一组可提高sod抗逆性和水溶液中稳定性的氨基酸序列及其应用的利记博彩app
【专利摘要】本发明涉及一组可提高SOD抗逆性和水溶液中稳定性的氨基酸序列及其应用，它是一组来源于 Geobacillus 属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列。这组氨基酸序列具有以下特征：1）位于Fe/Mn-SOD蛋白的sodA功能域之前，序列长度为101-344个氨基酸，功能未知；2）其相互之间具有85-100%的同源性；3）均包含1或2个特殊的共有重复序列Geo-N-repeat。这组氨基酸序列对 Geobacillus 属的Fe/Mn-SOD的抗逆性和水溶液中稳定性具有决定性作用，可广泛应用于其它SOD（特别是传统工业用SOD）的改造，显著提高其抗逆性和水溶液中稳定性。
【专利说明】一组可提高SOD抗逆性和水溶液中稳定性的氨基酸序列及 其应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一组可提高SOD抗逆性和水溶液中稳定性的氨基酸序列及其应用。
【背景技术】
[0002] 超氧化物歧化酶（surperoxide dismutase，EC. L 5. L 1，S0D)是一类金属酶，该酶 广泛存在于动物、植物和微生物等多种生物体内。1938年由Mann和Keilin从牛红细胞中 分离得到。1969年Mecord和Fridovich发现该蛋白质能催化清除超氧阴离子自由基（O 2O 的反应，是一种重要的氧自由基清除剂，可平衡机体的氧自由基，从而避免当机体内超氧阴 离子自由基浓度过高时引起的不良反应。按其结合的金属离子可分为Fe-S0D，Mn-S0D，Cu/ ZnSOD三种。SOD具有抗炎、抗病毒、抗辐射、抗衰老等作用，其也在病毒性疾病、自身免疫性 疾病、心肌缺血和缺血再灌流综合症、老年性白内障、心血管疾病、辐射病、癌症的治疗预防 以及人类长寿等领域中起到重要作用。
[0003] 天然SOD在工业生产和食品药品添加过程中有半衰期短，遇变性剂、抑制剂易失 活等不利因素。SOD的稳定性是决定其能否商业化的一个重要条件。因此，对SOD进行修饰 改造，改变分子的物理化学性质，增加其对高温、极端pH、变性剂、清洁剂、抑制剂等的抗逆 性及在水溶液中的稳定性，克服上述不利因素就显得十分必要。目前国内外已有很多的研 究，首先是化学修饰，如采用聚乙二醇、右旋糖酐、月桂酰氯、多糖物质等对SOD的氨基和胍 基进行化学修饰以提高其稳定性并仍能保留最大活性；其次是基因重组，国际生物学界采 用的基因重组法制取人源SOD是SOD制备的最前沿技术，具有高安全、高活性、高稳定性等 优势；最后是SOD的模拟化合物，其具备更低的分子量和更高的稳定性，且获取和制备比天 然SOD简单。本专利涉及一组可提高SOD抗逆性和水溶液中稳定性的氨基酸序列，为实现 SOD的稳定性改造提供了一种全新的思路和方法，该方法操作简便、可行性强、适应性好，可 实现传统工业用SOD的升级换代，更有利于SOD酶制剂在成分复杂的食品、药品和化妆品中 的添加，并保持长期稳定，延长货架期，具有重要的应用价值和前景。
【发明内容】
[0004] 本发明的一个目的是提供一组来源于属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD 的N端氨基酸序列，这13个N端氨基酸序列具有以下特征： (1) 位于Fe/Mn-SOD蛋白的sodA功能域之前，序列长度为101-344个氨基酸，不能独立 行使SOD的功能； (2) 其相互之间具有85-100%的同源性； (3) 都包含特殊的共有重复序列Geo-N-repeat，其中9个N端序列含有2个重复序列， 另外4个N端序列含有1个重复序列。
[0005] 本发明的另一目的是提供一组来源于属的13个特殊嗜热Fe/Mn-S0D 的N端氨基酸序列，这一组N端氨基酸序列对foo知ciBm属的Fe/Mn-SOD的抗逆性和水溶 液中稳定性具有决定性作用，除去这一组N端氨基酸序列后的属的Fe/Mn-SOD 的抗逆性和水溶液中稳定性大幅降低(实施例1所示)。
[0006] 本发明的另一目的是提供一组来源于属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD 的N端氨基酸序列，这组N端氨基酸序列可广泛应用于其它SOD (不仅限于S0D)，特别是传 统工业用SOD的抗逆性和水溶液中稳定性改造。通过一定方法，将这段N端氨基酸序列添 加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端，可以显著提高SOD的抗逆性、水溶液中及冻干 粉的稳定性(如实施例1、2所示)。
[0007] 本发明的另一目的是提供一种能表达重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加 到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组质粒。
