专利名称：从酵母菌中释放超氧化物岐化酶的方法
技术领域：
本发明是关于从微生物中释放胞内蛋白的方法，特别是从酵母菌有选择性地释放SOD的方法。
细胞破碎是胞内蛋白提取的第一步，其方法主要有机械破碎法(高压匀浆，超声波破碎等)，溶菌酶法及化学渗透法。机械破碎法(Schutte，Biotech.Forum，1986，2、68-80)已应用于工业生产中的细胞破碎，但由于其是整体破碎细胞，胞内所有蛋白和DNA都释放出来，从而使后续目标蛋白的纯化十分困难。超声波法已用于破碎芽孢杆菌，提取SOD(CN1058614A)，但它也是整体破碎细胞，而且超声波对人体有害，使该法无法大规模应用。溶菌酶法由于酶制剂成本太高，而无法工业化(Le Corre，S.，Ascnjo，J.A.；Enzyme Microb.Technol.，1985，7，73-77)。近年来化学渗透法发展较快，它不用整体破碎细胞，而采用某些化学渗透剂处理细胞，使胞内蛋白渗透出来(David Hettwer，Biotechnology and Bioengineering，1989，Vol.33，886-895)。但该法采用高浓度溶剂(7M盐酸胍)及昂贵的表面活性剂(Triton X-100)，使得蛋白质释放成本增高，而且目标蛋白的选择性也差，大量的杂蛋白也同时释放出来。传统的细胞破碎方法主要有下面三个缺点①需要复杂设备②成本高、操作复杂③选择性差本发明主要目的是克服传统方法的缺点，提供了一种成本低廉，选择性高的胞内蛋白释放方法。其特征是采用廉价的醇类有机溶剂浸泡酵母细胞，不用任何复杂设备，所用溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇等，浸泡温度10℃-50℃，浸泡浓度50％-90％。浸泡时间30分钟-150分钟。过滤除去溶剂，再用缓冲溶液(如磷酸钾缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液等)将SOD从酵母菌中有选择地抽提出来，所用缓冲液浓度20mM-100mM，抽提温度10℃-50℃，pH4.0-pH9.0，抽提时间为10小时-24小时，离心或过滤除去菌体，便可得到SOD上清液，本发明的主要优点①不需要任何复杂设备，只需一搅拌容器即可②成本低。所用醇类溶剂价廉，且可循环使用3次以上③选择性高，可纯化SOD20倍以上
1.实施例1在1克酵母湿菌体中加入乙醇(95％)到溶剂浓度80％(W/W)，静止浸泡90分钟，过滤除去溶剂，加入100mM磷酸钾缓冲溶液(pH6.8)，菌体(克)缓冲液体积(ml)＝1∶3。在室温下搅拌21小时，离心除去菌体，得到的上清液含有SOD280U/ml，比活240u/mg。
2.实施例2在1克酵母湿菌体中，加入异丙醇到溶剂浓度70％(W/W)，浸泡90分钟后，过滤除去有机溶剂，加入100mM磷酸缓冲溶液(pH6.8)，菌体(g)缓冲溶液体积(ml)＝1∶3，搅拌20小时，离心除去菌体，上清液含SOD300U/ml，比活250u/mg。
3.比较例(超声波法)1克酵母湿菌体中，加入3ml磷酸钾缓冲溶液(100mM，pH6.8)，在超声波匀浆机(250W)处理1小时，离心除去菌体碎片，得到溶液含SOD320u/ml，比活10u/mg本发明实施例和比较例结果如表1表1本发明实施例与比较例结果
由表1可知，本发明SOD释放率在85％以上，而SOD比活提高了20倍以上，从而达到了纯化SOD的目的。
权利要求
1.一种从细胞中释放胞内蛋白的方法，其特征是采用醇类溶剂处理细胞，除去溶剂后，用缓冲溶液将目标蛋白有选择性地抽提出来。
2.一种从酵母菌中有选择地释放SOD的方法，其特征是用醇类溶剂处理酵母菌，除去溶剂后，用缓冲溶液将SOD有选择性地抽提出来。
3.根据权利要求1、2所述的方法，所用浸泡醇类溶剂包括甲醇、乙醇、丙醇、异丙醇、丁醇等，溶剂浸泡浓度50％-90％，最佳范围为70％-90％。浸泡温度为10℃-50℃；浸泡时间为30分钟以上，最佳时间为70分钟-150分钟。
4.根据权利要求1、2所述的方法，离心或过滤除去醇类溶剂后。所用抽提缓冲溶液包括磷酸钾缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液等，缓冲液浓度20mM以上，pH4.0-pH9.0，浸泡温度为10℃-50℃，抽提时间在10小时以上，最佳时间为16-22小时
全文摘要
本发明涉及一种从细胞内释放蛋白的方法。特别涉及到一种从酵母菌中释放超氧化物岐化酶(SOD)的方法。其主要特征是用廉价的醇类有机溶剂(甲醇、乙醇、异丙醇、丁醇等)浸泡酵母细胞30分钟以上，过滤或离心除去菌体，然后用缓冲溶液(磷酸钾缓冲溶液，Tris-HCl等缓冲溶液等)，在搅拌下浸泡菌体，在一定温度(10℃-50℃)及pH4.0-pH9.0下，浸泡10小时以上，离心或过滤除去菌体，则可得到SOD释放液。这种方法不需要任何复杂设备，操作简单，而且使用廉价的醇类溶剂，并可循环多次使用。在释放SOD的同时，纯化SOD25倍以上，大大地简化了后续纯化工艺。这种方法还可用于其它胞内蛋白的释放，具有很高的实用价值。
文档编号C12N9/08GK1118004SQ9411549
公开日1996年3月6日 申请日期1994年9月2日 优先权日1994年9月2日
发明者谭天伟, 马润宇, 戚以政, 莫锡荣 申请人:北京化工大学