甘蔗rna提取方法
【专利摘要】本发明公开了一种甘蔗RNA提取方法，它是利用商业上针对多糖多酚植物研发的RNA提取液对甘蔗叶片RNA进行抽提，在常规的除蛋白操作步骤后，采用核酸吸附柱对RNA分子进行收集，通过洗脱获得高质量的RNA分子，是一种优化了的甘蔗RNA提取方法。优点是将商业上研发的植物总RNA提取试剂与膜结合DNA清除剂试剂盒相结合，不仅在RNA提取过程中完成了DNA的消除，而且，利用硅胶膜离心吸附柱来获得RNA沉淀的方法，与异丙醇或乙醇沉淀方法相比，避免了在对沉淀进行洗涤操作中丢失沉淀的可能性，同时，RNA的纯度也较高。
【专利说明】甘蔗RNA提取方法
【技术领域】
[0001]本发明属于生物【技术领域】，具体涉及一种甘蔗RNA提取方法。
【背景技术】
[0002]从植物组织中提取总RNA是植物分子生物学研究中常用的一个操作步骤，可应用于基因克隆、基因表达分析和转基因研究等多个方面，但是，在提取植物RNA过程中，通常会遇到两个难题，一是RNA分子易被内源性和外源性核糖核酸酶降解，二是RNA分子与酚类、多糖，或其他植物细胞内次级代谢产物相互作用，造成RNA丢失或共沉淀，导致获得的RNA得率低或纯度低。实验中常采用将与植物材料直接接触的器皿进行高温或DEPC水处理的方式来灭活外源性核糖核酸酶，在提取过程中添加还原剂或螯合剂降低酚类物质对RNA的作用，加入适量体积的无水乙醇增加去除多糖效果。
[0003]目前，多个实验室对甘蔗RNA的提取进行了研究，胡军瑜等人分别用改良的盐酸胍法、CTAB法和试剂盒法提取甘蔗叶片总RNA，发现改良的盐酸胍法提取的RNA效果最好；王英将传统的异硫氰酸胍法进行改良也可以提取到适合做分子生物学实验的RNA，但该方法需要较长时间进行RNA沉淀。
[0004]因此，现有的甘蔗RNA提取方法依然存在不足。
【发明内容】
[0005]本发明的目的是提供一种耗时较短，步骤简单，而且RNA得率和纯度都较高的甘蔗RNA提取方法。
[0006]本发明的技术方案如下:
本发明是利用商业上针对多糖多酚植物研发的RNA提取液对甘蔗叶片RNA进行抽提，在常规的除蛋白操作步骤后，采用核酸吸附柱对RNA分子进行收集，通过洗脱获得高质量的RNA分子，是一种优化了的甘蔗RNA提取方法。商业上针对多糖多酚植物研发的RNA提取液是现有技术中已有的RNA提取液，如天根生物技术有限公司的RNAplant plusReagent (植物总RNA提取试剂，目录号为DP437-02)，又如阮孟斌等人发表在热带作物学报2011,32 (9):1704-1707上的《一种适用于多糖多酚植物的高质量RNA快速提取方法》中也给出了适用于该类植物的RNA提取液的配制方法，本领域技术人员很容易从市场上获得该类提取液。而除蛋白操作是RNA提取操作中的一项常规步骤。
[0007]它包括如下步骤:取在液氮中充分研磨的甘蔗叶片迅速放入预冷的RNA提取液中振荡彻底混匀并平放在冰面上平放静置后低温离心获得上清液；其中，在冰面平放静置的时间为4-5 min，低温离心的离心条件温度为4°C，离心转速为10000 rpm，离心时间为1min。将获得的上清液移至新的离心管中，加入NaCl和无水乙醇以及氯仿，颠倒混匀后低温二次离心获得二次离心上清液；将二次离心上清液转入新的离心管并加入等体积异丙醇后颠倒混匀获得沉淀液；将混匀的沉淀液转移至膜结合DNA清除剂试剂盒中的硅胶膜离心吸附柱中进行吸附；配制DNase工作液并将该工作液转移至吸附柱中，降解吸附柱上的DNA污染；用RNA洗脱液将RNA从离心吸附柱上洗脱，获得无DNA污染的甘蔗RNA。
[0008]与现有技术相比，本发明优点是将商业上研发的植物总RNA提取试剂与膜结合DNA清除剂试剂盒相结合，不仅在RNA提取过程中完成了 DNA的消除，而且，利用硅胶膜离心吸附柱来获得RNA沉淀的方法，与异丙醇或乙醇沉淀方法相比，避免了在对沉淀进行洗涤操作中丢失沉淀的可能性，同时，RNA的纯度也较高。另外，此方法提取甘蔗叶片RNA，不需要配制RNA提取液，步骤简单，整个操作用时约1小时，尤其能满足样本量大的实验需求。
【专利附图】
【附图说明】
[0009]图1为甘蔗叶片RNA的琼脂糖电泳图，图中标记1为DL2000 marker, 2为甘蔗品种黔糖5号叶片RNA质量检测；3为甘蔗品种R0C22叶片RNA质量检测。
【具体实施方式】
[0010]下面结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
[0011]实施例1:
如图1所示，以黔糖5号甘蔗品种为原料，按如下步骤实施:
(1)取在液氮中充分研磨的甘鹿叶片约lOOmg,迅速放入1.1 mL预冷的RNA提取液中，振荡彻底混匀，在冰面平放静置约5 min,按离心条件温度为4°C，转速为10000 rpm进行低温离心1 min获得上清液。
[0012](2)将步骤⑴中得到的上清液约lmL移至新的2 mL无RNase离心管中，加入0.2ml 5M NaCl,0.1 mL无水乙醇和0.6 mL氯仿，颠倒混勻后在离心条件温度为4°C,转速为10000 rpm条件下进行离心15 min,得到上清液。
