一种食品中产气荚膜梭菌的hda引物及其应用方法
【专利摘要】本发明公开了一种食品中产气荚膜梭菌的HDA引物及其应用方法，所述HDA引物为：上游引物：如SEQ ID NO：1所示；下游引物：如SEQ ID NO：2所示。本发明应用该HDA引物对产气荚膜梭菌进行检测，是一种简便、快速的检测方法，操作简单，覆盖面广，能应用在检验的一线，能够准确、快速检测出该食品在卫生标准规定的范围内是否存在产气荚膜梭菌，可节约大量的人力物力，不仅可取得可观的经济效益，更为重要的是对进出口食品安全的意义特别重大。
【专利说明】-种食品中产气荚膜梭菌的HDA引物及其应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种食品中产气荚膜梭菌的HDA引物及其应用方法。
【背景技术】
[0002] 我国当前主要的食品安全问题是致病微生物污染食品引起的食源性疾病，其中微 生物性食物中毒在影响我国食品安全因素中排名第一，儿童、孕妇、年老体弱者和免疫力低 下的人群更容易成为受害者。产气荚膜梭菌（C.perfringens)是临床上气性坏疽病原菌中 最多见的一种梭菌，因能分解肌肉和结缔组织中的糖，产生大量气体，导致组织严重气肿， 继而影响血液供应，造成组织大面积坏死，加之本菌在体内能形成荚膜，故名产气夹膜梭 菌。
[0003] 产气荚膜梭菌的传统检测方法繁琐、耗时长，一般3-5天才能检出病原菌。随着分 子生物学技术的发展和应用，PCR等核酸扩增技术以其快速灵敏和特异的优势，不仅日益取 代了传统的检测方法，而且使以往无法完成的检测成为了可能。许多针对特异性病原体的 检测方法，已经开发为试剂盒并应用于常规检测，取代了病原体体外培养等传统的微生物 检测方法。然而，PCR技术始终无法摆脱依赖精良仪器设备的局限，使得以PCR为基础的核 酸扩增技术无法更为广泛地推广和应用。
[0004] 随着核酸扩增技术的发展和应用，以核酸等温扩增技术为基础的检测技术近年来 得到了迅猛的发展。多种机制的等温技术不仅诞生，而且有些技术已经相当成熟，完成了从 实验室到实际应用的过渡，正逐步在分子生物学、医学、法学等领域得到广泛的运用。特别 是在现场快速检测技术方面，核酸等温扩增技术显示了其突出的优越性。更为重要的是，核 酸等温扩增技术由于不需要温度变化的时间过程且摆脱了对精良仪器设备的依赖，使病原 体的检测实现了快速、简便和高通量。在实际操作和仪器要求方面，这些等温技术都比PCR 技术更为简单和廉价，从而更容易被开发成现场检测的应用产品。因此，等温扩增技术是核 酸扩增技术的发展方向，具有广阔的应用前景。
[0005] 依赖解旋酶 DNA 等温扩增技术（Helicase-Dependent isothermal DNA Amplification,简称HDA)是由美国NEB公司研究人员Vincent等于2004年发明一种新型 核酸等温扩增技术。该技术模拟体内DAN在恒温下复制的自然过程，在恒温条件下利用生 物复制系统的关键组分实现DNA的体外扩增。主要是利用解旋酶在恒温下解开DNA双链， 同时DNA单链结合蛋白（SSB)稳定解开的单链为引物提供结合模板，然后由DNA聚合酶催 化合成互补链。新合成的双链在解旋酶的作用下又形成单链，并作为下一轮合成的模板进 入循环扩增反应，最终实现靶序列的指数增长。
[0006] HDA技术的优点在于：等温扩增，在一个恒定温度就能完成扩增反应，不需要像 PCR那样循环的温度变化；原理简单，HDA技术模拟自然界DNA的合成方式，原理清晰易懂； 操作简便，HDA对引物的设计与PCR相似，不需要复杂的引物设计。对于其他组分也不需要 做任何特殊处理，只需要一个恒温装置即可进行反应；设备简单，HDA不需要复杂的设备， 只需要一个简单的恒温器，如果选用室温可以进行反应的酶，甚至不需要恒温器就可进行 反应。因此，HDA技术具有广阔的应用前景。
【发明内容】
[0007] 本发明要解决的技术问题是提供一种食品中产气荚膜梭菌的HDA引物及其应用 方法，检测灵敏度高，耗时短，特异性强。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明所采取的技术方案是：
[0009] -种食品中产气荚膜梭菌的HDA引物，所述HDA引物为：
[0010] 上游引物：如SEQIDN0 :1所示；