[0008] 本发明的再一目的是提供一种能产生上述重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列 添加到其它SOD的N端或sodA功能域的N端）的重组菌。
[0009] 本发明的再一目的是提供了 SEQ ID NO: 1-13氨基酸序列在提高SOD的抗逆性、提 高SOD在水溶液中稳定性方面的应用。
[0010] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案： 本发明提供一组来源于属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序 列，如 SEQ ID NO: 1-13 所示。
[0011] 上述一组来源于属的13个特殊嗜热Fe/Mn-S0D的N端氨基酸序列， 其特征在于：（1)位于Fe/Mn-SOD蛋白的sodA功能域之前，序列长度为101-344个氨基酸； (2)其相互之间具有85-100%的同源性；（3)都包含特殊的共有重复序列Geo-N-repeat，其 中SEQ ID NO: 1-9的9个N端序列都含有2个重复序列，SEQ ID NO: 10-13的4个N端序 列都含有1个重复序列。
[0012] 上述一组来源于属的13个特殊嗜热Fe/Mn-S0D的N端氨基酸序列， 其具有与SEQ ID NO: 1-13所示的氨基酸序列至少70%的同源性。
[0013] 上述一组来源于属的13个特殊嗜热Fe/Mn-S0D的N端氨基酸序列， 其具有SEQ ID NO: 1-13所示的氨基酸序列中缺失、替换、或插入的多个氨基酸序列为2-100 个。
[0014] 上述一组来源于属的13个特殊嗜热Fe/Mn-S0D的N端氨基酸序列， 其特征在于，这组N端氨基酸序列可广泛应用于其它SOD (不仅限于S0D)，特别是传统工业 用SOD的抗逆性和水溶液中稳定性改造。通过一定方法，将这段N端氨基酸序列添加到其 它SOD的N端或sodA功能域的N端，可以显著提高SOD的抗逆性和水溶液中稳定性。
[0015] 本发明提供的SEQ ID NO: 1-13氨基酸序列如下： Geobacillus thermodenitrificans NG80-2SEQ ID N0:1 MDDQTLFAQYAAEVNEWGEQVKQVLELRGASIDGASTLLQFIAEHDGKWTEEAVRELTRLVDDVYAAALRHY AIEAAEWGKQVEHALSMRGAAEDIGLSSLLARIEEHGDEWTEEEIHELQLLVDDVYARAIRLVEPLSDGQEEDLTRQ EEVSALPEQEGGNREQMSKGTERSGEHKGDSEQEPVVAAERAEPFIASSTDSPDGEQLHE⑶TMDEEWRHNADMTDK ERLPEEGVTDGERQRAVS Geobacillus thermoleovorans CCB_US3_UF5SEQ ID NO:2 MRLDKETVWCSRRFAKAACLFQKKGGADPKREYVLGQPDFFERFIYGSFADPLQG SITAILFFLAVFSYDDC PRSSMYERPGIWVNADKNDFPMTAYDMANKTGGGFYQMDDQVLFAQYAARVNEWGNQVKETLALRGASTDGASSLLE FIAEHDGEWTEEAVRELQRLADDVYVGALRQYVMEAAAWGRQVEQALSARRMAEDVGLSSLLAYIDGHGDEWTEEAI YELQRLVDDVYTRAVRLADSSAADREEEATQEQVEGESVSPELESENKENEDGWLDTSGTAERVEDAKEPAFMAELS DSPTDAADGEPDQADNVTDGKRRWVDADDGGEPRQQVAPGR Geobacillus sp. G11MC16SEQ ID NO:3 MDDQALFAQYAAEVNEffGEQVKQVLELRGASIDGASTLLQFIAEHDGEffTEEAVRELTRLVDDVYAAALRHY AIEAAEWGKQVEHALSMRGAAEDIGLSSLLARIEEHGDEWTEEEIHELQLLVDDVYARAIRLVEPLSDGQEEDLTRQ EEVSALPEQEGGNGEQMSEGTERSGEHKGDSEQEPVVAAERAEPFIASSTDSPDGEQLHE⑶TMDEEWRHNADMTDK ERLTEEGVTDGERQRAVS Geobacillus sp. C56-T3SEQ ID NO:4 MDDQVLFAQYAARVNEWGNQVKETLALRGASTDGASSLLEFIAEHDGEWTEEAVRELQRLADDVYVGALRQY VMEAAAWGRQVEQALSARRMAEDVGLSSLLAYIDGHGDEWTEEAIYELQRLVDDVYTRAVRLADSSAAEREEEATQE QVEGESVSPELESENKENEDGWLDTSGTAERVEDAKEPAFMAELSDSLPDIADGEPGQADNVTDGKRRWVDADDGGE PRQQAAPGR Geobacillus sp. Y412MC52SEQ ID NO:5 MDDQVLFAQYAARVNEWGNQVKETLALRGASTDGASSLLEFIAEHDGEWTEEAVRELQRLADDVYVGALRQY VMEAAAWGRQVEQALSARRMAEDVGLSSLLAYIDGHGDEWTEEAIYELQRLVDDVYTRAVRLADSSAAEREEEATQE QVEGESVSPELESENKENEDGWLDTSGTAERVEDAKEPAFMAELSDSLPDIADGEPGQADNVTDGKRRWVDADDGGE PRQQVAPGR Geobacillus sp. GHHOISEQ ID NO:6 MDDQVLFAQYAARVNEWGNQVKETLALRGASTDGASSLLEFIAEHDGEWTEEAVRELQRLADDVYVGALRQY VMEAAAWGRQVEQALSARRMAEDVGLSSLLAYIDGHGDEWTEEAIYELQRLVDDVYTRAVRLADSSAAEREEEATQE QVEGESVSPELESENKENEDGWLDTSGTAERVEDAKEPAFMAELSDSLPDIADGEPGQADNVTDGKRRWVDADDGGE PRQQAAPGR Geobacillus sp. Y412MC61SEQ ID NO:7 MDDQVLFAQYAARVNEWGNQVKETLALRGASTDGASSLLEFIAEHDGEWTEEAVRELQRLADDVYVGALRQY VMEAAAWGRQVEQALSARRMAEDVGLSSLLAYIDGHGDEWTEEAIYELQRLVDDVYTRAVRLADSSAAEREEEATQE QVEGESVSPELESENKENEDGWLDTSGTAERVEDAKEPAFMAELSDSLPDIADGEPGQADNVTDGKRRWVDADDGGE PRQQVAPGR Geobacillus kaustophiIus HTA426SEQ ID NO:8 MRGASTDGASSLLEFIAEHDGEffTEEAVRELQRLADDVYVGALRQYVMEAAAffGRQVEQALSARRMAEDVGL SSLLAYIDGHGDEWTEEAIYELQRLVDDVYTRAVRLADSSAADREEEATQEQVEGESVSPELESENKENEDGWLDTS GTAERVEDAKEPAFMAELSDSPTDAADGEPDQADNVTDGKRRWVDADDGGEPRQQVAPGR Geobacillus sp. P0T5SEQ ID NO:9 LRGASTDGASSLLEFIAEHDGEWTEEAVRELQRLADDVYVGALRQYVMEAAAWGRQVEQALSARRMAEDVGL SSLLAYIDGHGDEWTEEAIYELQRLVDDVYTRAVRLADSSAADREEGATQEQVEGESVSPELESENKENEDGWLDTS GTAERVEDAKEPAFMAELSDSPTDAADGEPDQVDNVTDGKRRWVDADDGGEPRQQVAPGR Geobacillus sp. WCH70SEQ ID NO:10 MNEQERIQQYVAEVKEWGKQVEQILLQRGEDGGDCRVDSLLSYIEHHGDAWTEDAIYELQRMVDEVYEKALVF QQNGQSAIRQEESGTEERQQTSIGQEENGIEERQQTAVRQEESGTEERQQTASEQEEESEAEERQQTYVAAGR Geobacillus thermoglucosidans TN0-09. 020SEQ ID NO:I I MSEQELFQRYVKQVSEWGAQVGQMLPRRDDGTVHHDIAALLSYIDRHDGEWTETEIYDLQRMADAVYEKAAAV SANGTLADESRETSEEEARRQTYITAGR Geobacillus thermoglucosidasius C56-YS93SEQ ID NO:12 MSEQELFQRYVKQVSEWGAQVGQMLPRRDDGTVHHDIAALLSYIDRHDGEWTETEIYDLQRMADAVYEKAAAV SANGTLADESRETSEEEARRQTYITAGR Geobacillus sp. Y4. 1MC1SEQ ID NO:13 MSEQELFQRYVKQVSKWGAQVGQMLPRRDDGTVHRDIAALLSYIDRHDGEWTETEIYDLQRMADAVYEKAAAV SANGTLADESRETSEEEARRQTYITAGR 一种表达上述的超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能 域的N端）的重组质粒,该质粒至少包括SEQ ID NO: 1-13所示的基因。
[0016] 上述表达重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功 能域的N端）的重组质粒的载体为pET-28a(+)(实验室常用载体)。
[0017] 一种产生上述的重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或 sodA功能域的N端）的重组菌，该重组菌导入了超氧化物歧化酶。
