中的1.5mM MgCl2;0.2mM dXTP(Pharmacia,Orsay);0.5μM引物;20μ/ml Taq聚合酶(Promega)。接以下顺序进行反应-95℃,5分钟-95℃10秒60℃30秒78℃1分钟,共30个循环-78℃10分钟。
在SybrGreenI(Molecular Probes,Eugene,USA)存在下通过在3%琼脂糖凝胶上进行电泳来分离124对碱基长的DNA扩增片段,然后参照一组大肠杆菌(B株)超纯基因组DNA(Sigma,ref.D4889)进行定量。
上柱样品中含1%的染色体DNA,而经寡核苷酸柱纯化样品中含0.2%。实施例3对裂解清液的实验本实施例描述小规模的从细菌培养物裂解清液纯化质粒DNA。将含质粒pXL2563的DH5α株的过夜培养物1.5ml离心,将沉淀重新悬浮于100μl葡萄糖50mM,Tris 25mM HCl pH8,EDTA 10mM中。加入200μl NaOH0.2M,SDS 1%,倒置混匀,加入150μl醋酸钾3M,pH5,倒置混匀。离心后收集上清液,上样于如实施例1中所述制得的寡核苷酸柱上。固定、洗涤和洗脱与实施例1中所述的相同。从1.5ml培养液收获了约1μg质粒。经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色的分析表明,所得质粒以“高卷绕”环形DNA单一带形式存在。在经该方法纯化的质粒中检测不到任何高分子量(染色体)DNA痕迹,也没有RNA。260和280nm处光密度之比大于2。实施例44.1本实施例描述在实施例3的相同条件下从含质粒pXL2563的DH5α株的细菌培养液20ml中纯化质粒DNA的实验。将细胞层重新悬浮于1.5ml葡萄糖50mM,Tris 25mM HCl pH8,EDTA 10mM中。用2ml 0.2M NaOH,1%SDS进行裂解,用1.5ml pH5 3M醋酸钾中和。然后用3ml 2-普萘洛尔沉淀DNA,将沉淀重溶在0.5ml pH5 0.2M醋酸钠,0.1M NaCl中,载于如实施例1中所得到的寡核苷酸柱上。如实施例1中所述进行固定、洗柱和洗脱,不同的是洗涤缓冲液的NaCl摩尔浓度为0.1M。获得约16μg质粒DNA。经琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色分析表明,所得质粒以“高卷绕”环形DNA的单一带形式存在。在纯化质粒中检测不到任何高分子量(染色体)DNA痕迹,也没有RNA痕迹。用一限制酶消化该质粒得到分子量预计为3千碱基的单一带。样品中蛋白浓度从裂解清液中的125μg/ml变为纯化质粒中的少于1μg/ml(用Micro-BCA,Pierce定量测定)。纯化质粒中的内毒素浓度(经LAC(Biosepra)定量)比开始的裂解清液中小10倍以上。
4.2所用质粒包含一个(表达)盒,其中含有巨细胞病毒启动子、虫荧光素酶编码基因和来自质粒pXL 2563的高嘌呤-高嘧啶序列(GAA)17。在7升发酵罐中培养含有该质粒的DHI菌株(Maniatis等,1989)。从200g细胞制备裂解清液将细胞层重悬于2升25mM Tris pH6.8,50mM葡萄糖,10mM EDTA中,再向其中加入2升0.2M NaOH,1%SDS。加入1升3M醋酸钾中和裂解液。渗滤后将4ml该裂解液载于5ml Hitrap-NHS柱上,该柱已与寡核苷酸序列5'-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID No.1)按实施例1描述的方法偶联。获得约400μg质粒。按实施例2.2描述的技术测得,该样品中基因组DNA的百分含量为0.1%。实施例5修饰寡核苷酸的应用本实施例描述带甲基化胞嘧啶的寡核苷酸的应用。
所用寡核苷酸的序列如下5′-GAGGMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTTMeCTT-3′(SEQ ID n°12)该核苷酸具有5′的NH2基团。McC=5-甲基胞嘧啶。用该寡核苷酸在实施例1的条件下可以纯化质粒pXL2563,其中固定化缓冲液的pH为5(从而降低了质粒降解的危险)。实施例6在上述实施例中,所用寡核苷酸已用经过六碳原子臂连于磷酸酯的胺基团NH2-(CH2)6进行了5'-末端修饰。在本实施例中,胺其团通过十二碳原子臂NH2-(CH2)17连接于5'-末端的磷酸酯上。用缓冲液F2MNaCl,0.2M乙酸,pH4.5。如实施例2中所述进行寡核苷酸的连接和过柱。用该寡核苷酸可得到更好的纯化收率53%,而用六碳原子寡核苷酸在相同条件下的收率为45%左右。实施例7按照实施例1.2中描述的克隆方法构建了另外两个含高嘌-呤高嘧啶序列的质粒含(GGA)15列的质粒pXL2725和含(GA)25序列的质粒pXL2726。