[0011] 下游引物：如SEQIDN0 :2所示。
[0012] 一种利用上述HDA引物的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，采用一步法，使用的反应 体系包括：
[0013] 5 μ LlO X 缓冲液，0· 04 μ mol dNTPs, 0. 16 μ mol ATP, IOU Bst ploymerase, 0· 10 ?0· 30 μ g UvrD helicase，I. 0 ?5. 0 μ g T4gp32 或 I. 0 ?6. 0 μ g RecA 蛋白，25 μ M 海藻糖，2 μ L模板DNA，上游引物和下游引物各20pmol，用CldH2O补至50 μ L ;所述IOX缓 冲液包括IOOmM二硫苏糖醇、350mM Tris-HAcUOOmM MgSOdP lmg/mLBSA ;将反应体系放入 65°C恒温金属浴中恒温扩增2h。
[0014] 作为本发明的一种改进，反应结束后，吸取5 μ L扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电 泳，电泳条件为120V，80mA，电泳时间45min，置凝胶成像系统观察并拍照。
[0015] 作为本发明的一种改进，反应体系中，UvrD helicase的浓度为0. 1 μ g。
[0016] 作为本发明的一种改进，反应体系中，T4gp32的浓度为5.0 μ g，或者RecA蛋白的 浓度为3. 0μ g。
[0017] 作为本发明的一种改进，反应体系中还包括2U?IOU的Phi29嗜温聚合酶。
[0018] 作为本发明的一种改进，Phi29嗜温聚合酶的浓度为10U。
[0019] 采用上述技术方案所产生的有益效果在于：
[0020] 本发明是一种简便、快速的检测方法，操作简单，覆盖面广，能应用在检验的一线， 能够准确、快速检测出该食品在卫生标准规定的范围内是否存在产气荚膜梭菌，可节约大 量的人力物力，不仅可取得可观的经济效益，更为重要的是对进出口食品安全的意义特别 重大。
【专利附图】
【附图说明】
[0021] 图1是实施例2中产气荚膜梭菌HDA法检出限检测结果；图中，泳道I :100bp ladder marker，泳道 2 :10°CFU/g，泳道 3 : K^CFU/g，泳道 4 :102CFU/g，泳道 5 :103CFU/g，泳 道 6 :104CFU/g，泳道 7 :105CFU/g，泳道 8 :106CFU/g。
[0022] 图2是实施例2中产气荚膜梭菌HDA法特异性试验结果；图中，泳道I :100bp ladder marker，泳道2 :产气荚膜梭菌（22949)，泳道3 :金黄色葡萄球菌（23478);泳道 4 :阪崎克罗诺杆菌（21548);泳道5 :乙型溶血性链球菌（10373);泳道6 :蜡样芽胞杆菌 (10041);泳道7 :肠炎沙门氏菌（21482)，泳道8 :福氏志贺氏菌（21534)。
[0023] 图3是实施例2中反应体系中UvrD helicase的优化结果；图中，泳道I: IOObp ladder marker，泳道 2 :0· 30 μ g，泳道 3 :0· 25 μ g，泳道 4 :0· 20 μ g，泳道 5 :0· 15 μ g，泳道 6 :0· 10μ g，泳道 7 :0· 05μ g。
[0024] 图4是实施例2中反应体系中T4gp32的优化结果；图中，泳道I: IOObp ladder marker,泳道 2 :6. 0 μ g，泳道 3 :5. 0 μ g，泳道 4 :4. 0 μ g，泳道 5 :3. 0 μ g，泳道 6 :2. 0 μ g，泳 道 7 :1· 0μ g。
[0025] 图5是实施例2中反应体系中Phi29嗜温聚合酶提高聚合速率的试验结果；图 中，泳道I: IOObp ladder marker ;泳道2 :Phi29嗜温聚合酶浓度为2U扩增结果；泳道3 : Phi29嗜温聚合酶浓度为4U扩增结果；泳道4 :Phi29嗜温聚合酶浓度为6U扩增结果；泳道 5 :Phi29嗜温聚合酶浓度为8U扩增结果；泳道6 :Phi29嗜温聚合酶浓度为IOU扩增结果。
【具体实施方式】
[0026] 下面结合附图和【具体实施方式】对本发明作进一步详细的说明。