[0018] 上述产生重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功 能域的N端）的重组菌为大肠杆菌。
[0019] 上述产生重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功 能域的N端）的重组菌的大肠杆菌为大肠杆菌BL21菌株(保藏号H1566)。
[0020] 上述的重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或SOdA功能 域的N端）应用于催化超氧阴离子自由基，发生歧化反应生成氧气和双氧水。
[0021] 对本发明的重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA 功能域的N端)基因所表达的酶分子的氨基酸进行一个或多个氨基酸替换、插入或缺失所得 到的蛋白质也能达到本发明的目的。因而本发明还包括与SEQ ID NO: 1-13所示的氨基酸 序列具有至少70%的同源性，优选具有至少90%的同源性，但同时具有重组超氧化物歧化酶 活性的蛋白质。上面使用的术语"多个"可以是小于100的数目，优选为小于10的数目。
[0022] 本发明提出的上述重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端 或sodA功能域的N端）的性能不同于已知的超氧化物歧化酶，将这段N段序列添加到其它 SOD的N端或sodA功能域的N端，可以提高其它SOD的抗逆性和水溶液中稳定性，可高效催 化超氧阴离子自由基（〇2 · ?发生歧化反应生成氧气O2和双氧水H202。
[0023] 上述的重组超氧化物歧化酶（N端氨基酸序列添加到其它SOD的N端或sodA功能 域的N端）改造后的重组超氧化物歧化酶主要应用于医药、卫生保健、食品或化妆品加工。
[0024] 本发明公开的一组可提高SOD抗逆性和水溶液中稳定性的氨基酸序列所具有的 积极效果在于： (1)阐明了一种提高SOD抗逆性和水溶液中稳定性的新方法。利用添加本专利中氨基 酸序列的基因重组方法进行SOD的改造和表达，可提高其对高温、极端pH、变性剂、清洁剂、 抑制剂等的抗逆性及在水溶液中的稳定性，具有重要应用价值。
[0025] (2)通过添加本专利中氨基酸序列所获得的SOD酶具有极高的稳定性，更有利于 SOD酶制剂在成分复杂的食品、化妆品、药品和保健品中的添加，并保持长期稳定，延长货架 期。
[0026] (3)本发明可应用于SOD的工业生产和添加，操作简便、可行性强、适应性好，成本 低廉，具有重要的工业应用前景和实际意义。
[0027]
【专利附图】
【附图说明】： 图1为抑制剂、清洁剂、变性剂对SOD活性的影响。
[0028]
【具体实施方式】
[0029] 下面通过具体实施例并结合附图对本发明作进一步的详细说明。以下各实施例仅 仅是用于说明而不是限制本发明。需要特别说明的是实施例中所用到的试剂均由市售，嗜 热脱氮芽胞杆菌NG80-2 (CGMCC No. 1228)已保藏在国家菌种保藏中心。
[0030] 实施例1 1.构建编码NG80-2的Fe/Mn-SOD全序列基因的克隆，并且构建编 码S0D-GTNG_2215的结构域sodA的DNA序列（so说的克隆，并且测定抑制剂、 清洁剂、变性剂对表达蛋白活性的影响。
[0031] I. 1嗜热脱氮芽胞杆菌NG80-2 (CGMCC No. 1228)总DNA的提取 在本实施例中，采用从中国天大港油田官69-8区块油井地层水分离获得的嗜热脱氮 芽胞杆菌如80-2(6<61〇知<^7/^/>5从6?/--〇￡/6 1/7/^^7^<3/7>5该菌株已保藏在中国微生物菌种保藏 委员会普通微生物中心，其保藏号为CGMCC No. 1228)，取其过夜培养的新鲜培养物3mL，离 心收集菌体，菌体悬于250μ L50mMTris缓冲液中（pH8. 0)，加入10μ L0. 4M EDTA (pH8. 0)， 混匀后37°C保温20min，之后加入30 μ L20mg/L溶菌酶，混匀后37°C再保温20min，再加入 5 μ L20mg/L蛋白酶K，温柔混匀后，再加入20 μ L10%SDS，50°C保温至溶液澄清，分别用等体 积酚：氯仿：异戊醇抽提两次，氯仿：异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2. 5倍体 积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，沉淀溶于100 μ LTE缓冲液（pH8. 0, IOmMTris, I mMEDTA)，加入10mg/L RNase 2yL，65°C保温30min，分别用酚：氯仿：异戊醇、氯仿：异 戊醇各抽提一次，上清液加入2. 5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干 燥，沉淀溶于50 μ LTE缓冲液。DNA溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280=l. 95， A260=0. 73。
