具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明公开了一种具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株（ Taxus wallichiana var.mairei ） ，命名为：南方红豆杉植物细胞系NO51-3，由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号CGMCCNo.10002。本发明更进一步公开了紫杉醇（Paclitaxel，CASNO:33069-62-4，常用商品名Taxol作通用名）高产细胞系的筛选和建立，本发明从红豆杉外植体中诱导筛选出一株高产紫杉醇的细胞系，实验结果证明：该细胞系高产次生代谢产物紫杉醇等紫杉烷类化合物，可作为原料药用于治疗卵巢癌和乳腺癌等。
CGMCC No10002
20141119
【专利说明】具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株及其应用
【技术领域】
[0001] 本发明属于植物细胞培养【技术领域】，具体涉及一种具有高产紫杉醇特性的红豆杉 细Far. 用。
【背景技术】
[0002] 紫杉醇是从红豆杉属植物中分离得到的一种抗癌药物，已被证明对治疗卵巢癌、 乳腺癌及肺癌等有效。目前紫杉醇的提取都是以红豆杉属植物的树皮为原料，不仅破坏环 境，危及红豆杉资源，且因红豆杉属植物生长缓慢，紫杉醇含量较低，所以药源奇缺，价格昂 贵。另外，全化学合成虽然已经成功，但是因为成本价格较高无法实现实际工业生产。因 此，必须寻找可替代化学合成的途径，利用红豆杉植物组织、细胞培养法生产紫杉醇是解决 途径之一。
[0003] 进行工业化生产，目前提取物紫杉醇的含量低是制约因素，必须进行高产细胞株 的筛选和培养，才能解决。因此要从愈伤组织筛选开始，选出高产细胞株，进行悬浮培养，培 养成高产优良性状的能连续继代的细胞系。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是提供一种高产紫杉醇的红豆杉细胞株。为了解决此问题，本发明 所采用的技术方案是 ： 一种具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株ra_r. ffiairei)，命名 为：南方红豆杉植物细胞系N051-3,由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保 藏，保藏号 CGMCC No. 10002。
[0005] 本发明进一步公开了具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株 rar. ffiairei)，保藏号CGMCC No. 10002的用途，主要用于制备抗癌药制剂的原料。实验结 果显示：获得紫杉醇产量最低达50 mg/L，最高可以达323mg/L。
[0006] 本发明更进一步公开了具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株（ rar. 保藏号CGMCC No. 10002的筛选方法，其特征在于按如下的步 骤进行： (1)外植体诱导获得愈伤组织。
[0007] (2)愈伤组织稳定继代生长 (3)固体愈伤细胞小细胞团法选种。
[0008] 本发明还公开了采用紫杉醇特性的红豆杉细胞株，生产紫杉醇的方法，其特征在 于： (1)固体愈伤细胞自然生产。
[0009] (2)液体悬浮培养自然生产。
[0010] (3)液体悬浮培养用组合调控的方法获得高产。
[0011] 具体是将悬浮细胞接种按照称重法接种鲜细胞至TA调控培养基，培养基用100mL 三角瓶装量20mL，接种量为鲜重6g/瓶，暗培养，100转/分，采用25°C培养；分两步法培养， 总生产周期28天。在细胞培养的第4天添加甲基茉莉酸100 y M，第28天收获细胞和培养 液。结果：紫杉醇产量达50-323 mg/L。
[0012] 本发明还公开了具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株rar. ffiairei)通过特异性扩增18S rDNA的部分ITS片段与南方红豆杉序列进行比对，序列一致， 其特征在于从基因角度证明该紫杉醇高产细胞系属于南方红豆杉。
[0013] 本发明更加详细的技术内容如下： (1)本发明提供的具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株（raros rar. aairei入命名为：南方红豆杉植物细胞系N051-3,所述的细胞系是由北京市朝阳区北辰 西路1号院3号，中国普通微生物菌种保藏管理中心保藏，命名南方红豆杉植物细胞系 N051-3,保藏日期2014年11月19日，保藏号CGMCC No. 10002,分类学名称，曾用名7^狀 mairei, Taxus chinensis var. mairei Cheng et L. K，最氣分类学笔 Taxus wallichiana var. mairei 〇
[0014] (2)紫杉醇特性的红豆杉细胞株（Tkras rar. 的培养特征 及生理生化指标： 1)本细胞株摇瓶液体细胞系生长稳定，生长量1. 8-3倍/14天，适应生长温度25°C，暗 培养，生长最适起始pH值5. 8,蔗糖浓度20g/L。
[0015] 2)本细胞株固体细胞偏干，浅棕色，培养基底部分泌红色物质，培养周期21天； 3)本细胞株悬浮细胞，细胞浅棕，颗粒饱满，大小均匀，像小米粒，上清培养液浅棕色， 含白色混浊物的胶体溶液。
[0016] (3)紫杉醇特性的红豆杉细胞株（Taxus wallichiana var. mairei)的 18S rDNA ITS基因序列为SEQ ID NO. 1:
【权利要求】
1. 一种具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株（Tkras rar. 命 名为：南方红豆杉植物细胞系N051-3,由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 保藏，保藏号CGMCC No. 10002。
2. 权利要求1所述具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株（Tkras rar. aairei入保藏号CGMCC No. 10002在制备抗癌药紫杉醇原料药方面的应用。
3. 权利要求2所述的应用，其中所述的抗癌药紫杉醇原料药指的是制剂原料方面的应 用。
4. 权利要求1所述具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株rar. 入保藏号CGMCC No. 10002的筛选方法，其特征在于按如下的步骤进行： (1) 外植体诱导愈伤细胞； (2) 愈伤组织稳定继代生长； (3) 固体愈伤细胞小细胞团法选种。
5. -种采用具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株生产紫杉醇的方法，其特征在于： (1) 固体愈伤细胞自然生产； (2) 液体悬浮培养自然生产； (3) 液体悬浮培养组合调控的方法获得高产。
6. 权利要求1所述具有高产紫杉醇特性的红豆杉细胞株rar. ?airei)18S rDNA的部分ITS片段，此18S的部分ITS片段与南方红豆杉序列进行比对，序 列一致，其特征在于从基因角度证明该紫杉醇高产细胞系属于南方红豆杉。
【文档编号】C12P17/02GK104450601SQ201410726199
【公开日】2015年3月25日 申请日期:2014年12月4日 优先权日:2014年12月4日
【发明者】张卫, 王丽, 丁靖志, 孙波, 吕建明 申请人:天津艾赛博生物技术有限公司