实施例7.1质粒的构建与质粒pXL2563相似,用下列寡核苷酸对按实施例1.2中描述的克隆方法构建了质粒pXL2725和pXL272659865′-GATCC(GA)25GGG-3′(SEQ ID n°13)59875′-AATTCCC(TC)25G-3′(SEQ ID n°14)59815′-GATCC(GGA)17GG-3′(SEQ ID n°15)59825′-AATT(CCT)17CCG-3′(SEQ ID n°16)通过将寡核苷酸对5986和5987克隆在pBKS+(Stragene克隆系统,La Jalla CA)的BamHI和EcoRI位点间构建质粒pXL2726,而寡核苷酸5981和5982用于构建质粒pXL2725。使用了与质粒pXL2563构建相同的实验条件,只是改变了寡核苷酸对。同样,通过测序验证了这些质粒上克隆的序列。这种测序发现质粒pXL2725与预计的序列有差别,即不是17个GGA重复序列,而是GGAGA(GGA)15(SEQ ID No.17)。实施例7.2柱的准备和纯化能与这些高嘌呤序列形成三螺旋的寡核苷酸按实施例1.1中描述的技术偶联在HiTrap柱上。这涉及用于纯化质粒pXL2725的寡核苷酸序列5′-AATGCCTCCTCCTCCTCCTCCTCCT-3'(SEQ ID n°18)和用于纯化质粒pXL2726的寡核苷酸序列5′-AGTGCTCTCTCTCTCTCTCTCTCTCT-3'(SEQ ID n°19)用下述缓冲液按实施例2中描述的技术,用这样制得的两个柱子纯化了相应的质粒缓冲液FNaCl 2M,乙酸0.2M,pH4.5缓冲液ETris 1M,HCl pH9,EDTA 0.5mM。
收率分别为pXL272523%,pXL272631%。实施例8本实施例说明质粒中特定序列的长度对纯化收率的影响。实施例8.1质粒的构建用于这些实验以显示本发明组合物活性的报道基因是虫荧光素酶(Luc)的编码基因。
质粒pXL2621含有一表达盒,后者含有用限制酶M1μI和HindIII从pcDNA3(Invitrogen公司,San Diego,CA)切下并克隆在基础载体pGL(Promega公司,Madison,WI)中M1μl和HindIII位点间(虫荧光素酶编码基因上游)的661bp提取物的巨细胞病毒(CMV)启动子。用经典分子生物学技术构建这一质粒。
用下述方法构建质粒pXL2727-1和pXL2727-2。
2μg质粒pXL2621用BamHI线性化;通过在65℃下处理10分钟灭活该酶;与此同时如质粒pXL2563的构建中所述使寡核苷酸6006和6008杂交。
6006 5′-GATCT(GAA)17CTGCAGATCT-3'(SEQ ID n°20)6008 5′-GATCAGATCTGCAG(TTC)17A-3'(SEQ ID n°21)将该杂交混合物克隆在质粒pXL2621的BamHI末端,转化在DH5α中后通过PstI限制性酶切分析辨认重组克隆,因为寡核苷酸已引入了PstI位点。保留了两个克隆,用引物(6282,5′-ACAGTCATAAGTGCGGCGACG-3′(SEQ ID No.22))作为测序反应引物验证了克隆的核苷酸片段(VieraJ和J.Messing,1982,pUC质粒,一种用于插入诱突和用通用合成引物测序的M13mp7-衍生系统,《基因》19259-268)。
第一个克隆(pXL2727-1)含有10个GAA重复序列。第二个克隆(pXL2727-2)含有序列5'-GAAGAAGAG(GAA)7GGAAGA GAA-3′(SEQID No.23)。实施例8.2柱子的准备和纯化使用如实施例1中所述的那样并与寡核苷酸5′-GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT-3′(SEQ ID No.1)偶联的柱子。
质粒pXL2727-1含有14个GAA重复序列。而如上所述的寡核苷酸只有7个相应的杂交序列CTT,因而能在8个不同位置与质粒杂交。相反,质粒pXL2727-2具有与固定在柱上的寡核苷酸同样长度的可杂交序列(GAA)7°因而该寡核苷酸只能在pXL2727-2的一个位置上杂交。
用下述缓冲液进行与实施例2中所述相同的实验缓冲液F2M NaCl,0.2M醋酸pH4.5缓冲液E1M Tris,HCl pH9,0.5mM EDTA纯化收率为pXL2727-129%,pXL2727-219%。实施例8.3哺乳动物细胞的体外转染所用细胞是NIH 3T3细胞,在实验前夜按50000细胞/孔接种于24孔培养板上。将质粒稀释在150mM NaCl中,并与脂质转染剂RPR 115 335混合。利用脂质转染剂的正电荷/DNA的负电荷等于6这一比值。涡流搅拌混合物,室温下放置10分钟,在无胎牛血清的介质中稀释,然后将其按1μg DNA/培养孔加至细胞之中。37℃2小时后,加入10%v/v的胎牛血清,在5% CO2存在下37℃培养48小时。细胞用PBS洗涤2次,用文献方法(Promega试剂盒,Promega Corp.Madison,WI)在Lumat LB9501发光计(EG et G Berthold,Evry)上测定虫荧光素酶活性。按实施例8.2纯化的质粒pXL2727-1产生的转染收率比用Wizard Megaprep试剂盒(PromegaCorp.Madison,WI)纯化的相同质粒的转染收率高2倍。
序列表(1)一般信息(i)申请人(A)名称RHONE DOULENC RORER(B)街道RAYMOND ARON大街20号(C)城市安东尼(E)国家法国(F)邮编92165(G)电话40.91.69.22(H)传真40.91.72.91(ii)发明名称通过与固定化寡核苷酸形成三螺旋纯化DNA的方法(iii)序列数目25(iv)计算机可读形式(A)载体类型软盘(B)计算机IBM PC兼容(C)操作系统PC-DOS/MS-DOS(D)软件PatentIN Release#1.0,#1.30版(EPO)(2)SEQ ID No.1的信息(I)序列特征(A)长度25碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No1GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT 25(2)SEQ ID No.2的信息(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸
(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型 cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.2CTTCCCGAAG GGAGAAAGG19(2)SEQ ID No.3的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ IDNo.3GAAGGGTTCT TCCCTCTTTC C21(2)SEQ ID No.4的信息(i)序列特征(A)长度13碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.4GAAAAAGGAA GAG 13(2)SEQ ID No.5的信息(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性
(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.5AAGGGAGGGA GGAGAGGAA19(2)SEQ ID No.6的信息(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.6AAGGAGAGGA GGGAGGGAA19(2)SEQ ID No.7的信息(i)序列特征(A)长度19碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.7TTGGTGTGGT GGGTGGGTT19(2)SEQ ID No.8的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链
(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.8AAAAAAGGGA ATAAGGG 17(2)SEQ ID No.9的信息(i)序列特征(A)长度58碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.9GATCCGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGG 58(2)SEQ ID No.10的信息(i)序列特征(A)长度58碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.10AATTCCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCG58(2)SEQ ID No.11的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性