[0032] I. 2超氧化物歧化酶基因的克隆和筛选 1. 2. 1扩增NG80-2的Fe/Mn-S0D全序列基因取前面所述的总DNA溶 液0. 5 μ L (约IOng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参 数进行25个循环PCR。
[0033] 设定的PCR循环参数如下： 95°C，3min ;95°C，30s ;55°C，45s ;72°C，2min ;72°C，IOmin ;4°C，2hr 上游引物：5'GGAATTCCATATGGACGACCAAACGTTGTTTGC 3' 下游引物：5'CCCAAGCTITTAAAATGGTTGCCAACGCA 3' I. 2. 2 扩增 NG80-2 的 Fe/Mn-SOD 的结构域 sodA 的 DNA 序列取前 面所述的总DNA溶液0. 5 μ L (约IOng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述 设定的PCR循环参数进行25个循环PCR。
[0034] 设定的PCR循环参数如下： 95°C，3min ;95°C，30s ;55°C，45s ;72°C，2min ;72°C，IOmin ;4°C，2hr 上游引物：5' GGAATTCCATATGCCTGGCAAGCATGTGCTGCC 3' 下游引物：5' CCCAAGCTITTAAAATGGTTGCCAACGCA 3' 上述两组PCR产物纯化后都用NdeI和HindIII双酶切，分别与经同样限制型内切酶酶 解并切胶回收的质粒pET_28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5a (本实验室保存）后，涂 于含50 μ g/mL Kan(卡拉霉素)的LB固体培养基上。37°C培养16?18小时，挑取单克隆菌 落鉴定，插入有忽75编码的DNA序列的pET-28a (+)质粒为重组质粒pLWO 1，含有 该质粒的重组大肠杆菌DH5α为DH01。插入有>so---αM；_思75编码的序列的pET-28a(+) 质粒为重组质粒PLW02,含有该质粒的重组大肠杆菌DH5a为DH02。采用Sanger双脱氧法 对此DNA片段进行了测序，测序结果显示插入的DNA序列正确。然后将重组质粒pLWOl和 PLW02分别转化入大肠杆菌BL21中，此大肠杆菌BL21分别命名为BLOl和BL02。
[0035] 1. 3重组超氧化物歧化酶的纯化和特性 将上述重组菌BLOl和BL02单克隆分别接入20mL含50 μ g/mL Kan的LB培养基中， 37°C，180rpm/min培养12小时，然后将培养物按1% (V/V)接种量接入200mL含50μ g/mL Kan的LB培养基(共2个摇瓶)，37°C，220rpm/min培养A600为0. 6时，加入IPTG至终浓度 为0. ImM, 37°C, 180rpm/min诱导3小时。离心收集菌体，悬于50mMTris_Cl (pH8. 0)缓 冲液中，利用超声波破碎细胞，离心上清液为重组超氧化物歧化酶的粗提液。此上清液经 螯合琼脂糖凝胶（Chelating Sepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上 显示一条带。理论上推算S0D-GTNG_2215和S0DA-GTNG_2215的分子量分别为54. OkD和 26. 6kD，与SDS-PAGE检测结果一致。
[0036] 1. 4重组超氧化物歧化酶（SOD)活性测定 3mL反应混合液中14. 5mM L-甲硫氨酸加入2. 7mL，30 μ L EDTA-Na2加入10ul，2. 25mM NBT加入lOOuL，60mM核黄素加入100 μ L，PBS加入90 μ L，加入10 μ L的样品酶液。各试剂 加完后充分混匀，取1管置于暗处，560nm比色时调零。另取1管不加蛋白酶，用磷酸钠缓冲 液代替作为空白对照。其余几管待测样品置于一定温度光强为4000LUX条件下光照15min， 然后立刻避光终止反应。在560nm波长处比色时，用置于黑暗处的样品液调零，测定各样品 管光吸收并记录结果。在一定测定条件下将NBT光还原反应抑制到对照的50%时的酶量作 为一个酶活力单位（U)。
[0037] 1.5抑制剂、清洁剂、变性剂对SOD活性的影响 将纯化的超氧化物歧化酶（S0D)，分别置于终浓度为ImM或IOmM的变性剂（乙二胺四乙 酸（EDTA)和β -巯基乙醇（β -ΜΕ))、0. 1%或1%的清洁剂(十二烷基磺酸钠（SDS))和2. 5M 的变性剂(尿素和盐酸胍)中，25°C保温30分钟，用上述方法测定超氧化物歧化酶的活性。将 不加变性剂、清洁剂、变性剂的反应作为对照，测得的酶活力定义为100%。分别计算不同条 件下超氧化物歧化酶的剩余酶活性(采用相对酶活性来表示，即在不同条件下的剩余的酶 活性占对照酶活性的百分比)。结果表明（见图1)，S0D-GTNG_2215对抑制剂、清洁剂和变性 剂的抗性要强于S0DA-GTNG_2215。其中，S0D-GTNG_2215表现出对变性剂极强的抗性。在 终浓度为2. 5M的尿素或盐酸胍中温育后，S0D-GTNG_2215的剩余活性分别为93%和86%，而 S0DA-GTNG_2215的剩余活性仅为60%和43%。
