一种新型的耐高温α-淀粉酶及其制备方法和应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及一种新型的耐高温α-淀粉酶及其基因和制备方法，通过PCR定点突变野生型耐高温α-淀粉酶基因，并使其在枯草芽孢杆菌中高效表达。本发明的新型的耐高温α-淀粉酶在高温和酸性环境下稳定性高，能够更好的适应工业生产，以达到节能减耗，提高效率的作用。其技术方案是从地衣芽孢杆菌中分离野生型耐高温α-淀粉酶基因，对其His316的氨基酸残基进行突变，经在枯草芽孢杆菌中高效表达，在90℃和pH4.5的条件下，该新型的耐高温α-淀粉酶(His316→Arg)比野生型的耐高温α-淀粉酶稳定性均有提高。
【专利说明】一种新型的耐高温α-淀粉酶及其制备方法和应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于基因工程【技术领域】，涉及基因的定点突变和重组技术，尤其是一种新 型的耐高温α-淀粉酶及其制备方法和应用。
【背景技术】
[0002] 目前国内外生产耐高温α-淀粉酶所用菌株大多数是嗜热脂肪芽孢杆菌 (Bacillus stearothermophilus)和地衣芽抱杆菌（Bacillus licheninformis)，与其它细 菌所产α -淀粉酶相比具有更好的耐热性，而且地衣芽孢杆菌具有较高的生长温度、良好 的产物合成效率、优秀的蛋白质合成与分泌能力，因此被广泛的应用于工业生产。
[0003] Β. licheninformis所产的耐高温α -淀粉酶（BLA)由于良好的耐热性广泛地应 用于淀粉水解工艺中，但随着国内外淀粉原料深加工工业的高速发展，造成耐高温α -淀 粉酶的应用领域不断扩大，例如应用于淀粉加工、纺织物退浆、食品加工、啤酒和酒精生产、 医药行业、发酵行业以及石油开采工业等方面。其中开发稳定性高的α-淀粉酶成为目前 α-淀粉酶酶制剂研宄领域的一个重要方向。
[0004] 现阶段应用于淀粉液化过程中的耐高温α -淀粉酶的最适温度和pH -般在95°C 和6. 5左右，为了保持活力一般需要加入一定浓度的Ca2+，为了保证耐高温α -淀粉酶在淀 粉液化过程中发挥较高的活力，需将天然粉浆的原始PH由（3. 2-4. 5)调至（5. 8-6. 2)，在下 一步糖化过程中又要将糖化液的pH调至4. 2-4. 5,这两步pH调整过程中既增加了工艺的繁 琐度也降低了经济效益，所以在理想的工艺步骤中需要开发研制一种在高温和酸性环境下 活力稳定的耐高温α-淀粉酶。
【发明内容】
[0005] 本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种通过定向进化构建的在高温 和酸性环境下酶活力更稳定的高温α-淀粉酶突变体及其制备方法。
[0006] 本发明实现目的技术方案如下：
[0007] 一种新型的耐高温α -淀粉酶突变体，是通过对野生型耐高温α -淀粉酶进行定 向进化，通过重叠 PCR和定点突变，获得氨基酸序列如SEQ ID NO :7所示的耐高温α-淀粉 酶突变体，经宿主细胞枯草芽孢杆菌高效表达后获得新型的耐高温α-淀粉酶。
[0008] 所述耐高温α -淀粉酶突变体为：碱基C946 - Α、Α947 - G、Τ948 - G，氨基酸 His316 - Arg。（上述表示方法为：原始氨基酸/碱基位置一替换的氨基酸/碱基。）
[0009] 所述耐高温α -淀粉酶突变体的基因序列如SEQ ID NO :6所示。
[0010] 所述野生型耐高温α -淀粉酶的基因序列如SEQ ID NO :5所示。
[0011] 所述野生型耐高温α -淀粉酶来源是地衣芽孢杆菌Bacillus licheniformis。
[0012] 优选的，所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌B. subtilis WB600,该菌为6种胞外蛋 白酶缺失菌。
[0013] 所述耐高温α -淀粉酶突变体用于淀粉的水解，酶活力为3270U/mL。所述耐高温 α-淀粉酶突变体在90°C、pH6.0的半衰期比野生型提高了 93. 5%;在pH 4. 5、70°C的半衰 期比野生型提高了 41. 2%。
