鉴别曼地亚红豆杉幼苗的核苷酸序列、分子探针和方法

鉴别曼地亚红豆杉幼苗的核苷酸序列、分子探针和方法
【专利摘要】本发明涉及一种鉴别曼地亚红豆杉幼苗的核苷酸序列、分子探针和方法。本发明鉴别曼地亚红豆杉的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。用于鉴别曼地亚红豆杉的核苷酸分子探针上游MHSF：如SEQ ID NO.2所示；下游MHSR：如SEQ ID NO.3所示。利用核苷酸分子探针MHSF/MHSR，通过常规PCR方法来鉴别曼地亚红豆杉。本发明样品用量少，仅需少量样品就可以完成整个操作；准确、灵敏度高，MHSF/MHSR为曼地亚红豆杉专一性分子探针，若为南方红豆杉或东北红豆杉种类，则为阴性反应；方法简单，采用PCR技术进行检测，时间短，半日即可完成。
【专利说明】鉴别曼地亚红豆杉幼苗的核苷酸序列、分子探针和方法

【技术领域】
[0001]本发明属于利用分子生物学方法鉴别曼地亚红豆杉幼苗的【技术领域】，涉及一种鉴别曼地亚红豆杉的核苷酸序列、分子探针和方法。

【背景技术】
[0002]曼地亚红豆杉(Taxus madia)是红豆杉科(Taxaceae)红豆杉属(Taxus Linii)的植物，在我国主要分布于西南、东北、华中、华南等地区。四川、陕西、江苏、浙江等地比较多。曼地亚红豆杉T.?at/ia是东北红豆杉T.ciAspit/aia和欧洲红豆杉T.Aaccaia的天然杂交种，富含紫杉烷二萜类化合物，其中紫杉醇经过临床试验证明是一种良好的抗癌新药，它对卵巢癌、乳腺癌、肺癌及胃肠癌等有显著功效。曼地亚红豆杉是第四纪冰川时期孑遗植物，是世界珍稀濒?危物种。曼地亚红豆杉T.?at/ia、南方红豆杉T.及东北红豆杉T.在幼苗期间的茎和叶型非常相似，从形态学上很难将曼地亚红豆杉与南方红豆杉及东北红豆杉幼苗轻易鉴别开。并且形状特征易受生境、气候、生理状况等的影响而常常导致主观辨别上的偏差，仅靠形态差异难以准确鉴定。因而，在过去的很多年里，将南方红豆杉或东北红豆杉种苗误认为曼地亚红豆杉种苗进行种植的情况时有发生，给农业生产带来了不小的经济损失。因此，利用分子生物学手段，建立快速、准确鉴别曼地亚红豆杉的方法是十分必要的。
[0003]目标起始密码子多态(startcodon targeted Polymorphism, SCoT)标记是一种基于翻译起始位点的目的基因标记新技术，根据ATG翻译起始位点侧翼保守序列来设计引物，扩增候选功能基因区域进而产生显性多态性标记，具有操作简便、重复性高等特点。本发明利用SCoT分子标记对曼地亚红豆杉、南方红豆杉及东北红豆杉幼苗植物进行分子鉴另O，从中筛选出了曼地亚红豆杉的特异性序列片段，通过克隆、测序等，设计开发了用于鉴定曼地亚红豆杉的特异性探针，对有效的鉴别和保护曼地亚红豆杉种质资源具有非常重要的意义。