(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.11TGACCGGCAG CAAAATG 17(2)SEQ ID No.12的信息(i)序列特征(A)长度17碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(ix)特征(D)其它信息序列中的所有胞嘧啶C均被甲基化(xi)序列描述SEQ ID No.12GAGGCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTT25(2)SEQ ID No.13的信息(i)序列特征(A)长度58碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.13GATCCGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGAGAG AGAGAGGG 58(2)SEQ ID No.14的信息(i)序列特征(A)长度58碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性
(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.14AATTCCCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCTCG 58(2)SEQ ID No.15的信息(i)序列特征(A)长度58碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.15GATCCGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGG58(2)SEQ ID No.16的信息(i)序列特征(A)长度58碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.16AATTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCTCC TCCTCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCTCCG 58(2)SEQ ID No.17的信息(i)序列特征(A)长度50碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA
(xi)序列描述SEQ ID No.17GGAGAGGAGG AGGAGGAGGA GGAGGAGGAG GAGGAGGAGG AGGAGGAGGA 50(2)SEQ ID No.18的信息(i)序列特征(A)长度25碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.18AATGCCTCCT CCTCCTCCTC CTCCT25(2)SEQ ID No.19的信息(i)序列特征(A)长度26碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.19AGTGCTCTCT CTCTCTCTCT CTCTCT 26(2)SEQ ID No.2 0的信息(i)序列特征(A)长度66碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链
(D)构型线性(ii)分子类型cDN A(xi)序列描述SEQ ID No.20GATCTGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAAGAAG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GAAGAACTGC 60AGATCT 66(2)SEQ ID No.21的信息(i)序列特征(A)长度66碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.21GATCAGATCT GCAGTTCTTC TTCTTCTTCT TCTTCTTCTT CTTCTTCTTC TTCTTCTTCT 60TCTTCA 66(2)SEQ ID No.22的信息(i)序列特征(A)长度21碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.22ACAGTCATAA GTGCGGCGAC G21(2)SEQ ID No.23的信息(i)序列特征(A)长度39碱基对
(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.23GAAGAAGAGG AAGAAGAAGA AGAAGAAGAA GGAAGAGAA 39(2)SEQ ID No.24的信息(i)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.24CCGAATTCTG GGGACCAAAG CAGTTTC 27(2)SEQ ID No.25的信息(i)序列特征(A)长度27碱基对(B)类型核苷酸(C)链型单链(D)构型线性(ii)分子类型cDNA(xi)序列描述SEQ ID No.25CCAAGCTTCA CTGTTCACGA CGGGTGT 2权利要求