[0014] 所述新型的耐高温α -淀粉酶突变体的制备方法，包括如下步骤：
[0015] (1)定点突变野生型耐高温α -淀粉酶的成熟肽基因，第946位碱基C - A，第947 位碱基A - G，第948位碱基T - G，得到新型的耐高温α-淀粉酶基因；
[0016] (2)将上述新型的耐高温α -淀粉酶基因，与大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒PBAPR 载体相连，PBAPR带有一个嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶强启动子Papk、一个果聚糖蔗糖酶基因 信号肽序列sacB，得到携带新型的耐高温α -淀粉酶基因的重组表达质粒；
[0017] (3)将重组质粒转化入宿主菌株枯草芽孢杆菌Β. subtilis WB600中，得到重组菌 株；
[0018] (4)将重组菌株进行发酵，分泌表达制备新型的耐高温α -淀粉酶；
[0019] (5)分离提取新型的耐高温α -淀粉酶。
[0020] 本发明的优点和积极效果如下：
[0021] 本发明使用重叠 PCR技术，对野生型耐高温α-淀粉酶进行定点突变。利用大肠 杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭分泌表达型载体，转化枯草芽孢杆菌，得到一种在高温和酸性环 境下活力更稳定的高温α -淀粉酶（His316)，在90°C和pH 4. 5的条件下，该新型的耐高 温α -淀粉酶（His316 - Arg)比野生型的耐高温α -淀粉酶的半衰期分别高93. 5%和 41. 2%，稳定性明显提高。在高温和酸性条件下具有较高的酶活稳定性，可以降低能耗，符 合低碳环保理念，在食品、洗涤剂、化妆品、饲料等应用工业上有着普通α -淀粉酶无法取 代的优越性，具有明显的经济效益及社会效益。
【专利附图】
【附图说明】
[0022] 图1为本发明定点突变流程图；
[0023] 图2为本发明重组质粒pBAPR-amyM的构建示意图；
[0024] 图3为本发明定点突变基因电泳图（a :M为Ikb DNA ladder，1为片段IamyMl基 因，2为片段2amyM2基因；b:M为Ikb DNA ladder，l为片段1和片段2重叠后amyM基因）；
[0025] 图4为本发明重组子验证图（M为Ikb DNA ladder，1为重组质粒pBAPR-amyM的 BamHI和HindIII双酶切，2为原始质粒pBAPR的BamHI和HindIII双酶切）；
[0026] 图5为本发明SDS-PAGE分析新型的耐高温α -淀粉酶的表达（M为蛋白分子量标 准，1 为 pBAPR-amyM/WB600, 2 为 pBAPR/WB600);
[0027] 图6为本发明工程菌表达产物纯化的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析（M为蛋白分子量 标准，1为野生型耐高温α -淀粉酶，2为新型的耐高温α -淀粉酶）。
【具体实施方式】
[0028] 下面结合实施例对本发明的技术内容做进一步说明；下述实施例是说明性的，不 是限定性的，不能以下述实施例来限定本发明的保护范围。
[0029] 实施例1 :野生型耐高温α -淀粉酶基因的获得
[0030] (1)地衣芽孢杆菌基因组DNA的提取：
[0031] ①将菌体在37°C，200r/min培养18-24h，收集菌体。
[0032] ②加入500 μ L ddH20,重悬菌体，洗绦菌体，5000r/min离心5min，弃上清。
[0033] ③加入500 μ L ddH20,重悬菌体，并加入溶菌酶（15 μ g/mL)，37°C水浴消化lh。
[0034] ④加入10% SDS 50 μ L，蛋白酶K 30 μ L，60°C水浴消化2h。
[0035] ⑤加入10 %体积的5mol/L NaCl,上清转管加入等体积的酷：氯仿：异戊醇 (25 : 24 : 1)，反复颠倒离心管数次，12000r/min离心lOmin。
[0036] ⑥取上清，加入等体积的酚：氯仿：异戊醇（25 : 24 : 1)，反复颠倒离心管数次， 1200r/min 离心 lOmin。