[0027] 本发明各实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。并且各实施 例中所用的材料及试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0028] 本发明各实施例中部分材料为：DNA Marker，ATP，dNTPs，均购自大连宝生物工程 公司；海藻糖购自Sigma公司；大肠杆菌UvrD解旋酶购自上海富众生物科学有限公司；Bst polymerase、MutL protein、T4gp32均购自New England公司；引物（正向引物、反向引物） 由大连宝生物工程公司合成；Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒购自生物工程（上海） 有限公司。
[0029] 所采用的菌株均购自于中国工业微生物菌种保藏中心：产气荚膜梭菌（22949)、 金黄色葡萄球菌（23478)、阪崎克罗诺杆菌（21548)、乙型溶血性链球菌（10373)、蜡样芽胞 杆菌（10041)、肠炎沙门氏菌（21482)、福氏志贺氏菌（21534)。
[0030] 本发明各实施例中部分仪器为：金属浴为上海东升仪器有限公司生产的6400 型恒温金属浴，电泳仪为北京市六一厂生产DXY-33A型电泳仪，凝胶成像系统为UVP GelDoc-IT凝胶成像系统。
[0031] 实施例1 :产气荚膜梭菌HDA引物的设计
[0032] 引物由宝生物工程（大连）有限公司合成，2条引物序列见表1。
[0033] 表1产气荚膜梭菌HDA引物序列表
[0034]
【权利要求】
1. 一种食品中产气荚膜梭菌的HDA引物，其特征在于：所述HDA引物为： 上游引物：如SEQIDNO :1所示； 下游引物：如SEQIDNO :2所示。
2. -种利用如权利要求1所述HDA引物的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，其特征在于： 所述HDA检测方法采用一步法，使用的反应体系包括： 5. L10 X 缓冲液，0? 04u moldNTPs，0? 16u molATP，lOUBst ploymerase，0? 10 ? 0? 30 u gUvrDhelicase，1. 0 ?5. 0 u gT4gp32 或 1. 0 ?6. 0 u gRecA 蛋白，25 u M海藻糖，2 u L 模板DNA，上游引物和下游引物各20pmol，用ddH20补至50 y L ;所述10 X缓冲液包括lOOmM 二硫苏糖醇、350mMTris-HAc、100mMMgS04 和 lmg/mLBSA ; 将反应体系放入65°C恒温金属浴中恒温扩增2h。
3. 根据权利要求2所述的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，其特征在于：反应结束后，吸 取5 ii L扩增产物进行2%琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为120V，80mA，电泳时间45min，置凝胶 成像系统观察并拍照。
4. 根据权利要求2所述的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，其特征在于：反应体系中， UvrDhelicase 的浓度为 0? 1 u g。
5. 根据权利要求2所述的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，其特征在于：反应体系中， T4gp32的浓度为5. 0 y g，或者RecA蛋白的浓度为3. 0 y g。
6. 根据权利要求2所述的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，其特征在于：反应体系中还 包括2U?10U的Phi29嗜温聚合酶。
7. 根据权利要求6所述的产气荚膜梭菌的HDA检测方法，其特征在于：Phi29嗜温聚合 酶的浓度为10U。
【文档编号】C12Q1/68GK104372078SQ201410577781
【公开日】2015年2月25日 申请日期:2014年10月24日 优先权日:2014年10月24日
【发明者】周巍, 张岩, 张薇, 王赞, 章晶晶, 王爽, 刘 东, 李强 申请人:河北省食品检验研究院