1.双链DNA的纯化方法,其特征在于包括至少以下步骤将含所述DNA和其他成份的混合物溶液通过共价偶联有寡核苷酸的载体,其中寡核苷酸能够通过杂交与所述DNA中存在的特定序列形成三螺旋。
2.权利要求1的方法,其特征在于含所述DNA的溶液是细胞裂解液。
3.权利要求2的方法,其特征在于细胞裂解液为裂解清液。
4.权利要求1的方法,其特征在于双链DNA是经过预纯化的。
5.权利要求1的方法,其特征在于DNA上存在的特定序列含有高嘌呤-高嘧啶序列,寡核苷酸含有与该高嘌-呤高嘧啶序列形成三螺旋的序列。
6.权利要求1-5之一的方法,其特征在于特定序列是人工引入双链DNA中的。
7.权利要求5的方法,其特征在于寡核苷酸含有多聚-CTT序列,DNA上特定序列为一多聚GAA序列。
8.权利要求5的方法,其特征在于寡核苷酸具有以下序列GAGGCTTCTTCTTCTTCTTCTTCTT(SEQ ID No.1)。
9.权利要求5的方法,其特征在于寡核苷酸具有(CTT)7序列(SEQID No.26)。
10.权利要求8或9的方法,其特征在于DNA上特定序列含有序列(GAA)7、(GAA)14或(GAA)17。
11.权利要求5的方法,其特征在于DNA上的特定序列含有序列SEQ IDNo.5,而寡核苷酸含有序列SEQ ID No.6或SEQ ID No.7。
12.权利要求5的方法,其特征在于DNA上的特定序列含有序列SEQ IDNo.17,而寡核苷酸含有序列SEQ ID No.18。
13.权利要求5的方法,其特征在于DNA上的特定序列含有序列(GA)25,而寡核苷酸含有序列SEQ ID No.19。
14.权利要求1-5之一的方法,其特征在于特定序列是天然存在于DNA双链上的特定序列。
15.权利要求14的方法,其特征在于天然存在于DNA上的特定序列是存在于质粒复制起始区中的高嘌呤-高嘧啶序列。
16.权利要求15的方法,其特征在于特定DNA序列包含含于大肠杆菌复制起始区ColEI中的序列SEQ ID No.2的全部或部分。
17.权利要求16的方法,其特征在于寡核苷酸含序列SEQ ID No.3。
18.权利要求14的方法,其特征在于特定DNA序列包括含于质粒pBR 322的β-内酰胺酶基因中的序列SEQ ID No.4或SEQ ID No.8的全部或部分。
19.以上权利要求之一的方法,其特征在于寡核苷酸通过二硫键、硫醚键、酯键、酰胺键或胺键偶联在载体上。
20.权利要求19的方法,其特征在于寡核苷酸通过由一碳链(CH2)n组成的臂固定在柱子上,其中n为1-8间包括端点的整数,所述臂通过磷酸酯与寡核苷酸相连,而通过酰胺键与柱子相连。
21.权利要求20的方法,其特征在于所述臂由含6个碳原子的直碳链组成。
22.权利要求20的方法,其特征在于所述臂由含12个碳原子的直碳链组成。
23.以上权利要求之一的方法,其特征在于寡核苷酸含有至少一种化学修饰,使其耐核酸酶或保护其不受核酸酶破坏、或提高其对特定序列的亲和力。
24.权利要求23的方法,其特征在于寡核苷酸含一高嘧啶序列,其中至少胞嘧啶是甲基化的。
25.以上权利要求之一的方法,其特征在于DNA还含有一个或多个目标治疗序列。
26.以上权利要求任一项的方法,其特征在于双链DNA是诸如质粒的环形DNA。
27.权利要求1的方法,其特征在于DNA双链上存在的特定序列包含多个与寡核苷酸杂交的位点。
28.权利要求1的方法,其特征在于载体选自色谱载体、塑料表面和官能化胶乳珠。
29.权利要求28的方法,其特征在于载体是一种色谱载体。
30.含有按权利要求1-29之一的方法获得的DNA的药物组合物。
31.纯化的重组质粒DNA制品,其特征在于其中染色体DNA含量小于或等于0.5%。
32.纯化的重组质粒DNA制品,其特征在于其中染色体DNA含量小于或等于0.2%。
33.纯化的重组质粒IDA制品,其特征在于其中染色体DNA含量小于或等于0.1%。
34.权利要求1的方法用于纯化双链RNA。
全文摘要
本发明涉及一种双链DNA的纯化方法。根据这种方法,将含有所述DNA和其他成分的混合物溶液通过与一寡核苷酸共价偶联的载体,该寡核苷酸能够通过杂交与所述DNA中存在的特定序列形成三螺旋。
文档编号C12Q1/68GK1170438SQ9519681
公开日1998年1月14日 申请日期1995年11月8日 优先权日1994年12月16日
发明者J·克罗泽特, D·施尔曼, P·威尔斯 申请人:罗纳-布朗克罗莱尔股份有限公司