[0038] 结论：当S0D_GTNG_2215去除N端序列后，其对抑制剂、清洁剂和变性剂的抗性大 幅下降。这说明N端序列对S0D-GTNG_2215的抗逆性具有决定性作用。
[0039] 2.构建编码汉BSn5的Mn-SOD全序列基因的克隆，并且 构建编码S0D-BSn5的结构域sodA的DNA序列说-汉的克隆，最后还要构建编码重 组SOD 的N端序列和汉BSn5的SODA重组结合成重组SOD)全 序列基因的克隆。并且测定抑制剂、清洁剂、变性剂对表达蛋白活性的影 响。
[0040] 2. 1 汉 BSn5 总 DNA 的提取 在本实施例中，取其过夜培养的新鲜培养物3mL，离心收集菌体，菌体悬于250 μ L50mM Tris缓冲液中（pH8. 0)，加入10μ LO. 4M EDTA (pH8. 0)，混匀后37°C保温20min，之后加入 30 μ L20mg/L溶菌酶，混匀后37°C再保温20min，再加入5 μ L20mg/L蛋白酶K，温柔混匀后， 再加入20yL10%SDS，50°C保温至溶液澄清，分别用等体积酚：氯仿：异戊醇抽提两次，氯 仿：异戊醇抽提一次，最后一次的上清溶液，加入2. 5倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用 70% 乙醇洗，沉淀溶于 100μ LTE 缓冲液（ρΗ8· 0, lOmMTris，ImM EDTA)，加入 10mg/L RNase 2 μ L，65°C保温30min，分别用酚：氯仿：异戊醇、氯仿：异戊醇各抽提一次，上清液加入2. 5 倍体积预冷的无水乙醇，回收DNA，用70%乙醇洗，真空干燥，沉淀溶于50 μ LTE缓冲液。DNA 溶液的紫外分光光度计测定结果为A260/A280=l. 96, Α260=0. 72。
[0041] 2. 2超氧化物歧化酶（SOD)基因的克隆和筛选 2. 2. 1扩增BSn5的Mn-SOD全序列基因取前面所述的总DNA溶液0. 5 μ L (约IOng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数进行25 个循环PCR。
[0042] 设定的PCR循环参数如下： 95°C，3min ;95°C，30s ;55°C，45s ;72°C，2min ;72°C，IOmin ;4°C，2hr 上游引物：5' GGAATTCATGAAACGTGAATCTTATCAAACG 3' 下游引物：5' CCGCTCGAGTTAATAGAGCTTCCAAACGACTTC 3' 2. 2. 2扩增BSn5的Mn-SOD的结构域sodA的DNA序列-汉SM),取前面所述的总 DNA溶液0. 5 μ L (约IOng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR 循环参数进行25个循环PCR。
[0043] 设定的PCR循环参数如下： 95°C，3min ;95°C，30s ;55°C，45s ;72°C，2min ;72°C，IOmin ;4°C，2hr 上游引物：5' GGAATTCCATATGAAACAcGTGCTGCCAAAGCT 3' 下游引物：5' CGCGGATCCTTAATAGAGCTTCCAAACGACTTC 3' 2. 2. 3 扩增重组 SOD 的 DNA 序列 2. 2. 3. 1扩增NG80-2 SOD的N端序列基因（·5〇?/_τν-αΜ?_Ζ75·)，取前面所述的总DNA 溶液0. 5 μ L (约IOng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环 参数进行25个循环PCR。
[0044] 设定的PCR循环参数如下： 95°C，3min ;95°C，30s ;55°C，45s ;72°C，2min ;72°C，IOmin ;4°C，2hr 上游引物：5' GGAATTCCATATGGACGACCAAACGTTGTTTGC3' 下游引物：5' GCACATGTTTCGAAACCGCC3' 2. 2. 3. 2扩增BSn5 SOD的C端序列基因（如么，取前面所述的总DNA溶液 0. 5μ L (约IOng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循环参数 进行25个循环PCR。
