一种从水体中高效浓缩病毒的方法

一种从水体中高效浓缩病毒的方法
【专利摘要】本发明公开了一种从水体中高效浓缩病毒的方法。它是将待测水样去除杂质不溶物后，在其中加入足量的Mg2+和PO43+，以形成絮凝物沉淀待测水样中的病毒，然后再经负压抽滤过混合纤维滤膜，取下滤膜，用pH值3.5～4.5的溶液冲洗并溶解滤膜上的凝固物，得到洗涤液，洗涤液再经超滤浓缩，得到病毒浓缩液。本发明的方法除了能高浓缩效率的特点外，还有如下优点：一是快速：絮凝快，洗脱也快；二是比较简便：目前正电荷膜全部依靠进口，材料不易获得，应用本发明的方法，使用任何一种普通的微孔滤膜均可；三是可用于现场快速浓缩病毒：在现场采样时，不需要采取大量水样回到实验室进行检测，只需待水样絮凝静止沉降后，即可获得小体积的初步浓缩样品。
【专利说明】一种从水体中高效浓缩病毒的方法

【技术领域】：
[0001] 本发明属于病毒浓缩领域，具体涉及一种从水体中高效浓缩病毒的方法。

【背景技术】：
[0002] 病毒感染性疾病的传播途径多种多样，但在许多病毒性疾病发生和流行过程中， 水是病毒传播的一种重要媒介。许多病毒可以长期存活于水或污水中，并随水流动四处传 播。水或污水中的病毒可以通过污染饮用水或食物而被人体摄入、或通过接触粘膜或伤口 进入人体、也可以借助气溶胶被人体吸入导致感染。近年来，全球范围内由病毒污染水源引 起疾病暴发事件不断发生。据报道，排入环境水体中的病毒多于140种，它们对消毒剂耐受 力强、存活时间长、感染剂量低，易于穿透污水及供水处理屏障，进入各种环境水体甚至饮 用水系统，威胁人体健康和自然生态系统。近年来，经由地表水和饮用水传播病毒各类疾病 的报道很多，水源性传播病毒成为一个严重的公共安全问题。
[0003] 由于环境水体中可能存在的病毒量少，因而必须通过浓缩数升至数千升的水样至 数毫升，提高其中病毒的浓度后再加以检测。但水样中的杂质也一同被浓集，并将干扰后续 的检测结果，如浓缩液中的有毒物质可毒害细胞使之死亡而无法感染病毒，其中的腐殖酸 等有机物质可干扰PCR使模板无法扩增，因而使检测出现假阴性或假阳性结果。因此，采用 有效的前处理方法，浓集病毒并去除干扰杂质是水中病毒检测的关键。
[0004] 水中病毒的浓缩与细菌不同。细菌的浓缩可完全依靠机械阻留于膜上，而病毒因 颗粒直径很小。一般多基于吸附、相分离、强离心沉淀、电泳及免疫化学等作用。已有报告 的方法有二类：（1)吸附洗脱法。包括膜吸附法、可沉淀的盐类、氧化铁，聚电电解质吸附方 法、氢氧化铝和植物絮凝吸附法和玻璃粉吸附法、相分离法等。（2)以病毒物理学特征为基 础的方法，如超速离心法、反渗透法、电渗析法和脱水透析法等。在上述方法中一般认为超 速离心及电渗析法等不仅需要一定的设备条件，而且检水量有限，作为辅助手段用于病毒 再浓缩是可行的，但在大量水中病毒的浓缩检验中未能广泛应用。聚合物两相分离法适用 于定量检验或分离小量浑浊水中的病毒。膜吸附法因操作简单，可检验相当大量的水样，而 且随着滤材研宄的发展，效能不断提高，研宄与应用比较广泛。目前水病毒的浓缩主要采用 吸附洗脱法，如阳电膜过滤法，氯化铝沉淀法等，这些方法的回收率都不太高，前者在60 % 左右，后者〈50%。此外，两种方法在洗脱时均需要耗费较长的时间，而且正电荷滤膜需要进 口，材料不易获得。特别是在用分子方法进行后续检测时，还存在有机洗脱液可能会分子反 应过程产生抑制作用的现象。