[0037] ⑦取上清，加入等体积的氯仿，反复颠倒离心管数次，12000r/min离心lOmin。
[0038] ⑧重复上一步一次。
[0039] ⑨取上清，加入0· 6倍体积的异丙醇，-20°C放置20min后12000r/mim离心IOmin 弃上清，用〇. 5mL 70%的乙醇洗沉淀2次，晾干并加入80 μ L ddH20,溶解沉淀，-20°C保存。
[0040] (2)目的基因的获得
[0041] 参照地衣芽孢杆菌耐高温α -淀粉酶基因的序列，并结合所用的PUC19质粒上的 酶切位点，设计引物：
[0042] 上游引物 AMY-F(SEQ ID NO :1) :5，-CGcGGATCCGCAAATCTTAATGGGACGCT-Sr (下 划线部分为加入的BamHI酶切位点）；
[0043] 下游引物 AMY-R(SEQ ID NO :2):
[0044] 5' -CcCAAGCTTTCTTTGAACATAAATTGAAACC-Sr (下划线部分为加入的 HindIII 酶 切位点）。
[0045] 以地衣芽孢杆菌基因组DNA为模板，进行PCR，反应体系为：CldH2O 37 μ L， IOXbuffer 5 yL，dNTPs(5mmol/L)2 yL，引物 AMY-F (20 μ mol/L) 2 μ L，引物 AMY-R (20 μ mol/L) 2 μ L，DNA 模板 I μ L，Pyrobest 高保真 DNA 聚合酶 I μ L。扩增条件为： 95°C预变性5min ;95°C变性25s，56°C退火30s，72°C延伸I. 5min反应30个循环；72°C延伸 10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测在约I. 5kb处出现特异性条带。
[0046] 实施例2 :野生型耐高温α -淀粉酶基因的定点突变
[0047] (1)野生型耐高温α -淀粉酶基因连接入载体pUC19.
[0048] 将PCR扩增得到的目的基因进行纯化，用BamHI和HindIII双酶切，酶切产物再经 纯化后，琼脂糖凝胶电泳检测。同时也将质粒PUC19用BamHI和HindIII进行双酶切，纯化， 最后采用T 4DNA连接酶12°C连接8h，构建重组质粒pUC19-amy。利用电转化法将该重组质 粒转入大肠杆菌JM109中，双酶切和PCR验证结果表明amy基因已成功克隆到载体pUC19 上。
[0049] 将其测序可知扩增到野生型耐高温α -淀粉酶基因序列如SEQ ID NO :5。
[0050] (2)定点突变
[0051] 基于重叠 PCR技术进行定点突变，构建新型的耐高温α -淀粉酶。设计引物如下：
[0052] 上游引物 AMY-F(SEQ ID NO :1) :5，-CGcGGATCCGCAAATCTTAATGGGACGCT-Sr (下 划线部分为加入的BamHI酶切位点）；
[0053] 下游引物 AMY-R(SEQ ID NO :2):
[0054] 5' -CcCAAGCTTTCTTTGAACATAAATTGAAACC-Sr (下划线部分为加入的 HindIII 酶 切位点）。
[0055] 重叠引物 H316R-F(SEQ ID NO :3) :5，-GTTTCCAAGAGGCCGTTGAAAT-3'
[0056] 重叠引物 H316R-R(SEQ ID NO :4) :5，-ATTTCAACGGCCTCTTGGAAAC-3'
[0057] 在上游引物和下游引物5'端分别引入BamHI和HindIII酶切位点。重叠引物 H316R-F与重叠引物H316R-R互补。重叠引物H316R-F与重叠引物H316R-R中包含了对316 位氨基酸残基的突变His316 - Arg。
[0058] 用引物AMY-F、H316R-R扩增上游片段amyMl，AMY-R、H316R-F扩增下游片段amyM2。
[0059] PCR反应体系包括：10XPCR反应缓冲液5yL，dNTP 4yL，上游引物AMY-F、 H316R-F/下游引物 H316R-R、AMY-R各 I yL，重组质粒 pUC19-amy 10ng，Pfu DNA 聚合酶 5U， 无菌去离子水补充至50 μ L。