[0045] 设定的PCR循环参数如下： 95°C，3min ;95°C，30s ;55°C，45s ;72°C，2min ;72°C，IOmin ;4°C，2hr 上游引物：5' GGCGGTTTCGAAACATGTGC3' 下游引物：5' CGCGGATCCTTAATAGAGITTCCAAACGACTTC3' 2· 2· 3· 3 扩增重组 SOD 的 DNA 序列（ soiZ-coWiflafli 各取0. 25 μ L (约IOng)作为模板，以下列寡核苷酸序列作为引物，并按下述设定的PCR循 环参数进行25个循环PCR。
[0046] 设定的PCR循环参数如下： 95°C，3min ;95°C，30s ;55°C，45s ;72°C，2min ;72°C，IOmin ;4°C，2hr 上游引物：5'GGAATTCCATATG GACGACCAAACGTTGTTTGC 3' 下游引物：5' CGCGGATCCTTAATAGAGcTTCCAAACGACTTC 3' 的 PCR 产物纯化后用 EcoRI/ XhoI 双酶切，和 的 PCR产物纯化后用NdeI/ BamH双酶切，以上酶切产物分别与经同样限制型内切酶酶解并切 胶回收的质粒pET_28a(+)连接，转化感受态大肠杆菌DH5a (本实验室保存）后，涂于含 50 μ g/mL Kan(卡拉霉素)的LB固体培养基上。37°C培养16?18小时，挑取单克隆菌落鉴 定，插入有编码的DNA序列的pET-28a (+)质粒为重组质粒pLW03,含有该质粒的 重组大肠杆菌DH5a为DH03。插入有编码的DNA序列的pET-28a(+)质粒为重 组质粒PLW04,含有该质粒的重组大肠杆菌DH5a为DH104。插入有编码的 DNA序列的pET-28a (+)质粒为重组质粒pLW05,含有该质粒的重组大肠杆菌DH5 a为DH05。 采用Sanger双脱氧法对此DNA片段进行了测序，测序结果显示插入的DNA序列正确。将上 述重组质粒pLW03、pLW04和pLW05分别转化入大肠杆菌BL21中，此大肠杆菌BL21分别命 名为 BL03、BL04 和 BL05。
[0047] 2. 3重组超氧化物歧化酶的纯化和特性 将上述重组菌BL03、BL04和BL05单克隆分别接入20mL含50 μ g/mL Kan的LB培养基 中，37°C，180rpm/min培养12小时，然后将培养物按1% (V/V)接种量接入200mL含50yg/ 1^1^11的1^培养基(共2个摇瓶)，371：，220印111/111丨11培养4600为0.6时，81^03加入1?丁6 至终浓度为〇. 〇5mM，25°C，180rpm/min诱导3小时。BL04加入IPTG至终浓度为0. 05mM, 25〇C , 180rpm/min 诱导 3 小时。BL05 加入 IPTG 至终浓度为 0· ImM, 30°C，180rpm/min 诱 导3小时。诱导完后离心收集菌体，悬于50mMTris-Cl(pH8. 0)缓冲液中，利用超声波破碎细 胞，离心上清液为重组超氧化物歧化酶的粗提液。此上清液经螯合琼脂糖凝胶（Chelating Sepharose)镍亲合柱层析纯化，得到的酶制剂在SDS-PAGE上显示一条带。理论上推算 500-85115、500六-85115和500-(3〇1111^仙1^的分子量分别为 37.28099 1^)、26.28290 1^)和 53. 61853 kD，与 SDS-PAGE 检测结果一致。
[0048] 2.4重组超氧化物歧化酶活性测定 3mL反应混合液中14. 5 mML-甲硫氨酸加入2. 7mL，30 μ L EDTA-Na2加入10 μ L，2. 25 mM NBT加入100 μ L，60 μ M核黄素加入100 μ L，PBS加入90 μ L，加入IOyL的样品酶液。 各试剂加完后充分混匀，取1管置于暗处，560nm比色时调零。另取1管不加蛋白酶，用磷酸 钠缓冲液代替作为空白对照。其余几管待测样品置于一定温度光强为4000LUX条件下光照 15min，然后立刻避光终止反应。在560nm波长处比色时，用置于黑暗处的样品液调零，测定 各样品管光吸收并记录结果。在一定测定条件下将NBT光还原反应抑制到对照的50%时的 酶量作为一个酶活力单位（U) 2. 5抑制剂、清洁剂、变性剂对SOD活性的影响 将纯化的超氧化物歧化酶（S0D)，分别置于终浓度为ImM或IOmM的变性剂（乙二胺四乙 酸（EDTA)和β -巯基乙醇（β -ΜΕ))、0. 1%或1%的清洁剂(十二烷基磺酸钠（SDS))和2. 5M 的变性剂(尿素和盐酸胍）中，25°C保温30分钟，用上述方法测定超氧化物歧化酶的活性。 将不加变性剂、清洁剂、变性剂的反应作为对照，测得的酶活力定义为100%。分别计算不同 条件下超氧化物歧化酶的剩余酶活性(采用相对酶活性来表示，即在不同条件下的剩余的 酶活性占对照酶活性的百分比)。结果表明（见图l)，S0D-combinant对抑制剂、清洁剂和变 性剂的抗性要强于S0D-BSn5和S0DA-BSn5。其中，SOD-combinant表现出对变性剂极强的 抗性。在终浓度为2. 5M的尿素或盐酸胍中温育后，SOD-combinant的剩余活性分别为71% 和90%，而S0D-BSn5、S0DA-BSn5的剩余活性仅为44%?64%。
[0049] 结论：N端氨基酸序列添加到其它SOD (Si·-汉的N端，可以显著提高其SOD 对抑制剂、清洁剂和变性剂的抗性。