[0013](3)将步骤(2)中离心结束得到的上清液转入新的2 mL离心管，然后加入等体积异丙醇，颠倒混勻，室温静止lOmin。
[0014](4)将步骤(3)中混匀的沉淀液转移至膜结合DNA清除剂试剂盒中的硅胶膜离心吸附柱中进行吸附，按照试剂盒中的要求配制DNase工作液并将该工作液转移至吸附柱中，降解吸附柱上的DNA污染，最后用RNA洗脱液将RNA从离心吸附柱上洗脱，获得无DNA污染的甘蔗RNA。
[0015]优选的，步骤(1)中使用的RNA提取液为天根生物技术有限公司的RNAplant plusReagent (植物总RNA提取试剂，目录号为DP437-02)，步骤(4)中的膜结合DNA清除剂试剂盒为北京天恩泽基因科技有限公司(目录号为90904-50)。
[0016]图1中的标记2展示了甘蔗品种黔糖5号叶片RNA质量检测结构。
[0017]实施例2:
如图1所示，以R0C22甘蔗品种为原料，按如下步骤实施:
(1)取在液氮中充分研磨的甘鹿叶片约150 mg,迅速放入用2 mL离心管装的1.1 mL预冷的RNA提取液(使用前按说明书加入适量β_巯基乙醇)中，振荡彻底混匀，平放在冰面上静置5 min后，在离心温度为4°C、转速为10000 rmp的条件下低温离心1 min获得上清液。
[0018](2)取步骤(1)中得到的上清溶液约1 mL移到新的2 mL无RNase离心管中，加入
0.22 ml 5 M NaCl,0.1 mL无水乙醇和0.7 mL氯仿，颠倒混匀，在离心温度为5°C，转速为10000 rpm条件下低温离心18 min。
[0019](3)取步骤(2)中离心结束得到的上清溶液到新的2 mL离心管中，加入等体积异丙醇，颠倒混匀，室温静止10 min。
[0020](4)将步骤(3)中所得混匀的沉淀液用膜结合DNA清除剂试剂盒进行沉淀的RNA收集，操作步骤如下:
1)将步骤(3)中混匀的沉淀液转入硅胶膜离心吸附柱中，在10000rpm转速条件下离心30 s，使沉淀的核酸分子结合在吸附柱上；
2)将0.5mL通用洗柱液加入到已经结合了 DNA和RNA的硅胶膜离心吸附柱中，在10000 rpm转速条件下室温离心30 s ；
3)将10μ L RNase-free DNase加入到50 μ L膜反应液中配制成DNase工作液，混匀，转入到步骤2)的离心吸附柱中；
4)室温放置5min,使离心吸附柱上的DNA被DNase降解；
5)加入0.5 mL的通用洗柱液到离心吸附柱中，在10000 rpm转速条件下，室温离心30 s ；
6)在10000rpm转速条件下,再离心30 s,充分甩干离心吸附柱上的通用洗柱液；
7)向离心吸附柱膜中央加入50yL RNA洗脱液，静置约20 s后，在10000 rpm转速条件下室温离心30 s，洗脱液即是无DNA的RNA溶液。
[0021]图1中的标记3展示了甘蔗品种R0C22叶片RNA质量检测结构。
[0022]当然，以上只是本发明的具体应用范例，本发明还有其他的实施方式，凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明所要求的保护范围之内。
【权利要求】
1.一种优化的甘蔗RNA提取方法，其特征在于:利用针对多糖多酚植物研发的RNA提取液对甘蔗叶片RNA进行抽提，在除蛋白操作步骤后，采用核酸吸附柱对RNA分子进行收集，通过洗脱获得RNA分子。
2.根据权利要求1所述的甘蔗RNA提取方法，其特征在于其包括:取在液氮中充分研磨的甘蔗叶片放入预冷的RNA提取液中混匀并在冰面上平放静置后低温离心获得上清液的步骤。
3.根据权利要求2所述的甘蔗RNA提取方法，其特征在于其包括:将获得的上清液移至新的离心管中，加入NaCl和无水乙醇以及氯仿，颠倒混匀后低温二次离心获得二次离心上清液的步骤。
4.根据权利要求3所述的甘蔗RNA提取方法，其特征在于其包括:将二次离心上清液转入新的离心管并加入等体积异丙醇后颠倒混匀获得沉淀液的步骤。
5.根据权利要求4所述的甘蔗RNA提取方法，其特征在于其包括:将混匀的沉淀液转移至膜结合DNA清除剂试剂盒中的硅胶膜离心吸附柱中进行吸附的步骤；配制DNase工作液并将该工作液转移至吸附柱中，降解吸附柱上的DNA污染的步骤；用RNA洗脱液将RNA从离心吸附柱上洗脱，获得无DNA污染的甘蔗RNA的步骤。
6.根据权利要求2所述的甘蔗RNA提取方法，其特征在于:所述在冰面平放静置的时间为4-5 min，所述低温离心的离心条件温度为4°C，离心转速为10000 rpm，离心时间为Imir1
【文档编号】C12N15/10GK104293773SQ201410646041
【公开日】2015年1月21日 申请日期:2014年11月15日 优先权日:2014年11月15日
【发明者】付瑜华, 杨成龙, 张正学, 李向勇, 雷石富, 谢惠珏, 周玉飞, 雷朝云, 卢加举, 彭仕荣, 李志琴 申请人:贵州省亚热带作物研究所