【发明内容】
：
[0005] 本发明的目的是提供一种成本低廉，能够简便高效浓缩病毒的从水体中高效浓缩 病毒的方法。
[0006] 本发明的从水体中高效浓缩病毒的方法，其特征在于，将待测水样去除杂质不溶 物后，在其中加入足量的Mg 2+和PO 43+，以形成絮凝物沉淀待测水样中的病毒，然后再经负压 抽滤过混合纤维滤膜，取下滤膜，用pH值3. 5?4. 5的溶液冲洗并溶解滤膜上的凝固物，得 到洗涤液，洗涤液再经超滤浓缩，得到病毒浓缩液。
[0007] 所述的将待测水样去除杂质不溶物，其可以为离心，优选步骤为：待检测水样在 3000r/min转速下离心，取上清。
[0008] 优选，所述的Mg2+和PO 43+的加入量相同，其终浓度为0. 002?0. Olmol/L，所述的 pH值3. 5?4. 5的溶液优选为pH值4. 0的溶液。
[0009] 所述的加入Mg2+和PO 43+，优选是分别以lmol/L MgCljP lmol/L Na 2即04的形式加 入，Mg2+和PO 43+的终浓度都为0. 002mol/L，所述的pH值4. 0的溶液优选为pH值4. 0的柠 檬酸缓冲液。
[0010] 利用本发明的方法能有效地浓缩病毒，其中以f2噬菌体为例，其平均回收率分别 达到88. 64%，而用正电荷滤膜法的回收率分别只有58. 74%，因此本专利的方法显著高于 通常所用的正电荷滤膜法，也高于目前国内外的报道。与其它方法相比，本发明的方法除了 能高浓缩效率的特点外，还有如下优点：一是快速：絮凝快，洗脱也快；二是比较简便：目前 正电荷膜全部依靠进口，材料不易获得，应用本发明的方法，使用任何一种普通的微孔滤膜 均可；三是可用于现场快速浓缩病毒：在现场采样时，不需要采取大量水样回到实验室进 行检测，只需待水样絮凝静止沉降后，即可获得小体积的初步浓缩样品。

【专利附图】

【附图说明】：
[0011] 图1是经本发明的方法浓缩处理后的诺如病毒检测结果，M :DNA marker，N :阴 性对照，1 :未经浓缩处理的阳性对照，2: KT2稀释度IOOul样品，3: KT2稀释度50ul样品， 4:10_3稀释度IOOul样品，5 :10_3稀释度50ul样品，6:10 _4稀释度IOOul样品，7:10 _4稀释 度50ul样品，8-9: KT5稀释度各IOOul和50ul样品；
[0012] 图2是经正电荷滤膜法浓缩处理后的诺如病毒检测结果，M :DNA marker，N :阴性 对照，I: KT1稀释度IOOul样品；2:10 _2稀释度IOOul样品，3:10 _2稀释度50ul样品，4:10 _3 稀释度IOOul样品，5 :10_3稀释度50ul样品，6:10 _4稀释度IOOul样品；
[0013] 图3是经本发明的方法浓缩处理后的轮状病毒检测结果，M :DNA marker，N :阴性 对照，I: KT2稀释度IOOul样品，2:10 _3稀释度IOOul样品，3:10 _3稀释度50ul样品，4:10 _4 稀释度IOOul样品，5 :10_4稀释度50ul样品，6:10 _5稀释度IOOul样品；
[0014] 图4是经正电荷滤膜法浓缩处理后的轮状病毒检测结果，M :DNA marker，N :阴性 对照，I: KT2稀释度IOOul样品，2:10 _3稀释度IOOul样品，3:10 _3稀释度50ul样品，4:10 _4 稀释度IOOul样品，5 :10_4稀释度50ul样品。