[0050] 实施例2 构建编码汉BSn5的Mn-SOD全序列基因 Goi/-汉的克隆，并且构建编码 重组SOD 的N端序列和汉的SODA重组结合成重组S0D) 全序列基因)的克隆。并测定酶在水溶液中及制成冻干粉常温存放的稳定 性。
[0051] 1.超氧化物歧化酶（SOD)基因的克隆构建、蛋白纯化及酶活性测定 具体方法见实施例1的2。
[0052] 2.超氧化物歧化酶在水溶液中稳定性 取浓度为50mg/ml的酶液10ml，常温（25°C)存放于密闭容器内。分别在不同的时间 (15天，30天，180天，360天)，测定超氧化物歧化酶的活性，并观察酶蛋白析出情况。将0 天的酶活力定义为100%，分别计算各个时间点超氧化物歧化酶的剩余酶活性(采用相对酶 活性来表示，即在不同时间点的剩余的酶活性占0天酶活性的百分比)。结果表明（见表 1)，sod-BSn5半衰期大于15天，且保存15天时有酶蛋白析出，180天时析出沉淀量增多； sod-combinant半衰期大于360天，且保存360天时酶溶液仍稳定，无沉淀析出： 表I SOD在水溶液中的稳定性：
【权利要求】
1. 一组可提高SOD抗逆性和水溶液中稳定性的氨基酸序列，其特征在于它是来源于 属的13个特殊嗜热Fe/Mn-SOD的N端氨基酸序列，如SEQ ID NO: 1-13所示。
2. 权利要求1所述的一组可提高SOD抗逆性和水溶液中稳定性的氨基酸序列，其特征 在于： (1) 这组N端氨基酸序列来源于feo如属的13个菌株，其中，SEQ ID N0:1 來源、号 Geobacillus thermodenitrificans Wi柳_2 淡M 1\) Wk2 來源、号 Geobacillus 从erffiohorarafls CCB_US3_UF5;SEQ ID N0:3 来源于feo如即.G11MC16; SEQ ID 勵：4来源于化〇如以7^/>5 577.056-13;5￡0 10勵：5来源于化〇如以7^/>5 577.￥4121?：52;SEQ ID N0:6 来源于 Geobacillus sp. GHH01;SEQ ID N0:7 来源于 feo如ciBtts 5/7. 丫4121?：61;5￡0 10勵：8来源于化〇如以7^/>5々拙>^〇/^以狀肌4426;5￡0 10勵：9来源 于^〇如以7^/>5 577.?0了5;5￡0 10勵：10来源于^〇如以7^/>5 577.1〇170;5￡0 10勵：11 来源于 (Aerffio^wciosit/aflsTNO-Og.C^C^SEQ ID 腸：口来源于^⑶知以^狀 从6?/--〇1§7此〇>5/￡/<3>5/" >5〇56-'^93;3￡(>)10腸：13来源于(?(9〇知<^7/">5 577.￥4.1]\0; (2) 这组N端氨基酸序列位于Fe/Mn-SOD蛋白的sodA功能域之前，序列长度分别为244 个氨基酸（SEQ ID NO: 1)、344个氨基酸（SEQ ID N0:2)、244个氨基酸（SEQ ID N0:3)、235 个氨基酸（SEQ ID NO:4-7)、209个氨基酸（SEQ ID NO:8-9)、146个氨基酸（SEQ ID NO: 10)、 101 个氨基酸（SEQ ID NO: 11-13); (3) 这组N端氨基酸序列相互之间具有85-100%的同源性； (4) 这组N端氨基酸序列都包含特殊的共有重复序列Geo-N-r印eat，其中SEQ ID NO: 1-9的9个N端序列都含有2个重复序列，SEQ ID NO: 10-13的4个N端序列都含有1 个重复序列。
3. 权利要求1所述的一组可提高SOD抗逆性和水溶液中稳定性的氨基酸序列，其中所 述N端多肽序列具有与SEQ ID NO: 1-13所示的氨基酸序列至少70%的同源性；SEQ ID NO: 1-13所示的氨基酸序列中缺失、替换或插入一个或多个氨基酸后的氨基酸序列，并且具有 该序列的蛋白质有对?属的Fe/Mn-SOD的抗逆性和水溶液中稳定性具有决定性 作用。
4. 根据权利要求1至3中任一项所述的一组可提高SOD抗逆性和水溶液中稳定性的氨 基酸序列，其特征在于，这组N端氨基酸序列可广泛应用于其它S0D，特别是传统工业用SOD 的抗逆性和水溶液中稳定性改造；通过一定方法，将这段N端氨基酸序列添加到其它SOD的 N端或sodA功能域的N端。
5. 权利要求1至3中任一项所述的一组可提高SOD抗逆性和水溶液中稳定性的氨基酸 序列，其特征在于将编码N端氨基酸序列的核苷酸与编码其它SOD或sodA功能域的核苷酸 连接后经过克隆表达重组S0D，可显著提高SOD的抗逆性和水溶液中稳定性。
6. 权利要求1所述的SEQ ID NO: 1-13氨基酸序列在提高SOD的抗逆性、提高SOD在水 溶液中方面的应用。
【文档编号】C12N9/02GK104371984SQ201410674001
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年11月24日 优先权日:2014年11月24日
【发明者】王威, 李洺畅 申请人:南开大学