【发明内容】

[0004]本发明的第一个目的是提供了一种利用分子生物学手段，获得鉴别曼地亚红豆杉的核苷酸序列。
[0005]本发明用于鉴别曼地亚红豆杉的特征性核苷酸序列来源于SCoT通用引物3(5’ -CAACAATGGCTACCACCG-3’)扩增所得的曼地亚红豆杉特异性核苷酸序列，具体序列为:
CAACAATGGCTACCACCGGAGGAAGAATGCCGCTATAGGGGAGGCCAAACTACTGTGGAACTCTGTCAAAG
GGGTGTATCTCCAACTTCCCTGCCATGTCTATCAACTGGCTCTGACATCCAATTAGTGTAACAATCTCCTCTCCCC
ATACCCCTGTCATGGCCTGATAAGGGGTGGCCTCCATGTTTGCAGTTGTCAGAGAAGCCATTGGTTGGTGGGGTGCT
CTAAGAACTGTCATCCCCATCCACCTTCCTTCCCTGACTGCCCCGGGGTCCTCCACCTCTACGCCTCTCCCATATGG
GATAATGTGCTCATACACCCAACTCATGACAAGAGTCGGGTGGCTCAGTGACTGCCCCTGTAAACGGATTACCCTGT
ATAAGTCATGGTAGGTAGTCCCGAGGACATCTGCTCCCCAAGCATAGACACGTCCATGTTGCAAGGATTGGGTACATAAGGAAAGCGCTGAAGTCGGGTTTTATTTGAAAACACCGCATTTAAAAATTTTCGTACGGTGGTAGCCATTGTTG,如 SEQ ID N0.1 所示。
[0006]本发明的第二个目的是提供基于上述鉴别曼地亚红豆杉的核苷酸序列(SEQ IDN0.1)设计的用于鉴别曼地亚红豆杉的核苷酸分子探针(MHSF/MHSR)，该核酸分子探针序列如下:
上游引物 MHSF:5，- TATCTCCAACTTCCCTGCCA-3’，如 SEQ ID N0.2 所示；
下游引物 MHSR:5’ - GCGCTTTCCTTATGTACCCA-3，，如 SEQ ID N0.3 所示。
[0007]上述核苷酸分子探针(MHSF/MHSR)，具有极高的专一性，仅与曼地亚红豆杉基因组DNA发生反应，而不与南方红豆杉及东北红豆杉模板DNA反应。利用该探针通过常规PCR扩增可以快速准确的对曼地亚红豆杉幼苗进行鉴别。
[0008]本发明的第三个目的是提供一种鉴别曼地亚红豆杉的方法。
[0009]本发明采用上述核酸分子探针(MHSF/MHSR)作为特异性扩增引物，以曼地亚红豆杉基因组DNA为模板，经过PCR扩增，电泳检测，可以获得清晰的曼地亚红豆杉特征性条带，实现对曼地亚红豆杉的鉴别。
[0010]本发明只需少量样品就可以完成整个操作；准确、灵敏度高，MHSF/MHSR为曼地亚红豆杉专一性分子探针，若为其他红豆杉种类，为阴性反应；方法简单，采用PCR技术进行检测，时间较短，半日就可以完成。

【专利附图】

【附图说明】
[0011]图1是本发明所述的曼地亚红豆杉的特征性核苷酸序列及曼地亚红豆杉专一性核酸分子探针MHSF和MHSR的位置图，左侧为5’端，右侧为3’端，其中黑色部分为专一性核苷酸分子探针MHSF和MHSR扩增的序列片段大小及位置；
图2是采用SCoT引物3按照常规PCR方法对三种红豆杉材料进行PCR反应后的电泳图(箭头所指的条带是曼地亚红豆杉特有的条带，分子量为530 bp)，其中通道I?4:曼地亚红豆杉T.?8:南方红豆杉T.?12:东北红豆杉T.cuspidata-,
C:阴性对照；M为DNA分子量标准marker DL2000 ；
图3是利用本发明的核酸分子探针MHSF/MHSR对三种红豆杉样品进行检测的PCR产物电泳图，其中通道I?4:曼地亚红豆杉T.madia.,^?8:南方红豆杉T.chinensis-,9?12:东北红豆杉T.cuspidata.,C:阴性对照；M为DNA分子量标准marker DL2000。

【具体实施方式】
[0012]本发明可以从分子水平上较为客观准确的鉴别曼地亚红豆杉，通过以下实施例对本发明做进一步说明:
实施例1:曼地亚红豆杉特征性核苷酸序列的制备
1.基因组DNA的提取
剪取红豆杉幼苗新鲜叶片200 mg放入研钵中，立即加入液氮研磨至粉末，然后使用上海生工生物工程有限公司的UNIQ-10柱式植物基因组DNA抽提试剂盒提取红豆杉植物基因组DNA，用1%琼脂糖胶对所得DNA进行电泳检测，并用紫外分光光度计检测DNA浓度，稀释至 50ng/μ I。
[0013]2.SCoT - PCR反应，电泳检测
利用SCoT通用引物3 (5 ’ -CAACAATGGCTACCACCG-3 ’ )进行PCR扩增，引物由上海生工生物工程有限公司合成，反应体系为:2 μ I 10XBuffer,2y I MgCl2 (25mM), 0.8 μ I dNTPs(1mM), I μ I SCoT 引物 3 (10 μ Μ)，I μ I 模板 DNA (50ng/μ I)，0.4 μ I Taq 酶(2υ/μ1)，12.8 μ I ddH20。总体积为 20 μ I。
[0014]PCR反应程序为:94°C预变性5 min ；35个循环(94°C变性50 s，51°C退火50 s,72°C延伸I.5 min);最后于72°C下延伸10 min。
[0015]PCR产物电泳结果见图2，箭头标的条带(分子量为530 bp，通道I?4)，是采用SCoT引物3进行PCR扩增时筛选出的曼地亚红豆杉特征性条带。如图2 (图中，通道I?12为来自3种不同红豆杉物种的样品，具体见【专利附图】