【具体实施方式】：
[0015] 以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
[0016] 实施例1 :
[0017] 1材料和方法
[0018] I. 1实验材料
[0019] f2噬菌体和大肠杆菌（Escherichia coli)285J2噬菌体原液的效价约为IO9Pfu/ HlLo
[0020] I. 2镁离子絮凝法
[0021] L 2.1样品制备
[0022] 取f2噬菌体原液用无菌蒸馏水按体积比1:10梯度稀释至10_4,取ImL稀释液添 加到IL灭菌的纯净水中（作为待检测水样），取样测定f2噬斑数，作为浓缩前的样品f2噬 斑数。
[0023] L 2. 2f2噬菌体浓缩
[0024] 待检水样在3000r/min转速下离心lOmin，取上清。① IL上清水样中加入2mL MgCl2溶液（lmol/L)，再加入2mL Na2HPO4溶液（lmol/L)，充分搅拌均匀；②负压抽滤，过普 通混合纤维滤膜（孔径〇· 45 μπι，直径50mm);③取下滤膜，用约4mL 0· 3mol/L ρΗ4· 5的梓 檬酸缓冲液冲洗并溶解滤膜上的凝固物；④超滤：用15mL超滤管在7500r/min下离心lh， 最后得到约为100 μ L的浓缩液，即得浓缩10000倍的病毒浓缩液。
[0025] L 2. 3f2噬菌体浓缩
[0026] 将上一步骤病毒浓缩液用无菌蒸馏水复原至1L，测定噬斑数，即为浓缩后样品回 复的噬斑数，该噬斑数与浓缩前噬斑数之百分比即为回收率。
[0027] I. 3f2噬菌体噬斑数测定方法
[0028] 把融化的营养琼脂（琼脂含量1.5% )12mL-15mL倾入无菌平皿内作为底层， 待凝固后加入被检样品lmL，再加入0.4mL培养至对数生长期的大肠杆菌（Escherichia coli) 285,然后覆盖一层半固体营养琼脂（琼脂含量0. 8%，约5mL-8mL)，轻度平面摇匀， 37°C培养18h - 24h，计数噬斑数量。
[0029] 1. 4洗脱液的pH值对镁离子絮凝法效果的影响
[0030] 以f2噬菌体为模型进行研宄。
[0031] 首先配制不同pH值的柠檬酸缓冲液。取柠檬酸溶液及磷酸溶液各100mL(每种都 相当于IOOmL lmol/L的NaOH溶液），加入3. 54g原硼酸及343mL的lmol/L的NaOH溶液， 加水至1L。从中取20mL，用一定量的0. lmol/L的HCl溶液调节pH值，加蒸馏水至100mL， 分别得到pH值为3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5的柠檬酸缓冲液。
[0032] 然后和之前的方法一样，对f2噬菌体进行添加回收试验，只是其中的柠檬酸缓冲 液的pH值分别为3. 5、4. 0、4. 5、5. 0、5. 5,同时用4mL 0. lmol/L HCl作对照研宄。比较不同 PH值缓冲液对镁离子絮凝法效果的影响，确定优化的镁离子絮凝法条件。
[0033] 1.5正电荷膜过滤法
[0034] 水样添毒方法如前所述。取IL待测水样通过一阳电滤膜（Zetapore，孔径 0. 45 μπι，直径47mm)，然后用4mL含有1%小牛血清的甘氨酸缓冲液（50mmol/L，pH 9. 5)洗 脱30min，再用20 μ L的HCl调节pH至8. 0,最后超滤浓缩至100 μ L。
[0035] 2 结果
[0036] 2. 1镁离子絮凝法对f2噬菌体浓缩效果的观察
[0037] f2噬菌体的添加回收试验进行了 9次（用的是pH4. 5的柠檬酸缓冲液洗脱），添 加回收试验的结果如表1所示。
[0038] 表1镁离子絮凝法浓缩水中f2噬菌体效果观察
[0039]

【权利要求】
1. 一种从水体中高效浓缩病毒的方法，其特征在于，将待测水样去除杂质不溶物后，在 其中加入足量的Mg2+和P0/+，以形成絮凝物沉淀待测水样中的病毒，然后再经负压抽滤过 混合纤维滤膜，取下滤膜，用pH值3. 5?4. 5的溶液冲洗并溶解滤膜上的凝固物，得到洗涤 液，洗涤液再经超滤浓缩，得到病毒浓缩液。
2. 根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的将待测水样去除杂质不溶物，步骤 为：待检测水样在3000r/min转速下离心，取上清。
3. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的Mg2+和P0 43+的加入量相同，其 终浓度为〇? 002?0? Olmol/L，所述的pH值3. 5?4. 5的溶液为pH值4. 0的溶液。
4. 根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的加入Mg2+和P0 43+，其是分别以 lmol/L MgCl# lmol/L Na2HP04的形式加入，Mg2+和 P0/+的终浓度都为 0.002mol/L，所述 的pH值4. 0的溶液为pH值4. 0的柠檬酸缓冲液。
【文档编号】C12N7/02GK104498445SQ201410790113
【公开日】2015年4月8日 申请日期:2014年12月17日 优先权日:2014年12月17日
【发明者】寇晓霞, 吴清平, 薛亮, 蔡伟程, 张菊梅 申请人:广东省微生物研究所, 广东环凯微生物科技有限公司