[0060] PCR扩增条件为：94 °C预变性5min ;94 °C变性30s，55 °C退火30s，72 °C延伸 I. 5min，共 30 个循环；72°C延伸 lOmin。
[0061] PCR产物切胶回收，适当稀释。以amyMl、amyM2为引物，进行PCR。PCR反应体系 为：10 X PCR 反应缓冲液 5 μ L，dNTP 4 μ L，amyMl、amyM2 各 1 μ L，Pfu DNA 聚合酶 5U，无菌 去离子水补充至48yL。PCR扩增条件为：94°C预变性5min ;94°C变性45s，55°C退火30s， 72°C延伸I. 5min，3个循环；然后加入引物AMY-F、AMY-R各I yL，进行PCR，PCR扩增条件同 刖。
[0062] 对PCR反应液进行1 %琼脂糖凝胶电泳，切胶回收目的DNA片段amyM。得到 His316 - Arg的耐高温淀粉酶的突变基因（新型的耐高温α -淀粉酶基因）。
[0063] 将其测序可知扩增到新型耐高温α -淀粉酶基因序列如SEQ ID NO :6。
[0064] 实施例3 :新型的耐高温α -淀粉酶表达载体的构建
[0065] pBAPR为以大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭克隆载体ρΒΕ2为骨架，克隆入一个嗜碱 芽孢杆菌碱性蛋白酶强启动子Papk及能够使重组蛋白直接分泌到培养基中的果聚糖蔗糖酶 信号序列sacB而获得。它同时含有枯草杆菌质粒pUBllO的复制子和大肠杆菌质粒pGEM3 的复制子，既能在大肠杆菌又能在枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌细胞中进行自主复制。它带 有AmplP Kmlr基因，可以在大肠杆菌中利用氨苄青霉素抗性作为筛选标记，同时又可以在枯 草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌中利用卡那霉素抗性作为筛选标记。
[0066] 将经重叠 PCR构建获得的新型的耐高温α -淀粉酶基因 amyM与pBAPR分别用 BamHI、HindIII双酶切，经纯化后在16°C连接12h，构建重组质粒pBAPR-amyM。将IOyL 的pBAPR-amyM电转化40 μ L大肠杆菌JM109感受态细胞，涂布在含氨苄青霉素（100 μ g/ mL)的LA平板上，挑选阳性转化子，提取质粒进行酶切验证，确定构建获得重组菌株JM109/ pBAPR-amyM〇
[0067] 实施例4 :含有新型的耐高温α -淀粉酶基因工程菌的构建和筛选。
[0068] 按下述方法制备枯草芽孢杆菌WB600 (实验室保存）的感受态细胞。挑取一环孢 子接种于少量生长培养基（LB+0. 5mol/L山梨醇）中，过夜培养。将种子以1/16的接种量 接种于生长培养基（LB+0. 5mol/L山梨醇）中，37°C摇床震荡培养至006。。在0· 85-0. 95左 右。冰水浴冷却培养物10min，于4°C，5000r/min，离心5min收集菌体。反复用冰冷的电击 缓冲液（〇· 5mol/L山梨醇，0· 5mol/L甘露醇，10% (V/V)甘油）洗涤细胞收集物4次。用原 培养液1/40体积的电击缓冲液重新悬浮细胞收集物，细胞浓度应该在1-1. 3 X 101(lCfu/mL。 感受态细胞分装为60 μ L/EP管保存在-80°C (不需要液氮预冻），在转化效率有所下降之 前都可以正常使用。转化条件：60 μ L感受态细胞加入1 μ L (50ng/μ L) pBAPR-amyM混匀并 转移到冰冷的电转化杯（Imm)中，冰浴1-1. 5min后，电击一次（25 μ F，200 Ω，4. 5-5. 0ms)。 电击完毕之后，立即加入ImL复苏培养基（LB+0. 5mol/L山梨醇+0· 38mol/L甘露醇）。37°C 摇床震荡培养3h之后，将复苏物涂布在LB平板上，37 °C培养24-36h，挑取阳性转化子，获得 枯草芽抱杆菌重组菌株WB600/pBAPR_amyM。
[0069] 实施例5 :枯草芽孢杆菌重组菌株中新型的耐高温α -淀粉酶的表达及分离纯化