【附图说明】；通道M为DNA分子量标准markerDL2000)所示，仅曼地亚红豆杉(通道I?4)在分子量530 bp位置有条带出现，而其他红豆杉种类在分子量530 bp位置没有条带出现。因此，此条带为曼地亚红豆杉的特有条带。
[0016]3.序列测定
利用SCoT通用引物3进行PCR扩增结束后，PCR产物用1.5 %琼脂糖凝胶电泳，对只在曼地亚红豆杉中出现的特异SCoT片段(图2中箭头所指片段)进行切胶，采用PCR产物纯化试剂盒(上海生工)回收纯化所切片段。然后将所纯化的DNA片段连接到TOCm-T载体(上海生工)上，转化到大肠杆菌感受态细胞中，然后送生物公司测序(上海生工)，得到如SEQID N0.1所示的核苷酸组成和排列。
[0017]实施例2:曼地亚红豆杉特异性核苷酸分子探针MHSF/MHSR的制备，PCR扩增，电泳检测
在获得曼地亚红豆杉特异性核苷酸序列的基础上，利用Primer Primer 5.0软件设计得出MHSF/MHSR的核苷酸序列(分别为SEQ ID N0.2、SEQ ID N0.3所示的)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。然后利用设计合成的引物MHSF/MHSR，对不同红豆杉样品(具体见【专利附图】

【附图说明】)进行扩增检测。
[0018]PCR 反应体系为 2μ I 10 X Buffer, 2 μ I MgCl2 (25mM) ,0.8μ I dNTPs (1mM),1μ I 弓丨物 MHSF (10μΜ)，1μ I 引物 MHSR (10 μ Μ)，I μ I 模板 DNA (50ng/μ I)，0.4 μ I Taq酶(2U/ μ I)，11.8 μ I ddH20。总体积为 20 μ L.
[0019]PCR反应程序为94°C预变性5 min ;35个循环(94°C变性50 s，58°C退火50 s，72°C延伸1.5 min);最后于72°C下延伸10 min。
[0020]用1.5 %琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果，电泳图如图3所示，从图3 (图中，通道I?12为来自3种不同红豆杉物种的样品，具体见【专利附图】

【附图说明】；通道M为DNA分子量标准marker DL2000)可以看出，仅曼地亚红豆杉(通道I?4)能扩增出特异性片段,而其他红豆杉种类没有扩增出任何条带，这表明本发明的核酸分子探针具有极高的专一性，因此可以用于快速的鉴别曼地亚红豆杉。将曼地亚红豆杉的特异性片段送去测序，其序列如SEQ IDN0.1的77?466位碱基所示，其长度为390 bp，具体序列信息见图1。
【权利要求】
1.一种鉴别曼地亚红豆杉的核苷酸序列，其特征在于该核苷酸序列为: CAACAATGGCTACCACCGGAGGAAGAATGCCGCTATAGGGGAGGCCAAACTACTGTGGAACTCTGTCAAAGGGGTGTATCTCCAACTTCCCTGCCATGTCTATCAACTGGCTCTGACATCCAATTAGTGTAACAATCTCCTCTCCCCATACCCCTGTCATGGCCTGATAAGGGGTGGCCTCCATGTTTGCAGTTGTCAGAGAAGCCATTGGTTGGTGGGGTGCTCTAAGAACTGTCATCCCCATCCACCTTCCTTCCCTGACTGCCCCGGGGTCCTCCACCTCTACGCCTCTCCCATATGGGATAATGTGCTCATACACCCAACTCATGACAAGAGTCGGGTGGCTCAGTGACTGCCCCTGTAAACGGATTACCCTGTATAAGTCATGGTAGGTAGTCCCGAGGACATCTGCTCCCCAAGCATAGACACGTCCATGTTGCAAGGATTGGGTACATAAGGAAAGCGCTGAAGTCGGGTTTTATTTGAAAACACCGCATTTAAAAATTTTCGTACGGTGGTAGCCATTGTTG,如 SEQ ID N0.1 所示。
2.基于如权利要求1所述的一种鉴别曼地亚红豆杉的核苷酸序列设计的核苷酸分子探针MHSF/MHSR，其特征在于该核酸分子探针序列如下: 上游引物 MHSF:5，- TATCTCCAACTTCCCTGCCA-3’，如 SEQ ID N0.2 所示；
下游引物 MHSR:5’ - GCGCTTTCCTTATGTACCCA-3，，如 SEQ ID N0.3 所示。
3.一种鉴别曼地亚红豆杉的方法，其特征在于采用权利要求2所述的核苷酸分子探针MHSF/MHSR作为PCR引物，利用PCR方法鉴定曼地亚红豆杉，具体步骤按常规PCR方法进行。
【文档编号】C12Q1/68GK104480210SQ201410808201
【公开日】2015年4月1日 申请日期:2014年12月22日 优先权日:2014年12月22日
【发明者】沈晨佳, 冯尚国, 王慧中 申请人:杭州师范大学