[0070] 将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBAPR-amyM接种于LB液体培养基（含卡那霉 素，30 μ g/mL)中，37 °C，200r/min培养过夜，按1 %接种量转接于50mL新鲜培养基中，200r/ min培养24h，由于表达载体pBAPR为枯草芽孢杆菌组成型表达载体，不需额外加诱导剂诱 导，培养24h后，即可制备获得新型的耐高温α-淀粉酶（H316R)粗酶液。直接取样进行 SDS-PAGE及活性检测。
[0071] 纯化新型的耐高温α-淀粉酶的步骤如下：采用分级盐析法，先以30%饱和度 的硫酸铵盐析除去杂蛋白，再把饱和度加大到70 %，沉淀α-淀粉酶，收集30 % -70% 范围内蛋白质沉淀部分，溶解后，透析除盐。然后使用弱阴离子交换剂DEAE-Sephar〇 s e Fast Flow对硫酸铵盐析得到的活性组分进行分离（2mL上样量，上样后用0.02mol/L Tris-HCl (pH 7. 0)洗脱未吸附的蛋白，3mL/管分部收集，第51管开始梯度洗脱，缓冲液为 0-1. Omol/L NaCl 的 0· 02mol/L Tris-HCl (ρΗ7· 0)，流速 I. 5mL/min，3mL/ 管分步收集），经 DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换后获得的活性组分再用Sephadex G-75凝胶过滤（2mL 上样量，上样后用含 〇· 15mol/L NaCl 的 0· 02mol/LTris-HCl (pH 7. 0)洗脱，流速 0· 5mL/ min，2mL/管分部收集），制备获得电泳纯的新型的耐高温α -淀粉酶（H316R)。
[0072] 实施例6 :新型的耐高温α -淀粉酶的纯化分析。
[0073] 收集经过纯化的α -淀粉酶液，浓缩后，经过SDS-PAGE检测，分离得到的组分呈单 一条带，其分子量为53KDa。
[0074] 产品性能测定：
[0075] 1、α -淀粉酶活力的测定
[0076] 采用QB/T2306-97方法进行检测，将枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBAPR-amyM发 酵液，12000r/min离心IOmin去除细胞，测定上清液中的酶活（记为细胞外酶活）。酶活力 单位定义：在7〇°C、pH6. 0条件下，Imin液化Img可溶性淀粉成为糊精所需要的酶量，即为1 个酶活力单位，以U/mL(U/g)表示。测定方法如下：1.酶液制备：用缓冲液配制成酶溶液， 使其最终酶浓度控制在65U/mL-70U/mL范围之内。2.测定：（1)吸取可溶性淀粉溶液（20g/ L)20mL和磷酸缓冲液（相应pH)5mL于试管中。在70°C恒温水浴中预热3min-5min。（2) 加入稀释好的待测酶液I. 〇〇mL，立即计时，摇匀，准确反应5min。（3)立即吸取I. OOmL反应 液移入预先装有〇.lmol/L HCl 0.5mL和5mL稀碘液的试管中摇匀。（4)以0.1mol/L HCl 0. 5mL和5mL稀碘液的混合液作空白，于660nm波长下，用IOmm比色皿迅速测定吸光度（A)。 根据吸光度查表，求得测试酶液的浓度（C)。3.计算：X = CXNX 16. 67式中：X-样品的酶 活力"1^卬/^);(：-测试的酶液浓度"1^#-样品的稀释倍数；16.67-换算常数。所得结 果表示至整数。
[0077] 在此条件下进行α -淀粉酶活力检测，枯草芽孢杆菌重组菌株WB600/pBAPR_amyM 发酵液中制备获得的新型的耐高温α -淀粉酶的活力为3270U/mL。
[0078] 2、新型的耐高温α -淀粉酶性质的研宄
[0079] 经硫酸按盐析、DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换层析、Sephadex G-75凝胶层 析分离纯化后，得到电泳纯的新型的耐高温α-淀粉酶（H316R)，以野生型耐高温α-淀粉 酶（AMY)为对照，对其进行酶学性质研宄。
[0080] ⑴温度对酶活力的影响
[0081] 最适反应温度的测定：在不同温度（60°C、70°C、80°C、90°C、100°C)，ρΗ6.0的条件 下测定重组酶纯化酶液的酶活，AMY和H316R最适作用温度为90°C。
[0082] 热稳定性的测定：在90°C、pH 6. 0条件下测定重组酶的半衰期，AMY在90°C、pH6. 0 的半衰期为3. lmin，H316R的半衰期为6. Omin，比AMY的半衰期提高了 93. 5%。
[0083] ⑵pH对酶活力的影响酶
[0084] 最适反应 pH 的测定：在不同 pH 值（3·0、3·5、4·0、4·5、5·0、5·5、6·0、6·5、7·0)， 70°C下测定重组酶纯化酶液的酶活，AMY的最适作用pH为6. 5，H316R的最适作用pH为6.0。
[0085] pH稳定性的测定：在pH4. 5、70°C测定重组酶的半衰期，AMY在pH4. 5、70°C下的半 衰期为I. 7min，H316R在pH4. 5、70°C下的半衰期为2. 4min，比AMY的半衰期提高了 41. 2%。
[0086] 重组酶性质的分析：
[0087] 通过研宄可知，新型的耐高温α -淀粉酶和耐高温α -淀粉酶最适作用温度均为 90°C ;于90°C、pH6. 0下，新型的耐高温α -淀粉酶比耐高温α -淀粉酶的半衰期提高了 93. 5%，说明突变位点提高了突变酶的耐高温性能。新型的耐高温α-淀粉酶最适作用pH 为6. 0,耐高温α -淀粉酶最适作用pH为6. 5 ;于70°C、pH4. 5下，新型的耐高温α -淀粉酶 比耐高温α -淀粉酶的半衰期提高了 41. 2%，说明突变位点提高了突变酶的耐酸性能。
[0088] 由此说明，耐高温α -淀粉酶由原316位的L-组氨酸变为L-精氨酸（CAT - AGG) 后，可提高耐高温α -淀粉酶在高温和酸性环境中的稳定性，说明耐高温α -淀粉酶基因经 定点突变后，构建获得新型的耐高温α -淀粉酶基因，经克隆到大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭表 达分泌表达型载体pBAPR，转化6种胞外蛋白酶缺失的枯草芽孢杆菌WB600,实现新型的耐 高温α-淀粉酶分泌表达，成功制备获得一种新型的耐高温α-淀粉酶。
【权利要求】
1. 一种耐高温a-淀粉酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO :7所示。
2. 如权利要求1所述的一种耐高温a -淀粉酶突变体，其特征在于，其基因序列如SEQ ID NO :6 所示。
3. 权利要求1所述耐高温a-淀粉酶突变体的用途，其特征在于，所述耐高温a-淀粉 酶突变体在90°C、pH6. 0的半衰期比野生型提高了 93. 5% ;或者所述耐高温a -淀粉酶突 变体在pH 4. 5、70°C的半衰期比野生型提高了 41.2%。
4. 一种包含权利要求1所述的耐高温a -淀粉酶突变体的克隆载体、表达载体或宿主 细胞。
5. 如权利要求4所述的克隆载体、表达载体或宿主细胞，其特征在于，所述的克隆载体 为PUC19,所述的表达载体为pBAPR，所述的宿主细胞为枯草芽孢杆菌WB600。
6. 权利要求1所述的耐高温a -淀粉酶突变体的制备方法，其特征在于，包括以下步 骤： (1) 定点突变野生型耐高温a -淀粉酶的成熟肽基因，第946位碱基C突变为A，第947 位碱基A突变为G，第948位碱基T突变为G，得到新型的耐高温a -淀粉酶基因； (2) 将上述新型的耐高温a -淀粉酶基因，与大肠杆菌-芽孢杆菌穿梭质粒pBAPR载体 相连，pBAPR带有一个嗜碱芽孢杆菌碱性蛋白酶强启动子PAPR、一个果聚糖蔗糖酶基因信 号肽序列sacB，得到携带新型的耐高温a -淀粉酶基因的重组表达质粒； (3) 将重组质粒转化入宿主菌株枯草芽孢杆菌WB600中，得到重组菌株； (4) 将重组菌株进行发酵，分泌表达制备新型的耐高温a -淀粉酶； (5) 分离提取新型的耐高温a-淀粉酶。
【文档编号】C12N15/75GK104480087SQ201510004498
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2015年1月6日 优先权日:2015年1月6日
【发明者】刘逸寒, 王正祥, 路福平, 王春霞, 王建玲 申请人:天津科技大学